Materialer
4′-Hydroxyazobenzene-2-carboxylsyre (HABA), biotin, N-(2-aminoethyl)maleimid trifluoroacetat-salt (amino-maleimid), eddikesyre, natriumacetat, fosforsyre, magnesiumchlorid, Tween 20, Tween 80, bovin serumalbumin (BSA), dimethylsulfoxid (DMSO), dextran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; lyofiliseret før brug), 4-nitrophenylchloroformiat (PNC; sublimeret før brug), LiCl (tørret ved 110 °C før brug), tyramin (TA), vandfri pyridin, vandfri N,N-dimethylformamid (DMF), N,N-diisopropylethylamin (DIPEA), piperidin, aminosyrer, eddikesyreanhydrid, triisopropylsilan, trifluoroeddikesyre (TFA), natriumhydroxid (NaOH), N-Boc-1,4-butandiamin (NH2-Boc), natriumbicarbonat (NaHCO3), biotin-atto565, biotin-4-fluorescein (biotin-FITC), 6-aminofluorescein, peberrodsperoxidase (HRP, type VI), biotin-HRP, hydrogenperoxid (H2O2); med inhibitor), føtal bovin serum (FBS), calcein AM, ethidium homodimer-1 (EthD-1), Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT) og alle andre opløsningsmidler, medmindre andet er angivet, blev købt hos Sigma-Aldrich. Den knogleformede master blev købt hos LEGO. Polydimethylsiloxan (PDMS; Sylgard 184) blev købt fra Dow Corning. Phosphatbufferet saltvand (PBS) blev købt fra Lonza. Rekombinant humant BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) og H2SO4 blev købt fra R&D Systems. Fmoc-Rink 4-methylbenzhydrylamin (MBHA)-harpiks (50 mg skala, substitution 0,52 mmol g-1) og N,N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorophosphat (HBTU) blev købt fra MultiSynTech. Chloroform og 1-methyl-2-pyrrolidinon (NMP) blev købt hos WR Chemicals. VHHH-antistof mod BMP7 (Q32c-lab, klon G7) og polyklonalt kaninantistof mod VHH (K1216) blev købt fra QVQ. Biotinyleret IL-1β-antistof (508301, klon JK1B2, RRID:AB_315512) blev købt fra Biolegend. Biotinyleret IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) blev købt fra Jackson Immunoresearch. HRP-konjugeret sekundært gedeantistof mod kanin (P0448) blev købt fra Dako. Biotinylerede guldnanopartikler (20 nm) blev købt fra Cytodiagnostics. Det biotinylerede peptid med aminosyresekvensen KGLPLGGNSH blev købt fra Pepscan. Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoat (biotin-LC-NHS) blev købt fra ApexBio. Neutravidin, N-hydroxysuccinimid-desthiobiotin (EZ-Link NHS-desthiobiotin), 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og 3,3′-diaminobenzidin (DAB)-farvningssæt blev købt fra ThermoFisher Scientific. Præ-aktiverede sensorer til aminkobling (G-type easy2spot) blev købt fra Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penicillin og streptomycin samt trypsin-EDTA blev købt fra Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), luciferaseassayreagens (E1483) og QuantiFluor dsDNA System blev købt fra Promega. C2C12-BRE-Luc-celler blev venligst stillet til rådighed af prof. Daniel B. Rifkin.
Neutravidin multivalensanalyse
Spektrofotometrisk analyse af HABA blev anvendt til at analysere antallet af biotinbindende lommer af neutravidin. HABA kan specifikt binde sig til (neutr)avidin på samme måde som biotin, men med lavere bindingsaffinitet. HABA/neutravidinkomplekset har et absorptionstop omkring 500 nm. Ubundet HABA har et absorptionstop omkring 350 nm. HABA’s fortrængning af biotin kan således vurderes ved at måle absorbansen ved 350 og 500 nm. For at bestemme neutravidins antal biotinbindende lommer blev det først inkuberet med et overskud af HABA, således at der blev dannet fuldt mættede HABA/neutravidinkomplekser. Biotin blev tilsat til disse komplekser i et neutravidin/biotin-molforhold på 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 og 1:6. For hvert neutravidin/biotin-forhold blev mængden af både HABA/neutravidinkomplekset og det frie HABA bestemt ved at måle absorbansen ved henholdsvis 500 og 350 nm ved hjælp af et ND1000-spektrofotometer (ThermoFisher scientific). Plateauet ved 3,2 biotin/neutravidin angav antallet af biotinbindende lommer, hvilket var i overensstemmelse med producentens specifikationsblad (3,1 biotin/neutravidin).
SPRi-målinger
Biotinyleret IL-1B blev immobiliseret på G-type easy2spot-sensorer ved hjælp af en kontinuerlig flowspotter (Wasatch Microfluidics). Gel-type sensorer blev anvendt på grund af deres øgede bindingskapacitet og mere effektive udnyttelse af det evanescerende felt sammenlignet med en planar overfladesensor. Immobiliseringsreaktionen blev udført i 50 mM eddikesyrebuffer (150 µl pr. spot) med antistofkoncentrationer på 5, 2,5, 1,25 og 0,625 µg ml-1. Som kontrol blev BSA spottet med en koncentration på 5 µg/ml. En immobiliseringsbuffer (pH 4,6) gav en antistofkobling med den højeste bevarede aktivitet og blev derfor anvendt til alle eksperimenter. For at reducere uspecifikke interaktioner blev sensoren deaktiveret med 1% (w/v) BSA i 50 mM acetatbuffer (pH 4,6) i 7 min og efterfølgende med 0,2 M ethanolamin (pH 8,5) i yderligere 7 min. SPRi blev udført ved hjælp af et MX96-system med SUIT-operationssoftware (IBIS). Neutravidin, D-@BMP7, B-@BMP7 og BMP7 blev opløst i systembuffer bestående af PBS med 0,5 % (w/v) BSA og 0,075 % (v/v) Tween80 ved en koncentration på henholdsvis 250, 100, 100 og 100 nM. Biotin blev opløst i en koncentration på 400 µM i systembuffer suppleret med 0,1 % (v/v) DMSO. Tilbage- og fremadgående flow blev indstillet til 10 µl min-1 i en flowcelle, der indeholdt 12 µl prøve. Der blev anvendt Sprint-software til dataindsamling og referencer fra i alt seks pletter pr. tilstand. Data blev efterfølgende eksporteret til Matlab R2015a med henblik på yderligere analyse og kvalitetskontrol ved hjælp af brugerdefinerede scripts (kan fås efter anmodning). Dissociationskonstanterne for de supramolekylære komplekser blev bestemt på følgende måde: Først blev sensoren vasket ved hjælp af tre blanke (dvs. systembuffer) injektioner for at tilvejebringe baggrund for interaktionssignaler. Derefter blev der anvendt en kaskadetilgang til at bestemme affiniteten mellem komponenterne i komplekset. Med henblik herpå blev sensoren inkuberet med buffer efterfulgt af neutravidin, D-@BMP7 eller B-@BMP7, BMP7 og endelig biotinopløsning. Associeringstiden for kaskadeinteraktioner var 30 minutter efterfulgt af 15 minutters dissociation. Mellem hver injektion blev sensoren vasket med systembuffer. Associeringstiden for fortrængningsinteraktionen med biotin var 180 min og blev udført to gange. Kinetikken kunne beskrives med en simpel 1:1 Langmuir-interaktion, som kan indfanges med en eksponentiel ligning (3).
I denne ligning er Rmax ligandens bindingskapacitet (RU), kon er associeringshastigheden (M-1 s-1), koff er dissocieringshastigheden (s-1), c er analytkoncentrationen (M), og t er tiden fra interaktionens start (s). Dissociationskonstanten Kd er defineret som koff/kon. Matlab-software med brugerdefinerede scripts blev anvendt til at analysere affinitetsdataene ved at tilpasse Langmuir-interaktionen. Kort sagt blev blanke værdier trukket fra, og signalet blev nulstillet til den første interaktion. For at bestemme affiniteten af en specifik interaktion blev koff-hastigheden først bestemt i dissocieringsfasen. Derefter blev kon-hastigheden bestemt ved hjælp af en fast koff-hastighed. For forskydning med biotin blev koff-hastigheden bestemt i associationsfasen.
Dex-TAB-syntese og karakterisering
Dextran blev reageret med p-nitrophenylchlorformiat (PNC) for at danne p-nitrophenylcarbonatkonjugater, som derefter blev behandlet med primære aminholdige forbindelser (Supplerende fig. 2). Dextran-p-nitrophenylcarbonatkonjugater (Dex-PNC) blev syntetiseret på følgende måde. I et typisk forsøg blev dextran (3,0 g, 56,3 mmol OH-grupper) opløst i DMF (200 mL, indeholdende 2,4 g LiCl) ved 90 °C under nitrogenatmosfære. Efter opløsningen af dextranet blev blandingen afkølet til 0 °C. Pyridin (1,5 mL, 18,6 mmol) og derefter PNC (2,8 g, 13,9 mmol) blev tilsat opløsningen i små portioner under omrøring og under opretholdelse af temperaturen på 0 °C. Reaktionen fik lov til at fortsætte i en time, og produktet blev udfældet i kold ethanol. Udfældningen blev filtreret og vasket med ethanol og derefter diethylether og derefter tørret i en vakuumovn. Dextran-tyramin-butylamin (Dex-TA-NH2) blev syntetiseret på følgende måde. Dex-PNC blev først reageret med N-Boc-1,4-diaminobutan og derefter med tyramin. Den beskyttende t-butyloxycarbonylgruppe blev fjernet ved reaktion med TFA. I et typisk forsøg blev Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC-grupper) opløst i 16 mL DMF. N-Boc-1,4-diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) blev tilsat under en nitrogenstrøm, og reaktionen fik lov til at fortsætte i 15 minutter. Derefter blev tyramin (0,20 g, 1,46 mmol) tilsat, og reaktionen fik lov til at fortsætte i en time. Produktet blev udfældet i kold ethanol, udfældningen blev filtreret og vasket med ethanol og diethylether og derefter tørret i en vakuumovn. Boc-beskyttet Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) blev opløst i 10 mL afioniseret vand. Trifluoreddikesyre (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) blev tilsat under nitrogenatmosfære og omrørt natten over. Reaktionsblandingen blev neutraliseret med en 2 M NaOH-opløsning og renset ved dialyse (1000 Da molekylvægt cut-off) mod en 150 mM NaCl-opløsning i 48 timer og deioniseret vand i 24 timer og derefter isoleret ved lyofilisering. Dex-TA-NH2 blev yderligere funktionaliseret med biotin ved at lade 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 reagere med et 20-foldigt molært overskud af biotin-LC-NHS i mindst 1 time i 0,1 M bicarbonatbuffer (pH 8,5) (supplerende figur 3). Dex-TAB blev derefter oprenset og koncentreret ved hjælp af en spinfilterkolonne med en molekylvægtgrænse på 3 kDa. De vellykkede synteser af Dex-PNC, Dex-TA-NH2 og Dex-TAB blev bekræftet ved hjælp af 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) i DMSO-d6 eller D2O. Antallet af konjugerede tyramin- og butylaminenheder pr. 100 dextrananhydroglukoseringe blev bestemt ved at beregne forholdet mellem de integrerede signaler fra henholdsvis dextran (δ 4,0-5,8 ppm) og tyramingrupperne (δ 6,66 og δ 6,98 ppm) og dem fra dextran og butylamingrupperne (δ 1,4-1,5 ppm). Antallet af konjugerede biotinstykker pr. 100 dextrananhydroglukoseringe blev bestemt ved at beregne forholdet mellem de integrerede signaler fra tyramingrupperne (δ 6,66 ppm og δ 6,98 ppm) og den koblede 6-aminocaproiske spacer (δ 2.13).
Dex-TAB-krydsforbindelse og ortogonal post-funktionalisering
Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner blev fremstillet ved at blande 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 peberrodsperoxidase og 0,05% (w/v) H2O2. Til ortogonal post-funktionalisering blev Dex-TAB-hydrogeler successivt inkuberet med 1 µM neutravidin i vaskebuffer, der bestod af 1% (w/v) BSA i PBS, vasket med vaskebuffer for at fjerne ubundet neutravidin, inkuberet med 1 µM biotinyleret eller desthiobiotinyleret molekyle af interesse i vaskebuffer og vasket igen med vaskebuffer for at fjerne ubundne molekyler. Dex-TAB/neutravidin/desthiobiotin-konstruktioner kan efterfølgende eksponeres for biotinylerede molekyler af interesse for at skabe en biokemisk gradient i modsat retning. Til fluorescensmikroskopi (EVOS FL), fluorescenskonfokal mikroskopi (Zeiss LSM 510 og Nikon A1+) og fluorescensgenopretning efter fotoblegning (FRAP; Zeiss LSM 510) blev mikrogels direkte funktionaliseret med streptavidin-FITC eller efter neutravidinfunktionalisering som beskrevet ovenfor, funktionaliseret med biotin-atto565, biotin-FITC og/eller desthiobiotin-FITC, som blev fremstillet internt ved at koble desthiobiotin-NHS til 6-aminofluorescein i 1 M bicarbonatbuffer (pH 8). FRAP-kurverne blev opnået ved som en funktion af tiden at plotte den fluorescerende intensitet af blegningspletten minus baggrunden normaliseret for den blegningshastighedskorrigerede gennemsnitlige intensitet før blegning, hvor blegningshastigheden blev bestemt ved at normalisere prøvens fluorescerende intensitet ved siden af blegningspletten normaliseret for dens gennemsnitlige intensitet før blegning. For at karakterisere desthiobiotin/biotinforskydningen blev Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner efter hinanden funktionaliseret med neutravidin, vasket med PBS, funktionaliseret med desthiobiotin-FITC, vasket med PBS og funktionaliseret med biotin-atto565, mens de blev afbildet ved hjælp af fluorescenskonfokal mikroskopi. Endelig blev hydrogellerne vasket grundigt flere gange med PBS for at fjerne ubundet B-ATTO og afbildet ved hjælp af fluorescenskonfokal mikroskopi for at kvantificere den relative mængde D-FITC, der var blevet erstattet af B-ATTO. Forsøget blev gentaget med andre biotinforbindelser for at demonstrere fremgangsmådens universalitet. Nærmere bestemt blev neutravidin/D-FITC-funktionaliserede Dex-TAB-hydrogeler inkuberet og løbende overvåget i 8 dage i tilstedeværelse af 1 µM biotin, biotinyleret peptid (dvs. B-peptid; aminosyresekvens KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), immunoglobulin G (B-IgG) eller guldnanopartikler (B-GNP) i PBS. Prøverne blev grundigt vasket med PBS i mindst et døgn for at fjerne ubundne dele inden analyse af D-FITC-intensiteten. Den supramolekylært komplekserede B-HRP’s biologiske funktion blev vurderet ved hjælp af et DAB-farvningssæt i henhold til producentens protokol. 3D-benformede biotinylerede hydrogeler blev fremstillet ved sprøjtestøbning af Dex-TAB i en polydimethylsiloxan (PDMS)-form, der blev fremstillet ved hjælp af en miniature-benformet master. Hydrogelknogler blev funktionaliseret med FITC på en homogen måde via efterfølgende inkubation natten over med 1 µM neutravidin-, PBS- og 1 µM D-FITC-opløsninger. Efter grundig vask med PBS blev de øverste dele af de knogleformede hydrogeler inkuberet med 1 µM B-ATTO ved hjælp af en tidsbestemt dypning og efterfølgende vasket med PBS for at fjerne ubundne fluorophorer og analyseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. For at undersøge langtidsstabiliteten af supramolekylær kompleksering blev to Dex-TAB-hydrogeler på ca. 5 × 5 × 5 mm udelukkende mærket med D-FITC og B-FITC, grundigt vasket med PBS og kovalent bundet ved hjælp af et mellemprodukt af uberørt (dvs. ikke-mærket) Dex-TA via enzymatisk tværbinding af tyramin-delen. De kombinerede hydrogelkonstruktioner blev derefter inkuberet i PBS og kontinuerligt afbildet ved hjælp af konfokal fluorescensmikroskopi i 2 uger for at undersøge stabiliteten af desthiobiotinylerede og biotinylerede mønstre. Tværsnitsintensiteterne af alle fluorescerende billeder blev bestemt ved hjælp af ImageJ-software.
Analyse af hydrogelnetværk
Diffusionsanalyse blev udført for at analysere effekten af post-funktionalisering af Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner med multivalent neutravidin på hydrogelnetværkets egenskaber. Til dette formål blev uberørte Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner og konstruktioner, der var homogent post-funktionaliseret ved hjælp af en overdreven mængde neutravidin, kombineret med FITC-mærket dextran med hydrodynamiske radier RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) og RH = 27 nm (2000 kDa). Hydrogelkonstrukterne i de fluorescerende opløsninger blev derefter analyseret ved hjælp af fluorescenskonfokal billeddannelse (Zeiss LSM 510), og den fluorescerende intensitet inden for og uden for konstruktionerne blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software. Den relative permeation af fluorescensmærkede dextranmolekyler i Dex-TAB blev bestemt ved at normalisere intensiteten med den fluorescerende intensitet uden for hydrogellerne. Den samme fremgangsmåde blev anvendt til at kvantificere og sammenligne den relative permeabilitet af 5% (w/v) Dex-TAB for FITC-mærkede konventionelle IgG-antistoffer og VHH.
VHH-modifikation og karakterisering
Maleimidkonjugeret desthiobiotin blev syntetiseret ved at lade amino-maleimid og desthiobiotin-NHS reagere i 2 timer i bicarbonatbuffer (pH 8). Desthiobiotin-maleimid blev renset ved hjælp af højtryksvæskechromatografi på et 2545 Quaternary Gradient Module (Waters) fra 90 %/10 % vand/acetonitril (0,1 % trifluoroeddikesyre (TFA)) til 100 % acetonitril (0,1 % TFA). Det opsamlede produkt blev karakteriseret med massespektrometri; MS(ESI): m/z = 336,96 (beregnet m/z = 337,18 for C16H24N4O4). Opløsningsmidlerne blev inddampet ved hjælp af en roterende vakuuminddamper, hvorefter desthiobiotin-maleimidet blev resuspenderet i milliQ-vand, frosset i flydende nitrogen og lyofiliseret natten over. Desthiobiotinylated og biotinylated VHH blev syntetiseret af QVQ BV ved at lade VHHH’s umodificerede cystein reagere med henholdsvis maleimidkonjugeret desthiobiotin og maleimidkonjugeret biotin. Vi anvendte ELISA til at vurdere affiniteten over for BMP7 af ikke-modificerede versus desthiobiotinylerede (D-@BMP7) og biotinylerede (B-@BMP7) VHHH’er. Med henblik herpå blev en Maxisorp-plade med 96 brønde belagt natten over ved 4 °C med 0,5 µg ml-1 humant BMP7 i PBS. Pladerne blev blokeret med 4 % skummetmælk i PBS, og forskellige koncentrationer (0-5 µM) af VHH blev tilsat i 1 % skummetmælk. Detektion af VHH’er blev foretaget ved hjælp af et polyklonalt kaninantistof mod VHH og et HRP-konjugeret sekundært gedeantistof mod kanin. Tilsætning af H2O2 sammen med TMB identificerede mængden af HRP ved at omdanne det til et farvet produkt. H2SO4 blev tilsat for at stoppe reaktionen. Der blev foretaget spektrofotometriske absorptionsmålinger ved 450 nm ved hjælp af en pladelæser (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Dosis-respons-kurver blev opnået ved at tilpasse en logistisk funktion til de målte data ved hjælp af Eq. (4).
Cellekultur
C2C12-BRE-Luc-celler blev dyrket i kulturmedium bestående af 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin i DMEM. Cellerne blev dyrket under 5 % CO2 ved 37 °C, og mediet blev udskiftet 2 gange om ugen. Når cellekulturen nåede nær konfluens, blev cellerne løsnet ved hjælp af 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA ved 37 °C og efterfølgende subkultureret eller anvendt til forsøg. Levedygtigheden af celler indkapslet i enzymatisk tværbundet 5 % (w/v) Dex-TAB blev analyseret umiddelbart efter indkapslingen (dvs. dag 0) og efter fire og syv dages in vitro-kultur ved at inkubere cellerne i 30 minutter med 2 µM calcein AM (levende) og 4 µM EthD-1 (død) i PBS og visualisere de mærkede celler ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Levende/døde analyser blev også udført efter postmodificering af cellebelagte Dex-TAB-hydrogeler med neutravidin, D-@BMP7 og B-@BMP7 ved hjælp af den samme postproduktionsfunktionaliseringsprotokol som beskrevet i det foregående metodeafsnit “Dex-TAB-krydsforbindelse og ortogonal post-funktionalisering”. Cellernes metaboliske aktivitet blev analyseret ved farvning af cellerne ved hjælp af 0,5 g l-1 MTT i kulturmediet og efterfølgende visualisering ved hjælp af brightfield-mikroskopi. Til BMP7-induktionsforsøg blev cellerne udsået med 10.000 celler cm-2 på vævskulturplast og dyrket natten over. Cellerne blev udsultet ved hjælp af kulturmedium indeholdende 0,5 % (v/v) FBS i en periode på 12 timer. Efter sultning blev præfabrikerede Dex-TAB/neutravidin, Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidin/B-@BMP7 eller biotinbehandlede Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7-hydrogelkonstruktioner tilsat til cellekulturen, som efterfølgende blev eksponeret for 100 ng ml-1 BMP7 i 10 til 15 timer (Supplerende figur 12). Efterfølgende blev cellerne lyseret ved hjælp af reporterlysisbuffer og en enkelt fryse-tøcyklus. Luciferaseekspressionen blev bestemt ved hjælp af et luciferaseassay efter producentens protokol og et luminometer (Victor X3, Perkin Elmer). Luciferaseekspression blev normaliseret til det samlede DNA-indhold, som blev kvantificeret ved hjælp af QuantiFluor dsDNA-systemet efter producentens protokol og et fluorometer (Victor X3).
Dataredegørelse og statistik
Spektrofotometriske absorptionsmålinger af HABA blev udført på seks prøver pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse. SPRi-målinger blev udført på seks pletter pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse (lyse linjer). SPRi-aflæsningerne af de enkelte pletter blev normaliseret i forhold til Rmax for neutravidinbindingskurverne for at korrigere for forskelle i plettets tæthed (supplerende figur 1). Kon, koff og Kd for supramolekylære interaktioner blev bestemt fra mindst tre SPRi-eksperimenter og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse eller som overlejring af individuelle datapunkter. FRAP-målinger af fluorescerende mærket streptavidin blev udført på mindst fire hydrogelkonstruktioner pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse normaliseret til den gennemsnitlige intensitet før blegning. Fluorescens (konfokale) intensitetsmålinger (herunder time-lapse-eksperimenter) blev udført på mindst fire hydrogelkonstruktioner pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse eller overlejring af individuelle datapunkter, alle normaliseret til den højeste gennemsnitlige intensitet. Lineær regressionsanalyse blev udført ved hjælp af OriginPro 2016-software. Forskydning af D-FITC af biotinylerede enheder blev målt ved hjælp af fluorescensmikroskopi på ti prøver pr. tilstand. Signifikansen af forskelle blev undersøgt ved hjælp af en envejs ANOVA med Tukey’s post-hoc test (data var normalt fordelt som angivet ved Shapiro-Wilk test: p > 0,1). Permeationen af fluorescerende mærkede dextranmolekyler, VHH og IgG i Dex-TAB blev målt på fire hydrogelkonstruktioner pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Signifikansen af forskelle mellem VHHH- og IgG-permeabilitet blev bestemt ved hjælp af en Mann-Whitney-test. Kvantificering af levende/døde celler blev udført på tre cellefyldte hydrogeler pr. tilstand og rapporteret som et gennemsnit over de enkelte datapunkter. Signifikansen af forskelle blev bestemt ved hjælp af en Kruskal-Wallis ANOVA-test. Dosisresponsanalyser blev udført ved hjælp af tre prøver pr. koncentration og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse og en overlejret tilpasset logistisk funktion baseret på Eq. (4). Konfidensintervaller for dosisresponskurverne blev automatisk genereret af grafplotsoftwaren. Den relative induktion af C2C12-BRE-Luc-celler blev målt på tre in vitro-prøver pr. tilstand og rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Signifikansen af forskelle blev bestemt ved hjælp af Kruskal-Wallis ANOVA-tests.
Skemaer
Alle grafer blev lavet ved hjælp af OriginPro 2016-software. Alle skemaer blev lavet ved hjælp af ChemDraw Professional 16.0 software og CorelDRAW X7 software.
Rapporteringsresumé
Der findes yderligere oplysninger om forskningsdesign i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.