Wszystkie żywe organizmy wykształciły sposoby ochrony przed atakami abiotycznymi i biotycznymi. Na przykład, mikroby wykorzystują systemy restrykcji/modyfikacji DNA do ochrony przed obcym DNA; zawierają one również systemy do detoksykacji i/lub wydalania ksenobiotyków lub nadmiernych reaktywnych form tlenu (ROS). Organizmy wielokomórkowe korzystają z innych systemów, a udział jednego lub więcej poziomów odporności jest często zaangażowany. Najlepiej zbadany i najbardziej doceniany u kręgowców szczękowych jest nabyty/adaptacyjny układ odpornościowy z dobrze znanymi limfocytami B i T oraz przeciwciałami swoistymi dla antygenów. Ten poziom odporności nakłada się na znacznie bardziej podstawowy, ewolucyjnie pradawny wrodzony układ odpornościowy, który jest obecny nie tylko u ssaków, ale także u innych zwierząt i roślin. Dopiero w ostatnich kilkudziesięciu latach zaczęto doceniać znaczenie wrodzonej odporności dla przetrwania organizmów wielokomórkowych. Chroni ona ludzi, inne zwierzęta i rośliny przed tysiącami potencjalnie szkodliwych mikrobów, z którymi stykają się codziennie. Rozwój wrodzonej odporności u organizmów wielokomórkowych wymagał ewolucji receptorów na powierzchni komórek, które mogłyby rozpoznawać/wiązywać cząsteczki, których struktura chemiczna/wzór jest generalnie zachowana w różnych klasach obcych organizmów, ale jest nieobecna w cząsteczkach „własnych”. Te konserwowane obce (niesamoistne) cząsteczki są określane jako Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs), zwane również Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), a ich obecność jest wykrywana przez członków dużej rodziny receptorów rozpoznawania wzorców (PRRs). PRR aktywują jeden lub więcej szlaków sygnałowych, często przy udziale współreceptorów, w celu wywołania reakcji obronnych. Przykładami MAMP są: lipopolisacharyd bakteryjny, flagellina, EF-Tu, DNA, lipoproteiny, peptydoglikany i chityna grzybów. Kilka doskonałych przeglądów MAMPs są dostępne .
Oprócz ataków biotycznych, organizmy muszą radzić sobie z różnymi atakami abiotycznymi, takimi jak uszkodzenia mechaniczne lub komórkowe, a także stresy środowiskowe, takie jak susza i zasolenie. Niektóre endogenne cząsteczki aktywują wrodzony układ odpornościowy, gdy są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (w tym apoplastu roślinnego) z ich normalnej lokalizacji z powodu uszkodzenia (urazu); cząsteczki te są określane jako Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs ). DAMPs są pasywnie uwalniane z umierających komórek w wyniku uszkodzenia, urazu, niedokrwienia lub nekrozy wywołanej infekcją. Ponadto, mogą być aktywnie wydzielane przez niektóre komórki układu odpornościowego lub komórki poddane silnemu stresowi (np. niektóre komórki nowotworowe). Podczas gdy MAMP pochodzą od mikroorganizmów i aktywują wrodzony układ odpornościowy, DAMP pochodzą od komórek gospodarza i zarówno inicjują, jak i utrwalają wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Ogólnie przyjmuje się, że te mechanizmy obronne pomagają chronić uszkodzoną tkankę, która jest podatna na infekcje z powodu przerwania fizycznych barier, które w przeciwnym razie uniemożliwiłyby wniknięcie drobnoustrojów. U ssaków, zapalenie jest kolejnym składnikiem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej; nie tylko pomaga zapobiegać/tłumić infekcje, ale także pomaga w gojeniu.
W tym przeglądzie skupimy się na DAMP, szczególnie tych roślinnych. DAMP zostaną porównane do MAMP oraz do nowo zidentyfikowanej klasy aktywatorów odporności wrodzonej określanych jako Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMPs), ponieważ wszystkie trzy klasy indukują wiele z tych samych reakcji obronnych i dzielą pewne komponenty transdukcji sygnału.
Zwierzęce DAMPs
Rozpoczynamy naszą dyskusję od zwierzęcych DAMPs, ponieważ zostały one po raz pierwszy rozpoznane i najszerzej zbadane. Termin DAMPs został utworzony przez Seong i Matzinger w 2004 roku. Tabela 1 wymienia 26 DAMP, w tym puryny, pirymidyny, DNA (niemetylowane CpG), utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości, N-formylowe peptydy i różne białka. Dla większości z nich zidentyfikowano receptory kognitywne (Tabela 1). Ponadto, niektóre DAMP tworzą kompleksy z cząsteczkami partnerskimi/interaktorami w celu wzmocnienia lub ułatwienia sygnalizacji. Wśród nich znajduje się High Mobility Group Box 1 (HMGB1), który jest jednym z pierwszych zidentyfikowanych i najlepiej scharakteryzowanych DAMP. HMGB1 jest wysoce obfitym białkiem związanym z chromatyną, obecnym we wszystkich komórkach zwierzęcych. Składa się z dwóch podstawowych domen wiążących DNA, oznaczonych jako HMG box A i B, oraz wysoce kwaśnego C-końcowego ogona, który uczestniczy w specyficznych interakcjach wewnątrzcząsteczkowych. W jądrze komórkowym HMGB1 wiąże się z drobnym rowkiem DNA w celu ułatwienia kondensacji DNA, tworzenia nukleosomów i wiązania czynników transkrypcyjnych. Kiedy jest uwalniany do środowiska zewnątrzkomórkowego z komórek martwiczych, uszkodzonych lub silnie zestresowanych, funkcjonuje jako DAMP o działaniu chemoatrakcyjnym i indukującym cytokiny.
Extracellular HMGB1 pośredniczy w szeregu odpowiedzi biologicznych w asocjacji z wieloma receptorami, takimi jak receptor dla produktów końcowych zaawansowanej glikacji (RAGE), receptor Toll-podobny 2 (TLR2), TLR4, TLR9, receptor chemokiny C-X-C typu 4 (CXCR4), Siglec-10 i receptor mucyny immunoglobuliny komórek T (TIM3). Warto zauważyć, że specyficzne tworzenie heterokompleksów pomiędzy HMGB1 i różnymi interaktorami, takimi jak adaptor MD-2 lub ligandami prozapalnymi lipopolisacharydami i oligodeoksynukleutydami CpG, wzmacnia lub ułatwia sygnalizację, a w niektórych przypadkach jest krytyczne dla rozpoznawania HMGB1 przez różne receptory (Tabela 1). Tworzenie specyficznych heterokompleksów wydaje się być przynajmniej częściowo regulowane przez różne stany redoks HMGB1, które częściowo zależą od odwracalnego wewnątrzcząsteczkowego wiązania disulfidowego tworzonego między resztami cysteinowymi 23 i 45. Ostatnie badania wykazały, że zredukowana HMGB1 tworzy heterokompleks z CXCL12, który promuje rekrutację komórek zapalnych do uszkodzonej tkanki poprzez rozpoznawanie przez receptor CXCR4 . Zawierająca wiązania disiarczkowe HMGB1 wiąże się specyficznie z MD-2, co ułatwia rozpoznanie przez TLR4, prowadząc do indukcji transkrypcyjnej aktywacji cytokin prozapalnych za pośrednictwem NF-κB. HMGB1 oddziałuje również z kilkoma innymi receptorami, w tym RAGE i TLR2; obecnie nie jest jasne, czy do rozpoznania przez te receptory wymagane są określone stany redoks. Różnorodne działania HMGB1, cząsteczki partnerskie i receptory prawdopodobnie odpowiadają za jej liczne role w wielu powszechnych, wyniszczających chorobach człowieka.
Ostatnio odkryliśmy, że HMGB1 wiąże się z kwasem salicylowym (SA); hamuje to zarówno zredukowaną aktywność chemoatrakcyjną HMGB1, jak i zdolność HMGB1 zawierającej wiązania disiarczkowe do indukowania ekspresji genów cytokin prozapalnych i COX-2. Miejsca wiążące SA w HMGB1 zostały zidentyfikowane w domenach HMG-box za pomocą badań NMR i potwierdzone analizą mutacyjną. Białko HMGB1 zmutowane w jednym z miejsc wiążących SA zachowało aktywność chemoatrakcyjną, ale utraciło wiązanie i inhibicję przez SA, co pozwoliło ustalić, że SA wiążąc się z HMGB1 bezpośrednio tłumi jego aktywność prozapalną. Zidentyfikowano również naturalne i syntetyczne pochodne SA o znacznie większej sile hamowania HMGB1, dostarczając tym samym dowodu, że nowe cząsteczki oparte na SA o wysokiej skuteczności są osiągalne.
Roślinne DAMP
W przeciwieństwie do zwierząt, znacznie mniej DAMP zostało dotychczas zidentyfikowanych u roślin (Tabela 2). Największą i prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowaną klasą są polipeptydy/peptydy produkowane z większych białek prekursorowych. Należą do nich trzy rodziny odkryte przez Ryana i jego współpracowników podczas badań nad identyfikacją systeminy – terminu „używanego do opisania polipeptydowych sygnałów obronnych, które są produkowane przez roślinę w odpowiedzi na uszkodzenia fizyczne i które indukują geny obronne, zarówno lokalnie, jak i systemowo”. Wyizolowano 18 aminokwasowy (aa) polipeptyd z 60 lb sadzonek pomidora i wykazano, że indukuje on syntezę białek inhibitora proteazy indukowanego raną. Systemina pomidora powstaje w wyniku indukowanego raną przetwarzania 200 aa prohormonu prosysteminy, który znajduje się w cytoplazmie komórek miąższu łyka naczyniowego. Systemina pobudza sąsiednie komórki towarzyszące i elementy sitowe wiązki naczyniowej do syntezy kwasu jasmonowego (JA), który z kolei systemowo aktywuje ekspresję genów inhibitorów proteazy .
Choć systemina jest obecna w wielu innych gatunkach psiankowatych, w tym w ziemniaku, papryce i psiance słodkiej, nie występuje w tytoniu. To odkrycie skłoniło grupę Ryana do poszukiwania innego rodzaju systeminy. Ostatecznie zidentyfikowano dwa bogate w hydroksyproliny polipeptydy o masie 18 aa, które są przetwarzane z preproteiny o masie 165 aa, ale nie wykazują homologii sekwencji z systeminą pomidora. Trzecia rodzina peptydowych DAMP została odkryta w Arabidopsis. Te 23 aa peptydy elicytorów roślinnych (Peps) pochodzą z 92 aa prekursora. Zidentyfikowano dwa receptory dla AtPepl, PEPR1 i PEPR2 . AtPepy wywołują różne wrodzone reakcje immunologiczne i zwiększają odporność, a ostatnio wykazano, że forma prekursora ProPep3 jest uwalniana do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po zakażeniu Arabidopsis hemi-biotroficznym Pseudomonas syringae. Ortolog kukurydzy (Zea mays), ZmPep1, został następnie zidentyfikowany i wykazano, że podobnie jak AtPepl, zwiększa odporność na patogeny mikrobiologiczne. Bardziej dogłębna dyskusja na temat endogennych elicitorów peptydowych, patrz Yamaguchi i Huffaker .
Inna klasa DAMP występujących u roślin, jak również u zwierząt, pochodzi z macierzy zewnątrzkomórkowej. U kręgowców fragmenty hialuronianu, prostego liniowego polisacharydu składającego się z powtarzających się kwasów D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozaminy, wywołują odporność wrodzoną, gdy są uwalniane przez uszkodzenia mechaniczne lub enzymy hydrolityczne. Fragmenty te są odbierane przez receptory TLR2 i TLR4 zawierające powtórzenia bogate w leucynę. Podobnie, rośliny zawierają pektynowy polisacharyd homogalakturonian, liniowy polimer 1,4 połączonego kwasu α-D galakturonowego, który pomaga utrzymać integralność ściany komórkowej. Fragmenty tego polimeru, zwane oligogalakturonianami (OGs), mogą być uwalniane mechanicznie lub, co bardziej powszechne, przez enzymy hydrolityczne zakodowane przez patogeny. OGs indukują wrodzone odpowiedzi immunologiczne, w tym aktywację MAPK, odkładanie kalozy, produkcję ROS, podwyższony poziom cytozolowego Ca2+ i aktywację genów obronnych. Kinaza 1 związana ze ścianą (WAK1) została zidentyfikowana jako prawdopodobny receptor dla OGs .
Extracellular ATP (eATP) obejmuje jeszcze jedną klasę roślinnych DAMP występujących zarówno u roślin jak i zwierząt. Pomimo dziesięcioleci rosnących dowodów, że eATP działa jako cząsteczka sygnalizacyjna, funkcja ta była w dużej mierze dyskontowana/dyskredytowana, prawdopodobnie z powodu wszechobecności ATP i centralnej roli jako uniwersalnej waluty energetycznej we wszystkich żywych organizmach od bakterii do ludzi. Dopiero po zidentyfikowaniu receptorów zlokalizowanych w błonie plazmatycznej, najpierw u zwierząt (patrz ), a następnie u roślin, jego funkcja sygnalizacyjna została zaakceptowana w obu królestwach. U zwierząt eATP działa jako neuroprzekaźnik i cząsteczka sygnalizacyjna, która bierze udział w skurczu mięśni, śmierci komórek i zapaleniu. Zaangażowane są w to dwa typy receptorów: sprzężony z białkiem G receptor P2Y oraz receptor P2X z kanałem jonowym bramkowanym przez ligand. U roślin rola sygnalizacyjna eATP została niedawno potwierdzona poprzez identyfikację jego receptora, Does not Respond to Nucleotides 1 (DORN1 ). Określenie eATP jako roślinnego DAMP opiera się na połączonych obserwacjach, że i) mutant dorn1 wykazuje stłumioną odpowiedź transkrypcyjną nie tylko na ATP, ale również na zranienie, ii) większość genów indukowanych przez aplikację eATP jest również indukowalna przez zranienie, oraz iii) traktowanie eATP indukuje typowe wrodzone odpowiedzi immunologiczne, w tym cytozolowy napływ Ca2+, aktywację MAPK i indukcję genów związanych z gęstością, w tym niektórych zaangażowanych w biosyntezę JA i etylenu. Jednak nie wiadomo jeszcze, czy przyczynia się do odporności na patogeny.
Ostatnio zidentyfikowaliśmy czwartą klasę roślinnych DAMP, białko Arabidopsis HMGB AtHMGB3 . Wszystkie komórki eukariotyczne, w tym rośliny, posiadają białka związane z HMGB1. W Arabidopsis 15 genów koduje białka zawierające domenę HMG-box. Zostały one podzielone na cztery grupy: (i) białka typu HMGB, (ii) białka A/T-rich interaction domain (ARID)-HMG, (iii) białka 3xHMG, które zawierają trzy domeny HMG, oraz (iv) białko rozpoznawania specyficznej struktury 1 (SSRP1) . Na podstawie ich jądrowej lokalizacji i struktury domenowej, osiem białek typu HMGB (HMGB1/2/3/4/5/6/12/14) jest uważanych za białka architektoniczne chromosomów, podobne do HMGB1 ssaków. Co ważne, AtHMGB2/3/4 są obecne zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze. Cytoplazmatyczna funkcja tych białek nie jest znana. Jednakże subpopulacje cytoplazmatyczne powinny mieć większy dostęp do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (apoplastu) po uszkodzeniu komórki w porównaniu z AtHMGB zlokalizowanymi wyłącznie w jądrze, ponieważ nie są one związane z DNA i muszą jedynie przekroczyć błonę plazmatyczną, aby dostać się do apoplastu. Biorąc pod uwagę dobrze ugruntowaną rolę HMGB1 ssaków jako prototypowego DAMP, obecność cytoplazmatycznej subpopulacji AtHMGB3 wzbudziła możliwość, że białko to pełni podobną funkcję. Rzeczywiście, kiedy rekombinowana AtHMGB3 została wprowadzona do liści Arabidopsis, wykazywała aktywność DAMP podobną do tej, jaką wykazuje AtPep1. Traktowanie obu białek indukowało aktywację MAPK, odkładanie kalozy, ekspresję genów związanych z obroną i zwiększoną odporność na nekrotrofy Botrytis cinerea. W przeciwieństwie do HMGB1 ssaków, która może być aktywnie wydzielana po modyfikacji potranslacyjnej, nie ma dowodów na wydzielanie AtHMGB3. Prawdopodobnie przedostaje się on do przestrzeni pozakomórkowej w sposób pasywny, gdy komórki są uszkodzone mechanicznie, np. przez owady, lub podczas infekcji przez patogeny nekrotroficzne. Rzeczywiście infekcja B. cinerea spowodowała uwolnienie AtHMGB3 do apoplastu w ciągu 24 h po inokulacji. Takie szybkie uwalnianie podczas wczesnej fazy nekrozy komórek indukowanej przez nekrotrofy mogłoby wzmocnić odporność poprzez aktywację odpowiedzi immunologicznej .
Dodatkowe analizy ujawniły, że AtHMGB3, podobnie jak HMGB1, wiąże SA, i że ta interakcja, w której pośredniczą konserwowane reszty Arg i Lys w pojedynczym polu HMG AtHMGB3, hamuje jego aktywność DAMP . Odkrycie to wydaje się być sprzeczne z dobrze znaną rolą SA jako pozytywnego regulatora odpowiedzi immunologicznej. Jednakże, podczas gdy indukowane przez SA reakcje obronne są krytyczne dla odporności na biotroficzne i hemi-biotroficzne patogeny, głównym hormonem odpowiedzialnym za aktywację obrony przed nekrotroficznymi patogenami i owadami jest JA. Ścieżki sygnalizacji obronnej JA i SA są na ogół wzajemnie antagonistyczne. Hamowanie aktywności DAMP AtHMGB3 przez SA może zatem stanowić jeden z mechanizmów, poprzez który te szlaki wzajemnie się przenikają. W tym scenariuszu uszkodzenie komórek spowodowane infekcj± patogenów nekrotroficznych prowadziłoby do uwolnienia AtHMGB3 do przestrzeni zewn±trzkomórkowej, co aktywowałoby mechanizmy obronne zwi±zane z JA/etylenem, które pomogłyby zneutralizować to zagrożenie. Z kolei infekcja przez patogeny biotroficzne indukuje biosyntezę SA . Zwiększony poziom SA mógłby wtedy antagonizować aktywację obrony związanej z JA poprzez tłumienie aktywności DAMP AtHMGB3, jak również promować aktywację obrony związanej z SA, która jest bardziej skuteczna przeciwko temu rodzajowi patogenu.
Odkrycie, że zewnątrzkomórkowa AtHMGB3 jest roślinnym DAMP, którego aktywność indukująca odpowiedź immunologiczną jest hamowana przez wiązanie SA, dostarcza dowodów na to, że białka HMGB funkcjonują zewnątrzkomórkowo jako DAMP zarówno u roślin, jak i zwierząt. Co więcej, podkreśla to istnienie wspólnych celów i mechanizmów działania SA u roślin i ludzi. Co ciekawe, większość zidentyfikowanych do tej pory roślinnych DAMP ma swoje odpowiedniki u zwierząt. Nasze badania wykazały, że rośliny i zwierzęta mają wspólne cele dla SA poza HMGBs. Na przykład, enzym glikolityczny dehydrogenaza gliceraldehydu 3-fosforanowego (GAPDH) zarówno w roślinach jak i u ludzi wiąże się z SA i w rezultacie ma zmienioną aktywność. SA tłumi rolę GAPDH w replikacji Tomato Bushy Stunt Virus w roślinach i może mieć podobny wpływ na replikację wirusa zapalenia wątroby typu C u ludzi. Hamuje również śmierć komórek neuronalnych wywołaną przez GAPDH u zwierząt. Wstępne analizy ekranów o wysokiej przepustowości sugerują istnienie wielu innych celów SA zarówno u roślin, jak i u ludzi. Być może obecność wielu celów SA u zwierząt ewoluowała w odpowiedzi na spożycie niskich poziomów SA, które są naturalnie obecne w materiale roślinnym, lub endogenną syntezę SA z benzoesanów. Przyszłe badania będą wymagane, aby ocenić, czy te nowe roślinne i zwierzęce białka oddziałujące z SA funkcjonują jako DAMP.
NAMPs
Nicienie, jedne z najliczniejszych zwierząt w przyrodzie, pasożytują zarówno na roślinach jak i zwierzętach. Kilka badań wskazywało, że rośliny mogą postrzegać infekcję przez nicienie, ale tożsamość postrzeganego sygnału pochodzącego od nicieni nie była znana. Niedawno zidentyfikowali¶my grupę obronnych cz±steczek sygnałowych z kilku rodzajów nicieni pasożytuj±cych na ro¶linach, wł±czaj±c w to zarówno nicienie korzeniowe, jak i cystowe. Należ± one do ewolucyjnie konserwowanej rodziny feromonów nicieni zwanych askaryozydami. Ascr#18, najobficiej występujący askarozyd u nicieni pasożytujących na roślinach, wywołuje charakterystyczne wrodzone reakcje immunologiczne, w tym aktywację i) MAPK, ii) genów obronnych oraz iii) szlaków sygnalizacji obronnej SA i JA, a także zwiększoną odporność na patogeny wirusowe, bakteryjne, grzybicze i oomycete oraz nicienie korzeniowe u kilku gatunków roślin dwu- i jednoliściennych.
MAMPs, DAMPs, and NAMPs
Although the sources of the inducing signals are very different, with MAMPs derived from microbes, NAMPs derived from nematodes, and DAMPs being aberrantly-located endogenous molecules, Badania Arabidopsis sugerują, że większość członków tych trzech klas cząsteczek indukujących odporność aktywuje wrodzoną sygnalizację immunologiczną poprzez szlaki, które dzielą te same bogate w powtórzenia leucynowe receptorowe kinazy BRI1-Associated Kinase1 (BAK1) i BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, dla NAMP niepublikowane wyniki M. Manohar, F.C. Schroeder, and D.F. Klessig). Ponadto, cząsteczki te indukują wiele z tych samych reakcji obronnych odporności wrodzonej, włączając w to napływ Ca+2 do cytozolu, odkładanie kalozy, aktywację związanych z obroną MAPK MPK3 i MPK6, produkcję ROS i zwiększoną ekspresję wielu genów związanych z obroną (Tabela 3). Zidentyfikowano receptory roślinne dla kilku MAMP, takie jak FLS2 dla flageliny/flg22 i EFR dla EF-Tu/elf18 . Odkryto również receptory dla większości roślinnych DAMP, w tym Arabidopsis PEPR1/2 dla Peps, Arabidopsis WAK1 dla OGs i Arabidopsis DORN1 dla eATP. Chociaż początkowo podawano, że pomidor SR160 jest receptorem dla systeminy, dwa ostatnie badania dowodzą, że tak nie jest. Roślinne receptory dla AtHMGB3 i askarozydowego NAMP ascr#18 pozostają nieznane (Tabela 2). Nie wiadomo też, czy sygnalizacja DAMP przez AtHMGB3 jest wzmocniona lub ułatwiona przez współdziałające cząsteczki, jak to wykazano w przypadku HMGB1 u ssaków.