Alla levande organismer har utvecklat sätt att skydda sig mot abiotiska och biotiska angrepp. Mikrober använder sig till exempel av system för begränsning/modifiering av DNA för att skydda sig mot främmande DNA. De har också system för att avgifta och/eller avlägsna xenobiotika eller överdrivna reaktiva syrearter (ROS). Flercelliga organismer använder andra system, och en eller flera nivåer av immunitet är ofta inblandade. Det bäst studerade och mest uppskattade hos ryggradsdjur med käkar är det förvärvade/adaptiva immunsystemet med sina välkända B- och T-celler och antigenspecifika antikroppar. Denna nivå av immunitet är överlagrad på det mycket mer grundläggande, evolutionärt gamla medfödda immunsystemet, som inte bara finns hos däggdjur utan även hos andra djur och växter. Det är först under de senaste decennierna som man har börjat uppskatta den medfödda immunitetens betydelse för flercelliga organismers överlevnad. Det skyddar människor, andra djur och växter från de tusentals potentiellt skadliga mikrober som man dagligen möter. Utvecklingen av den medfödda immuniteten hos flercelliga organismer krävde evolutionen av receptorer på cellytan som kunde känna igen/binda molekyler vars kemiska struktur/mönster i allmänhet bevaras inom olika klasser av främmande organismer men saknas i ”egna” molekyler. Dessa bevarade främmande (icke-själva) molekyler kallas Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMP), även kallade Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP), och deras närvaro upptäcks av medlemmar av en stor familj av mönsterigenkänningsreceptorer (PRR). PRRs aktiverar en eller flera signalvägar, ofta med hjälp av medreceptorer, för att framkalla försvarssvar i efterföljande led. Exempel på MAMP är bakteriell lipopolysackarid, flagellin, EF-Tu, DNA, lipoproteiner, peptidoglykaner och svampkitin. Flera utmärkta översikter om MAMPs finns tillgängliga.
Förutom biotiska angrepp måste organismer hantera en rad olika abiotiska angrepp, t.ex. mekaniska eller cellulära skador, samt miljöstress, t.ex. torka och salthalt. Vissa endogena molekyler aktiverar det medfödda immunförsvaret när de släpps ut i det extracellulära rummet (inklusive växternas apoplast) från sin normala plats på grund av skada (trauma); dessa molekyler kallas Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs ). DAMPs frigörs passivt från döende celler på grund av skada, trauma, ischemi eller infektionsinducerad nekros. Dessutom kan de aktivt utsöndras av vissa immunceller eller allvarligt stressade celler (t.ex. vissa cancerceller). MAMP kommer från mikroorganismer och aktiverar det medfödda immunförsvaret, medan DAMP kommer från värdceller och både initierar och vidmakthåller medfödda immunsvar. Det är allmänt accepterat att dessa försvar hjälper till att skydda den skadade vävnaden, som är sårbar för infektion på grund av att de fysiska barriärer som annars skulle hindra mikroorganismer från att tränga in i vävnaden bryts sönder. Hos däggdjur är inflammation en annan komponent i det medfödda immunförsvaret; den bidrar inte bara till att förebygga/undertrycka infektioner utan också till läkning.
Denna översikt kommer att fokusera på DAMPs, särskilt sådana från växter. DAMPs kommer att jämföras med MAMPs och med en nyligen identifierad klass av aktivatorer för det medfödda immunförsvaret som kallas Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMPs ) eftersom alla tre klasserna framkallar många av samma försvarssvar och delar vissa signaltransduktionskomponenter.
Djur DAMPs
Vi inleder vår diskussion med DAMPs från djur eftersom de först uppmärksammades och studerades mest utförligt. Termen DAMPs myntades av Seong och Matzinger 2004 . I tabell 1 förtecknas 26 DAMPs, inklusive puriner, pyrimidiner, DNA (ometylerat CpG), oxiderade lågdensitetslipoproteiner, N-formylpeptider och en rad olika proteiner. För de flesta av dem har receptorer identifierats (tabell 1). Dessutom bildar vissa DAMP komplex med partnermolekyler/interaktorer för att förstärka eller underlätta signalering. Bland dessa finns High Mobility Group Box 1 (HMGB1), som är en av de första identifierade och bäst karakteriserade DAMP:erna. HMGB1 är ett mycket vanligt kromatinassocierat protein som finns i alla djurceller . Det består av två grundläggande DNA-bindande domäner, benämnda HMG-boxar A och B, och en mycket sur C-terminal svans som deltar i specifika intramolekylära interaktioner . I kärnan binder HMGB1 till DNA:s mindre spår för att underlätta DNA-kondensering, nukleosombildning och bindning av transkriptionsfaktorer . När det släpps ut i den extracellulära miljön från nekrotiska, skadade eller allvarligt stressade celler fungerar det som en DAMP med kemoattraktiva och cytokininducerande aktiviteter .
Extracellulär HMGB1 medierar en rad biologiska reaktioner i samband med flera receptorer, såsom Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE), Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, TLR9, C-X-C kemokinreceptor typ 4 (CXCR4), Siglec-10 och T-Cell Immunoglobulin Mucin Receptor 3 (TIM3) . Särskilt viktigt är att specifik heterokomplexbildning mellan HMGB1 och en rad olika interaktorer, t.ex. adaptor MD-2 eller proinflammatoriska ligander lipopolysackarider och CpG-oligodeoxynukleotider, förbättrar eller underlättar signalering och i vissa fall är kritisk för HMGB1:s igenkänning av olika receptorer (tabell 1). Den specifika heterokomplexbildningen verkar åtminstone delvis regleras av HMGB1:s olika redoxtillstånd, som delvis beror på en reversibel intramolekylär disulfidbindning som bildas mellan cysteinresterna 23 och 45 . Nya studier visade att reducerat HMGB1 bildar en heterokomplex med CXCL12, som främjar rekryteringen av inflammatoriska celler till skadad vävnad genom igenkänning av CXCR4-receptorn . HMGB1 som innehåller disulfidbindningar binder specifikt MD-2, vilket underlättar igenkänning av TLR4, vilket leder till induktion av NF-κB-medierad transkriptionell aktivering av proinflammatoriska cytokiner . HMGB1 interagerar också med flera andra receptorer, däribland RAGE och TLR2; det är för närvarande oklart om specifika redoxtillstånd krävs för att HMGB1 ska kunna erkännas av dessa receptorer . HMGB1:s olika aktiviteter, partnermolekyler och receptorer förklarar sannolikt dess många olika roller i många vanliga, förödande sjukdomar hos människan.
Vi har nyligen upptäckt att HMGB1 binder salicylsyra (SA); detta undertrycker både reducerade HMGB1:s kemoattraktiva aktivitet och disulfidbindningsinnehållande HMGB1:s förmåga att inducera uttrycket av proinflammatoriska cytokingener och COX-2 . De SA-bindande platserna på HMGB1 identifierades i HMG-box-domänerna genom NMR-studier och bekräftades genom mutationsanalys. Ett HMGB1-protein som är muterat i en av de SA-bindande platserna bibehöll den kemoattraktiva aktiviteten, men förlorade bindningen till och inhiberingen av SA, vilket innebär att det är fast etablerat att SA-bindning till HMGB1 direkt undertrycker dess proinflammatoriska aktiviteter. Naturliga och syntetiska SA-derivat med mycket större potens för hämning av HMGB1 identifierades också, vilket ger bevis för att nya SA-baserade molekyler med hög effekt är möjliga att uppnå.
Plant DAMPs
I motsats till djur har många färre DAMPs hittills identifierats i växter (tabell 2). Den största och utan tvekan bäst karakteriserade klassen är polypeptider/peptider som produceras från större prekursorproteiner. Dessa inkluderar tre familjer som upptäcktes av Ryan och hans kollegor under deras studier för att identifiera systemin – en term ”som används för att beskriva polypeptidförsvarssignaler som produceras av växten som svar på fysisk skada och som inducerar försvarsgener, antingen lokalt eller systemiskt” . En polypeptid med 18 aminosyror (aa) isolerades från 60 lb tomatfröplantor och visade sig inducera syntesen av sårinducerbara proteinashämmande proteiner . Detta tomatsystemin genereras genom sårinducerad bearbetning av en 200 aa prohormon prosystemin, som finns i cytoplasman hos vaskulära floemparenkymaceller. Systemin inducerar de angränsande kamratcellerna och silelementen i kärlbunten att syntetisera jasmonsyra (JA), vilket i sin tur systemiskt aktiverar uttrycket av proteinashämmande gener .
Systemin finns i många andra Solanaceous-arter, inklusive potatis, peppar och nattskugga , men det finns inte i tobak. Detta resultat fick Ryans grupp att söka efter en annan typ av systemin. Till slut identifierades två hydroxiprolinrika polypeptider med 18 aa, som bearbetas från ett 165 aa preprotein men som inte har någon sekvenshomologi med tomatsystemin.
En tredje familj av peptidbaserade DAMPs upptäcktes i Arabidopsis . Dessa 23 aa växtelicitorpeptider (Peps) härstammar från en 92 aa prekursor. Två receptorer har identifierats för AtPepl, PEPR1 och PEPR2 . AtPeps framkallar en rad olika medfödda immunsvar och ökad resistens, och en form av prekursorn ProPep3 har nyligen visat sig frigöras i det extracellulära utrymmet vid infektion av Arabidopsis med hemi-biotrofa Pseudomonas syringae . En ortolog av majs (Zea mays), ZmPep1, identifierades senare och visade sig öka motståndskraften mot mikrobiella patogener, precis som AtPepl . För en mer ingående diskussion om endogena peptidelicitorer, se Yamaguchi och Huffaker .
En annan klass av DAMPs som finns i växter, liksom i djur, härrör från den extracellulära matrisen. Hos ryggradsdjur framkallar fragment av hyaluronan, en enkel linjär polysackarid som består av upprepad D-glukuronsyra och D-N-acetylglukosamin, medfödd immunitet när de frigörs genom mekanisk skada eller hydrolytiska enzymer . Dessa fragment uppfattas av de leucinrika upprepade TLR2- och TLR4-receptorer som innehåller leucinrika upprepningar . På samma sätt innehåller växter den pectiska polysackariden homogalacturonan, en linjär polymer av 1,4-bunden α-D-galacturonsyra, som bidrar till att upprätthålla cellväggens integritet. Fragment av denna polymer, som kallas oligogalacturonider (OGs), kan frigöras mekaniskt eller vanligare av patogenkodade hydrolytiska enzymer. OGs inducerar medfödda immunsvar, inklusive MAPK-aktivering, kallosedeposition, ROS-produktion, förhöjt cytosoliskt Ca2+ och aktivering av försvarsgener . Det väggassocierade kinaset 1 (WAK1) har identifierats som en trolig receptor för OGs.
Extracellulär ATP (eATP) utgör ännu en klass av växt DAMPs som finns i både växter och djur. Trots decennier av ökande bevis för att eATP fungerar som en signalmolekyl har denna funktion till stor del diskonterats/diskrediterats, förmodligen på grund av ATP:s allestädes närvarande natur och centrala roll som den universella energivärdet i alla levande organismer från bakterier till människor . Först i och med identifieringen av dess plasmamembranlokaliserade receptorer, först hos djur (se ) och sedan hos växter , accepterades dess signalfunktion i båda rikena. Hos djur fungerar eATP som en neurotransmittor och signalmolekyl som deltar i muskelkontraktion, celldöd och inflammation . Två typer av receptorer är inblandade: en G-proteinkopplad P2Y-receptor och en ligandstyrd jonkanal P2X-receptor. I växter har eATP:s signalfunktion nyligen bekräftats genom identifieringen av dess receptor, Does not Respond to Nucleotides 1 (DORN1 ). Att eATP betecknas som en växt DAMP grundar sig på de kombinerade observationerna att i) dorn1-mutanten uppvisar ett undertryckt transkriptionellt svar inte bara på ATP utan också på sår, ii) de flesta av de gener som induceras av eATP är också sårinducerbara , och iii) eATP-behandling inducerar typiska medfödda immunsvar, inklusive cytosoliskt Ca2+-inflöde, MAPK-aktivering och induktion av täthetssammansatta gener, inklusive vissa som är involverade i biosyntesen av JA och etylen . Det är dock ännu inte känt om det bidrar till resistens mot patogener.
Vi har nyligen identifierat en fjärde klass av växt DAMPs, Arabidopsis HMGB-protein AtHMGB3 . Alla eukaryota celler, inklusive växter, har HMGB1-relaterade proteiner. I Arabidopsis kodar 15 gener för HMG-boxdomäninnehållande proteiner. De har delats in i fyra grupper: (i) proteiner av HMGB-typ, (ii) A/T-rich interaction domain (ARID)-HMG-proteiner, (iii) 3xHMG-proteiner som innehåller tre HMG-boxar och (iv) det strukturspecifika igenkänningsproteinet 1 (SSRP1) . Baserat på deras nukleära placering och domänstruktur antas de åtta proteinerna av HMGB-typ (HMGB1/2/3/4/5/5/6/12/14) fungera som arkitektoniska kromosomala proteiner, i likhet med HMGB1 från däggdjur. AtHMGB2/3/4 finns särskilt i cytoplasman och även i kärnan. Dessa proteiners cytoplasmatiska funktion är inte känd. De cytoplasmatiska subpopulationerna bör dock ha större tillgång till det extracellulära utrymmet (apoplasten) efter cellskador jämfört med de AtHMGB:er som uteslutande finns i kärnan , eftersom de inte är bundna till DNA och bara behöver korsa plasmamembranet för att komma in i apoplasten. Med tanke på däggdjurs HMGB1:s väletablerade roll som prototypisk DAMP gav närvaron av en cytoplasmatisk subpopulation av AtHMGB3 upphov till möjligheten att detta protein har en liknande funktion. När rekombinant AtHMGB3 infiltrerades i Arabidopsis blad uppvisade det faktiskt DAMP-liknande aktiviteter som liknar dem som AtPep1 uppvisar. Behandling med ettdera proteinet inducerade MAPK-aktivering, kallosedeposition, försvarsrelaterat genuttryck och ökad motståndskraft mot nekrotrofa Botrytis cinerea .
I motsats till HMGB1 från däggdjur, som kan utsöndras aktivt efter posttranslationell modifiering, finns det inga belägg för utsöndring av AtHMGB3. Den kommer troligen passivt in i det extracellulära rummet när celler skadas mekaniskt, t.ex. av insekter, eller vid infektion av nekrotrofa patogener. B. cinerea-infektion orsakade faktiskt frisättning av AtHMGB3 i apoplasten inom 24 timmar efter inokulering. En sådan snabb frisättning under den tidiga fasen av cellulär nekros som induceras av nekrotrofa organismer skulle kunna öka motståndskraften genom att aktivera immunsvar .
Den kompletterande analysen avslöjade att AtHMGB3, liksom HMGB1, binder SA, och att denna interaktion, som medieras av bevarade Arg- och Lysrester i AtHMGB3:s enda HMG-box, hämmar dess DAMP-aktivitet . Detta resultat tycks stå i strid med SA:s välkända roll som en positiv regulator av immunsvar . Medan SA-inducerade försvarsreaktioner är kritiska för resistens mot biotrofa och hemi-biotrofa patogener är emellertid JA det viktigaste hormonet som ansvarar för att aktivera försvaret mot nekrotrofa patogener och insekter . Signalvägarna för JA- och SA-försvaret är i allmänhet ömsesidigt antagonistiska . SA-medierad hämning av AtHMGB3:s DAMP-aktivitet kan därför utgöra en mekanism genom vilken dessa vägar samverkar. I detta scenario skulle cellskador orsakade av infektion med nekrotrofa patogener leda till att AtHMGB3 frigörs i de extracellulära utrymmena, vilket skulle aktivera JA/etylen-associerat försvar för att hjälpa till att neutralisera detta hot. Däremot inducerar infektion med biotrofa patogener SA-biosyntesen . Ökade SA-nivåer skulle då kunna motverka aktiveringen av JA-associerade försvar genom att undertrycka AtHMGB3:s DAMP-aktivitet, samt främja aktiveringen av SA-associerade försvar som är effektivare mot denna typ av patogen .
Upptäckten att extracellulärt AtHMGB3 är ett växt-DAMP vars immunsvar-inducerande aktivitet hämmas av SA-bindning ger ett bevis över nationsgränserna för att HMGB-proteiner fungerar extracellulärt som DAMP i både växter och djur. Dessutom belyser det förekomsten av gemensamma mål och delade verkningsmekanismer för SA i växter och människor. Intressant nog har majoriteten av de växt DAMPs som hittills har identifierats motsvarigheter hos djur. Våra studier har dessutom visat att växter och djur har gemensamma måltavlor för SA utöver HMGBs . Till exempel binder det glykolytiska enzymet glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) i både växter och människor SA och har därför förändrad aktivitet. SA undertrycker GAPDH:s roll i replikationen av Tomato Bushy Stunt Virus i växter och kan ha liknande effekter på replikationen av hepatit C-virus hos människor . Det undertrycker också GAPDH-medierad neuronal celldöd hos djur . Preliminära analyser av höggenomströmningsanalyser tyder på att det finns många fler måltavlor för SA i både växter och människor. Kanske har förekomsten av flera SA-mål hos djur utvecklats som svar på antingen intag av låga nivåer av SA som finns naturligt i växtmaterial eller endogen syntes av SA från bensoater . Framtida studier kommer att krävas för att bedöma om dessa nya proteiner som interagerar med SA hos växter och djur fungerar som DAMPs.
NAMPs
Nematoder, som är ett av de mest förekommande djuren i naturen, parasiterar både växter och djur. Flera studier tyder på att växter kan uppfatta infektion av nematoder , men identiteten på den uppfattade signalen från nematoderna var okänd. Vi har nyligen identifierat en grupp försvarssignalmolekyler från flera släkten av växtparasiterande nematoder, inklusive både rotknott- och cystnematoder . De utgör en evolutionärt bevarad familj av nematodferomoner som kallas ascarosider. Ascr#18, den vanligaste ascarosiden hos växtparasitära nematoder, inducerar utmärkande medfödda immunsvar, inklusive aktivering av i) MAPK, ii) försvarsgener och iii) SA- och JA-försvarssignalvägarna, samt ökad resistens mot virus-, bakterie-, svamp- och oomycetpatogener och rotknotnematoder hos flera dikotyla- och monokotyla växtarter.
MAMPs, DAMPs och NAMPs
Och även om källorna till de inducerande signalerna är mycket olika, där MAMPs härrör från mikrober, NAMPs härrör från nematoder och DAMPs är avvikande lokaliserade endogena molekyler, Studier av Arabidopsis tyder på att de flesta medlemmar av dessa tre klasser av immuninducerande molekyler aktiverar signalering av det medfödda immunförsvaret via vägar som delar samma leukinrika upprepade receptorliknande kinaser BRI1-Associated Kinase1 (BAK1) och BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, för NAMP opublicerat resultat M. Manohar, F.C. Schroeder och D.F. Klessig). Dessutom inducerar dessa molekyler många av samma medfödda immunförsvarssvar, inklusive ett inflöde av Ca+2 till cytosolen, kallosedeposition, aktivering av de försvarsassocierade MAPK:erna MPK3 och MPK6, produktion av ROS och ökat uttryck av många försvarsrelaterade gener (tabell 3). Växtreceptorer har identifierats för flera MAMP, t.ex. FLS2 för flagellin/flg22 och EFR för EF-Tu/elf18 . Receptorer för de flesta växt DAMPs har också upptäckts, inklusive Arabidopsis PEPR1/2 för Peps , Arabidopsis WAK1 för OGs och Arabidopsis DORN1 för eATP . SR160 från tomat rapporterades ursprungligen som receptor för systemin, men två nyligen genomförda studier visar att det inte är så. Växtreceptorerna för AtHMGB3 och ascarosiden NAMP ascr#18 är fortfarande okända (tabell 2). Man vet inte heller om AtHMGB3:s DAMP-signalering förstärks eller underlättas av interagerande molekyler, vilket har visats för HMGB1 från däggdjur.
.