Material
4′-Hydroxyazobensen-2-carboxylsyra (HABA), biotin, N-(2-aminoetyl)maleimid trifluoroacetat-salt (aminomaleimid), ättiksyra, natriumacetat, fosforsyra, magnesiumklorid, Tween 20, Tween 80, bovint serumalbumin (BSA), dimetylsulfoxid (DMSO), dextran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; lyofiliserad före användning), 4-nitrofenylklorformiat (PNC; sublimerad före användning), LiCl (torkad vid 110 °C före användning), tyramin (TA), vattenfri pyridin, vattenfri N,N-dimetylformamid (DMF), N,N-diisopropyletyletylamin (DIPEA), piperidin, aminosyror, ättiksyra, triisopropylsilan, trifluoroättiksyra (TFA), natriumhydroxid (NaOH), N-Boc-1,4-butandiamin (NH2-Boc), natriumbikarbonat (NaHCO3), biotin-atto565, biotin-4-fluorescein (biotin-FITC), 6-aminofluorescein, pepparrotsperoxidas (HRP, typ VI), biotin-HRP, väteperoxid (H2O2); med inhibitor), fetalt bovint serum (FBS), calcein AM, ethidium homodimer-1 (EthD-1), Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT) och alla andra lösningsmedel, om inget annat anges, köptes från Sigma-Aldrich. Den benformade mastern köptes från LEGO. Polydimetylsiloxan (PDMS; Sylgard 184) köptes från Dow Corning. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) köptes från Lonza. Rekombinant humant BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) och H2SO4 köptes från R&D Systems. Fmoc-Rink 4-metylbenzhydrylamin (MBHA)-harts (50 mg skala, substitution 0,52 mmol g-1) och N,N,N,N′,N′-Tetrametyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorofosfat (HBTU) köptes från MultiSynTech. Kloroform och 1-metyl-2-pyrrolidinon (NMP) köptes från WR Chemicals. VHH-antikropp mot BMP7 (Q32c-lab, klon G7) och polyklonal kaninantikropp mot VHH (K1216) köptes från QVQ. Biotinylerad IL-1β-antikropp (508301, klon JK1B2, RRID:AB_315512) köptes från Biolegend. Biotinylerat IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) köptes från Jackson Immunoresearch. HRP-konjugerad sekundär getantikropp mot kanin (P0448) köptes från Dako. Biotinylerade guldnanopartiklar (20 nm) köptes från Cytodiagnostics. Den biotinylerade peptiden med aminosyrasekvensen KGLPLGNSH köptes från Pepscan. Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoat (biotin-LC-NHS) köptes från ApexBio. Neutravidin, N-hydroxysuccinimid-desthiobiotin (EZ-Link NHS-desthiobiotin), 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och 3,3′-diaminobenzidin (DAB) färgningskit köptes från ThermoFisher Scientific. Föraktiverade sensorer för aminkoppling (G-type easy2spot) köptes från Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penicillin och streptomycin samt trypsin-EDTA köptes från Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), luciferasanalysreagens (E1483) och QuantiFluor dsDNA System köptes från Promega. C2C12-BRE-Luc-celler tillhandahölls vänligen av prof. Daniel B. Rifkin.
Neutravidin multivalency analysis
Spektrofotometrisk analys av HABA användes för att analysera antalet biotinbindande fickor i neutravidin. HABA kan specifikt binda till (neutr)avidin på ett liknande sätt som biotin, men med lägre bindningsaffinitet. HABA/neutravidinkomplexet har en absorptionstopp runt 500 nm. Obundet HABA har en absorptionstopp runt 350 nm. HABA:s förskjutning av biotin kan därför utvärderas genom att mäta absorbansen vid 350 och 500 nm. För att bestämma neutravidins antal biotinbindande fickor inkuberades det först med ett överskott av HABA, så att helt mättade HABA/neutravidinkomplex bildades. Biotin tillsattes till dessa komplex i ett molförhållande neutravidin/biotin på 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 och 1:6. För varje neutravidin/biotin-förhållande bestämdes mängden av både HABA/neutravidinkomplexet och det fria HABA genom att mäta absorbansen vid 500 respektive 350 nm med hjälp av en ND1000-spektrofotometer (ThermoFisher scientific). Plattan vid 3,2 biotin/neutravidin indikerade antalet biotinbindande fickor, vilket överensstämde med tillverkarens specifikationsblad (3,1 biotin/neutravidin).
SPRi-mätningar
Biotinylerat IL-1B immobiliserades på easy2spot-sensorer av G-typ med hjälp av en spotter för kontinuerligt flöde (Wasatch Microfluidics). Geltypssensorer användes på grund av deras ökade bindningskapacitet och effektivare användning av det evanescenta fältet, jämfört med en sensor med plan yta. Immobiliseringsreaktionen utfördes i 50 mM ättiksyrabuffert (150 µl per spot) med antikroppskoncentrationer på 5, 2,5, 1,25 och 0,625 µg ml-1. Som en kontroll spottades BSA med en koncentration på 5 µg/ml. En immobiliseringsbuffert (pH 4,6) gav antikroppskoppling med högst bibehållen aktivitet och användes därför för alla experiment. För att minska ospecifika interaktioner inaktiverades sensorn med 1 % (w/v) BSA i 50 mM acetatbuffert (pH 4,6) i 7 minuter och därefter med 0,2 M etanolamin (pH 8,5) i ytterligare 7 minuter. SPRi utfördes med hjälp av ett MX96-system med SUIT-programvaran (IBIS). Neutravidin, D-@BMP7, B-@BMP7 och BMP7 löstes upp i systembuffert bestående av PBS med 0,5 % (w/v) BSA och 0,075 % (v/v) Tween80 i en koncentration på 250, 100, 100 respektive 100 nM. Biotin löstes i en koncentration på 400 µM i systembuffert kompletterad med 0,1 % (v/v) DMSO. Flödet fram och tillbaka ställdes in på 10 µl min-1 i en flödescell som innehöll 12 µl prov. Sprint-programvaran användes för datainsamling och referenser från totalt sex fläckar per tillstånd. Data exporterades därefter till Matlab R2015a för ytterligare analys och kvalitetskontroll med hjälp av anpassade skript (tillgängliga på begäran). De supramolekylära komplexens dissociationskonstanter bestämdes på följande sätt: Först tvättades sensorn med hjälp av tre blankinjektioner (dvs. systembuffert) för att skapa en bakgrund för interaktionssignalerna. Därefter användes en kaskadmetod för att bestämma affiniteten mellan komponenterna i komplexet. För detta ändamål inkuberades sensorn med buffert följt av neutravidin, D-@BMP7 eller B-@BMP7, BMP7 och slutligen biotinlösning. Associeringstiden för kaskadinteraktioner var 30 minuter följt av 15 minuters dissociation. Mellan varje injektion tvättades sensorn med systembuffert. Associeringstiden för förskjutningsinteraktionen med biotin var 180 minuter och utfördes två gånger. Kinetiken kunde beskrivas med en enkel 1:1 Langmuir-interaktion som kan beskrivas med en exponentiell ekvation (3).
I denna ekvation är Rmax ligandens bindningskapacitet (RU), kon är associeringshastigheten (M-1 s-1), koff är dissocieringshastigheten (s-1), c är analytkoncentrationen (M) och t är tiden från interaktionens början (s). Dissociationskonstanten Kd definieras som koff/kon. Matlab-programvaran med anpassade skript användes för att analysera affinitetsdata genom att anpassa Langmuir-interaktionen. I korthet subtraherades tomrummen och signalen nollställdes till den första interaktionen. För att bestämma affiniteten för en specifik interaktion bestämdes först koff-hastigheten i dissocieringsfasen. Därefter bestämdes konhastigheten med hjälp av en fast koff. För förskjutningen med biotin bestämdes koff-hastigheten i associationsfasen.
Dex-TAB-syntes och karakterisering
Dextran reagerades med p-nitrofenylkloroformat (PNC) för att bilda p-nitrofenylkarbonatkonjugat, som sedan behandlades med primära amininnehållande föreningar (kompletterande fig. 2). Dextran-p-nitrofenylkarbonatkonjugat (Dex-PNC) syntetiserades på följande sätt. I ett typiskt experiment löstes dextran (3,0 g, 56,3 mmol OH-grupper) i DMF (200 mL, innehållande 2,4 g LiCl) vid 90 °C under kväveatmosfär. Efter att dextranet lösts upp kyldes blandningen till 0 °C. Pyridin (1,5 ml, 18,6 mmol) och därefter PNC (2,8 g, 13,9 mmol) tillsattes till lösningen i små portioner under omrörning och med bibehållen temperatur på 0 °C. Reaktionen fick fortgå i en timme och produkten fälldes ut i kall etanol. Utfällningen filtrerades och tvättades med etanol och därefter dietyleter och torkades sedan i en vakuumugn. Dextran-tyramin-butylamin (Dex-TA-NH2) syntetiserades på följande sätt. Dex-PNC reagerades först med N-Boc-1,4-diaminobutan och sedan med tyramin. Den skyddande t-butyloxykarbonylgruppen avlägsnades genom reaktion med TFA. I ett typiskt experiment löstes Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC-grupper) i 16 ml DMF. N-Boc-1,4-diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) tillsattes under ett kväveflöde och reaktionen fick fortgå i 15 minuter. Därefter tillsattes tyramin (0,20 g, 1,46 mmol) och reaktionen fick fortgå i en timme. Produkten fälldes ut i kall etanol, fällningen filtrerades och tvättades med etanol och dietyleter och torkades sedan i en vakuumugn. Boc-skyddad Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) löstes i 10 ml avjoniserat vatten. Trifluoroättiksyra (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) tillsattes under kväveatmosfär och rördes över natten. Reaktionsblandningen neutraliserades med en 2 M NaOH-lösning och renades genom dialys (1000 Da molekylvikt cut-off) mot en 150 mM NaCl-lösning i 48 timmar och avjoniserat vatten i 24 timmar och isolerades sedan genom lyofilisering. Dex-TA-NH2 funktionaliserades ytterligare med biotin genom att 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 reagerade med ett 20-faldigt molärt överskott av biotin-LC-NHS under minst 1 timme i 0,1 M bikarbonatbuffert (pH 8,5) (kompletterande figur 3). Dex-TAB renades och koncentrerades sedan med hjälp av en spinfilterkolonn med en gräns för molekylvikt på 3 kDa. De lyckade synteserna av Dex-PNC, Dex-TA-NH2 och Dex-TAB bekräftades med hjälp av 1H-NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) i DMSO-d6 eller D2O. Antalet konjugerade tyramin- och butylaminrester per 100 anhydroglukosringar i dextran bestämdes genom att beräkna förhållandet mellan de integrerade signalerna från dextran (δ 4,0-5,8 ppm) och tyramingrupperna (δ 6,66 och δ 6,98 ppm) respektive dextran och butylamingrupperna (δ 1,4-1,5 ppm). Antalet konjugerade biotinrester per 100 anhydroglukosringar i dextran bestämdes genom att beräkna förhållandet mellan de integrerade signalerna från tyramingrupperna (δ 6,66 ppm och δ 6,98 ppm) och den kopplade 6-aminokaproiska spacern (δ 2.13).
Dex-TAB tvärbindning och ortogonal post-funktionalisering
Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner framställdes genom att blanda 5 % (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 pepparrotsperoxidas och 0,05 % (w/v) H2O2. För ortogonal efterfunktionalisering inkuberades Dex-TAB-hydrogeler efter varandra med 1 µM neutravidin i tvättbuffert som bestod av 1 % (w/v) BSA i PBS, tvättades med tvättbuffert för att avlägsna obundet neutravidin, inkuberades med 1 µM biotinylerad eller desthiobiotinylerad molekyl av intresse i tvättbuffert och tvättades igen med tvättbuffert för att avlägsna obundna molekyler. Dex-TAB/neutravidin/desthiobiotin-konstruktioner kan därefter exponeras för biotinylerade molekyler av intresse för att skapa en biokemisk gradient i motsatt riktning. För fluorescensmikroskopi (EVOS FL), konfokal fluorescensmikroskopi (Zeiss LSM 510 och Nikon A1+) och fluorescensåterställning efter fotoblekning (FRAP; Zeiss LSM 510) funktionaliserades mikrogellerna direkt med streptavidin-FITC, eller efter neutravidinfunktionalisering enligt ovan, funktionaliserades de med biotin-atto565, biotin-FITC och/eller desthiobiotin-FITC som framställdes internt genom att koppla desthiobiotin-NHS till 6-aminofluorescein i en 1 M bikarbonatbuffert (pH 8). FRAP-kurvorna erhölls genom att som en funktion av tiden plotta den fluorescerande intensiteten hos blekningsfläcken minus bakgrunden normaliserad för den blekningshastighetskorrigerade genomsnittliga intensiteten före blekning, där blekningshastigheten bestämdes genom att normalisera provets fluorescerande intensitet vid sidan av blekningsfläcken normaliserad för dess genomsnittliga intensitet före blekning. För att karakterisera desthiobiotin/biotinförskjutningen funktionaliserades Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner efter varandra med neutravidin, tvättades med PBS, funktionaliserades med desthiobiotin-FITC, tvättades med PBS och funktionaliserades med biotin-atto565, samtidigt som de avbildades med hjälp av konfokal fluorescensmikroskopi. Slutligen tvättades hydrogellerna noggrant flera gånger med PBS för att avlägsna obundet B-ATTO och avbildades med fluorescenskonfokalmikroskopi för att kvantifiera den relativa mängden D-FITC som hade ersatts av B-ATTO. Experimentet upprepades med andra biotinföreningar för att visa att metoden är universell. Neutravidin/D-FITC-funktionaliserade Dex-TAB-hydrogeler inkuberades och övervakades kontinuerligt i 8 dagar i närvaro av 1 µM biotin, biotinylerad peptid (dvs. B-peptid; aminosyrasekvens KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), immunglobulin G (B-IgG) eller guldnanopartiklar (B-GNP) i PBS. Proverna tvättades noggrant med PBS under minst en dag för att avlägsna obundna delar före analys av D-FITC-intensiteten. Den supramolekylärt komplexerade B-HRP:s biologiska funktion bedömdes med hjälp av ett DAB-färgningskit enligt tillverkarens protokoll. 3D-benformade biotinylerade hydrogeler skapades genom att man injicerade Dex-TAB i en form av polydimetylsiloxan (PDMS) som tillverkades med hjälp av en miniatyrmodell i form av ett ben. Hydrogelbenen funktionaliserades med FITC på ett homogent sätt genom efterföljande inkubation över natten med 1 µM neutravidin, PBS och 1 µM D-FITC-lösningar. Efter noggrann tvättning med PBS inkuberades de övre delarna av de benformade hydrogellerna med 1 µM B-ATTO med hjälp av en tidsinställd doppbeläggning och tvättades därefter med PBS för att avlägsna obundna fluoroforer, och analyserades med hjälp av fluorescensmikroskopi. För att studera den långsiktiga stabiliteten hos supramolekylär komplexering märktes två Dex-TAB-hydrogeler på cirka 5 × 5 × 5 mm exklusivt med D-FITC och B-FITC, tvättades noggrant med PBS och knöts kovalent med hjälp av en intermediär av renodlad (dvs. icke-märkt) Dex-TA via enzymatisk tvärbindning av tyraminrester. De kombinerade hydrogelkonstruktionerna inkuberades sedan i PBS och avbildades kontinuerligt med hjälp av konfokal fluorescensmikroskopi i två veckor för att undersöka stabiliteten hos desthiobiotinylerade och biotinylerade mönster. Tvärsnittsintensiteten för alla fluorescerande bilder bestämdes med hjälp av ImageJ-programvaran.
Analys av hydrogelnätverk
Diffusionsanalys utfördes för att analysera effekten av efterfunktionalisering av Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner med multivalent neutravidin på hydrogelnätverkets egenskaper. För detta ändamål kombinerades orörda Dex-TAB-hydrogelkonstruktioner och konstruktioner som var homogent post-funktionaliserade med hjälp av en överdriven mängd neutravidin med FITC-märkt dextran med hydrodynamiska radier RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) och RH = 27 nm (2000 kDa). Hydrogelkonstruktionerna i de fluorescerande lösningarna analyserades sedan med hjälp av fluorescenskonfokal avbildning (Zeiss LSM 510) och den fluorescerande intensiteten inom och utanför konstruktionerna kvantifierades med hjälp av ImageJ-programvaran. Den relativa permeationen av fluorescerande märkta dextranmolekyler i Dex-TAB bestämdes genom att normalisera intensiteten med den fluorescerande intensiteten utanför hydrogelerna. Samma tillvägagångssätt användes för att kvantifiera och jämföra den relativa permeabiliteten hos 5 % (w/v) Dex-TAB för FITC-märkta konventionella IgG-antikroppar och VHH.
VHH-modifiering och karakterisering
Maleimidkonjugerat desthiobiotin syntetiserades genom att amino-maleimid och desthiobiotin-NHS reagerade i 2 timmar i bikarbonatbuffert (pH 8). Desthiobiotin-maleimid renades med hjälp av högtrycksvätskekromatografi på en 2545 Quaternary Gradient Module (Waters) från 90 %/10 % vatten/acetonitril (0,1 % trifluoroättiksyra (TFA)) till 100 % acetonitril (0,1 % TFA). Den insamlade produkten karakteriserades med masspektrometri; MS(ESI): m/z = 336,96 (beräknad m/z = 337,18 för C16H24N4O4). Lösningsmedlen avdunstades med hjälp av en roterande vakuumförångare, varefter desthiobiotin-maleimid återupplöstes i milliQ-vatten, frystes i flytande kväve och lyofiliserades över natten. Desthiobiotinylerad och biotinylerad VHH syntetiserades av QVQ BV genom att låta VHHH:s omodifierade cystein reagera med maleimidkonjugerad desthiobiotin respektive maleimidkonjugerad biotin. Vi använde ELISA för att bedöma affiniteten mot BMP7 hos icke-modifierade VHHH jämfört med desthiobiotinylerade (D-@BMP7) och biotinylerade (B-@BMP7). För detta ändamål belades en Maxisorp-platta med 96 brunnar över natten vid 4 °C med 0,5 µg ml-1 humant BMP7 i PBS. Plattorna blockerades med 4 % skummjölk i PBS och olika koncentrationer (0-5 µM) av VHH tillsattes i 1 % skummjölk. Detektion av VHHs gjordes med hjälp av en polyklonal kaninantikropp mot VHH och en HRP-konjugerad sekundär getantikropp mot kanin. Tillsats av H2O2 tillsammans med TMB identifierade mängden HRP genom omvandling till en färgad produkt. H2SO4 tillsattes för att stoppa reaktionen. Spektrofotometriska absorptionsmätningar utfördes vid 450 nm med hjälp av en plattläsare (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Dos-responskurvor erhölls genom att anpassa en logistisk funktion till mätdata med hjälp av ekv. (4).
Cellodling
C2C12-BRE-Luc-celler odlades i ett odlingsmedium som bestod av 20 % (v/v) FBS, 1 % (v/v), 100 U/ml penicillin och 100 µg/ml streptomycin i DMEM. Cellerna odlades under 5 % CO2 vid 37 °C och mediet byttes ut två gånger i veckan. När cellkulturen nådde nära konfluens lossades cellerna med hjälp av 0,25 % (w/v) trypsin-EDTA vid 37 °C och subkulturerades därefter eller användes för experiment. Livskraften hos celler inkapslade i enzymatiskt tvärbunden 5 % (w/v) Dex-TAB analyserades omedelbart efter inkapslingen (dvs. dag 0) och efter fyra och sju dagars in vitro-odling genom att inkubera cellerna i 30 minuter med 2 µM calcein AM (levande) och 4 µM EthD-1 (död) i PBS och visualisera de märkta cellerna med hjälp av fluorescensmikroskopi. Analyser av levande/döda celler utfördes också efter modifiering av cellfyllda Dex-TAB-hydrogeler med neutravidin, D-@BMP7 och B-@BMP7 med hjälp av samma funktionaliseringsprotokoll efter produktion som beskrivs i föregående metodavsnitt ”Dex-TAB-korslänkning och ortogonal post-funktionalisering”. Cellernas metaboliska aktivitet analyserades genom färgning av cellerna med 0,5 g l-1 MTT i kulturmedium och efterföljande visualisering med ljusfältsmikroskopi. För BMP7-induktionsexperiment såddes cellerna med 10 000 celler cm-2 på vävnadskulturplast och odlades över natten. Cellerna svältades med hjälp av kulturmedium innehållande 0,5 % (v/v) FBS under en period av 12 timmar. Efter svältning tillsattes prefabricerade Dex-TAB/neutravidin, Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidin/B-@BMP7 eller biotinbehandlade Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7-hydrogelkonstruktioner till cellkulturen, som därefter exponerades för 100 ng ml-1 BMP7 i 10 till 15 timmar (kompletterande fig. 12). Därefter lyserades cellerna med hjälp av reporterlysisbuffert och en enda frys- och upptiningcykel. Luciferasexpressionen bestämdes med hjälp av en luciferaseanalys enligt tillverkarens protokoll och en luminometer (Victor X3, Perkin Elmer). Luciferasexpressionen normaliserades till det totala DNA-innehållet, som kvantifierades med hjälp av QuantiFluor dsDNA-systemet enligt tillverkarens protokoll och en fluorometer (Victor X3).
Dataredovisning och statistik
Spektrofotometriska absorptionsmätningar av HABA utfördes på sex prover per tillstånd och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse. SPRi-mätningar utfördes på sex fläckar per tillstånd och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse (ljusa linjer). SPRi-avläsningarna av enskilda fläckar normaliserades mot Rmax för neutravidinbindningskurvorna för att korrigera för skillnader i fläcktäthet (kompletterande figur 1). Kon, koff och Kd för supramolekylära interaktioner bestämdes från minst tre SPRi-experiment och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse eller överlagring av enskilda datapunkter. FRAP-mätningar av fluorescerande märkt streptavidin utfördes på minst fyra hydrogelkonstruktioner per tillstånd och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse normaliserat till den genomsnittliga intensiteten före blekning. Mätningar av fluorescensintensiteten (konfokalt) (inklusive time-lapse-experiment) utfördes på minst fyra hydrogelkonstruktioner per tillstånd och rapporterades som genomsnitt ± standardavvikelse eller överlagrade enskilda datapunkter, alla normaliserade till den högsta genomsnittliga intensiteten. Linjär regressionsanalys utfördes med hjälp av programvaran OriginPro 2016. Förskjutning av D-FITC av biotinylerade enheter mättes med hjälp av fluorescensmikroskopi på tio prover per tillstånd. Skillnadernas signifikans undersöktes med hjälp av en envägs ANOVA med Tukey’s post-hoc test (data var normalt fördelade enligt Shapiro-Wilk-testet: p > 0,1). Permeationen av fluorescerande märkta dextranmolekyler, VHH och IgG i Dex-TAB mättes på fyra hydrogelkonstruktioner per tillstånd och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse. Signifikansen av skillnader mellan permeabiliteten för VHHH och IgG fastställdes med hjälp av ett Mann-Whitney-test. Kvantifiering av levande/döda celler utfördes på tre cellfyllda hydrogeler per tillstånd och rapporterades som medelvärdet över de enskilda datapunkterna. Skillnadernas signifikans fastställdes med hjälp av ett Kruskal-Wallis ANOVA-test. Analyser av dosrespons utfördes med tre prover per koncentration och rapporterades som medelvärde ± standardavvikelse och en överlagrad anpassad logistisk funktion baserad på Eq. (4). Konfidensintervall för dosresponskurvorna genererades automatiskt av programvaran för grafisk plottning. Den relativa induktionen av C2C12-BRE-Luc-celler mättes på tre in vitro-prover per tillstånd och rapporterades som genomsnitt ± standardavvikelse. Skillnadernas signifikans fastställdes med hjälp av Kruskal-Wallis ANOVA-tester.
Schematics
Alla grafer gjordes med hjälp av programvaran OriginPro 2016. Alla scheman gjordes med hjälp av programvaran ChemDraw Professional 16.0 och CorelDRAW X7.
Rapporteringssammanfattning
Fördjupad information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.