Materiali
Acido 4′-idrossiazobenzene-2-carbossilico (HABA), biotina, sale trifluoroacetato di N-(2-aminoetil)maleimide (amino-maleimide), acido acetico, acetato di sodio, acido fosforico, cloruro di magnesio, Tween 20, Tween 80, sieroalbumina bovina (BSA), dimetilsulfossido (DMSO), destrano (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; liofilizzato prima dell’uso), 4-nitrofenilcloroformato (PNC; sublimato prima dell’uso), LiCl (essiccato a 110 °C prima dell’uso), tiramina (TA), piridina anidra, N,N-dimetilformammide (DMF) anidra, N,N-diisopropiletilammina (DIPEA), piperidina, aminoacidi, anidride acetica, triisopropilsilano, acido trifluoroacetico (TFA), idrossido di sodio (NaOH), N-Boc-1,4-butanediamina (NH2-Boc), bicarbonato di sodio (NaHCO3), biotina-atto565, biotina-4-fluoresceina (biotina-FITC), 6-aminofluoresceina, perossidasi di rafano (HRP, tipo VI), biotina-HRP, perossido di idrogeno (H2O2; con inibitore), siero fetale bovino (FBS), calceina AM, ethidium homodimer-1 (EthD-1), Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT), e tutti gli altri solventi, salvo diversa indicazione, sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. Il master a forma di osso è stato acquistato da LEGO. Polidimetilsilossano (PDMS; Sylgard 184) è stato acquistato da Dow Corning. Fosfato-buffered salina (PBS) è stato acquistato da Lonza. BMP7 umano ricombinante (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB), e H2SO4 sono stati acquistati da R&D Systems. Fmoc-Rink 4-metilbenzidrilammina (MBHA) resina (50 mg scala, sostituzione 0,52 mmol g-1) e N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronio esafluorofosfato (HBTU) sono stati acquistati da MultiSynTech. Il cloroformio e l’1-metil-2-pirrolidinone (NMP) sono stati acquistati dalla WR Chemicals. L’anticorpo VHH contro BMP7 (Q32c-lab, clone G7) e l’anticorpo policlonale di coniglio contro VHH (K1216) sono stati acquistati da QVQ. L’anticorpo IL-1β biotinilato (508301, clone JK1B2, RRID:AB_315512) è stato acquistato da Biolegend. Biotinilato IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) è stato acquistato da Jackson Immunoresearch. L’anticorpo secondario di capra coniugato con HRP contro il coniglio (P0448) è stato acquistato da Dako. Le nanoparticelle d’oro biotinilate (20 nm) sono state acquistate da Cytodiagnostics. Il peptide biotinilato con sequenza aminoacidica KGLPLGNSH è stato acquistato da Pepscan. Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate (biotina-LC-NHS) è stato acquistato da ApexBio. Neutravidina, N-hydroxysuccinimide-desthiobiotin (EZ-Link NHS-desthiobiotin), 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), e 3,3′-diaminobenzidina (DAB) colorazione kit sono stati acquistati da ThermoFisher Scientific. I sensori pre-attivati per l’accoppiamento amminico (G-type easy2spot) sono stati acquistati da Ssens BV. Medio di Dulbecco modificato Eagle (DMEM), penicillina e streptomicina, e tripsina-EDTA sono stati acquistati da Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), reagente luciferasi saggio (E1483), e QuantiFluor dsDNA System sono stati acquistati da Promega. Le cellule C2C12-BRE-Luc sono state gentilmente fornite dal prof. Daniel B. Rifkin.
Analisi della neutravidina multivalenza
L’analisi spettrofotometrica di HABA è stata utilizzata per analizzare il numero di tasche di legame alla biotina della neutravidina. In particolare, HABA può legarsi specificamente alla (neutra)avidina in modo simile alla biotina, ma con una minore affinità di legame. Il complesso HABA/neutravidina ha un picco di assorbimento intorno ai 500 nm. HABA non legato ha un picco di assorbimento intorno ai 350 nm. Lo spostamento di HABA da parte della biotina può quindi essere valutato misurando l’assorbanza a 350 e 500 nm. Per determinare il numero di neutravidina di biotina tasche di legame, è stato prima incubato con un eccesso di HABA, in modo che completamente saturi HABA / neutravidina complessi sono stati formati. La biotina è stata aggiunta a questi complessi in un rapporto molare neutravidina/biotina di 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 e 1:6. Per ogni neutravidina / biotina rapporto, la quantità di entrambi i HABA / neutravidina complesso e il libero HABA è stato determinato misurando l’assorbanza a 500 e 350 nm, rispettivamente, utilizzando un ND1000 spettrofotometro (ThermoFisher scientific). Il plateau a 3,2 biotina/neutravidina ha indicato il numero di tasche di legame della biotina, che era in conformità con il foglio di specifiche del produttore (3,1 biotina/neutravidina).
Misure SPRi
Biotinilato IL-1B è stato immobilizzato su G-tipo easy2spot sensori utilizzando un flusso continuo spotter (Wasatch Microfluidics). I sensori di tipo gel sono stati utilizzati per la loro maggiore capacità di legame e l’uso più efficiente del campo evanescente, rispetto a un sensore di superficie planare. La reazione di immobilizzazione è stata eseguita in un tampone di acido acetico da 50 mM (150 µl per spot) con concentrazioni di anticorpi di 5, 2,5, 1,25 e 0,625 µg ml-1. Come controllo, la BSA è stata macchiata ad una concentrazione di 5 µg/ml. Un buffer di immobilizzazione (pH 4.6) ha fornito l’accoppiamento degli anticorpi con la massima attività conservata ed è stato quindi utilizzato per tutti gli esperimenti. Per ridurre le interazioni non specifiche, il sensore è stato disattivato con 1% (w/v) BSA in 50 mM tampone acetato (pH 4,6) per 7 min e successivamente con 0,2 M etanolamina (pH 8,5) per altri 7 min. SPRi è stata eseguita utilizzando un sistema MX96 con software operativo SUIT (IBIS). Neutravidina, D-@BMP7, B-@BMP7, e BMP7 sono stati sciolti in tampone sistema costituito da PBS con 0,5% (w / v) BSA e 0,075% (v / v) Tween80 ad una concentrazione di 250, 100, 100, e 100 nM, rispettivamente. La biotina è stata sciolta ad una concentrazione di 400 µM nel buffer di sistema integrato con lo 0,1% (v/v) DMSO. Il flusso avanti e indietro è stato impostato su 10 µl min-1 in una cella di flusso contenente 12 µl di campione. Il software Sprint è stato utilizzato per la raccolta dei dati e la referenziazione da un totale di sei spot per condizione. I dati sono stati successivamente esportati in Matlab R2015a per ulteriori analisi e controllo di qualità utilizzando script personalizzati (disponibili su richiesta). Le costanti di dissociazione dei complessi supramolecolari sono stati determinati come segue: in primo luogo, il sensore è stato lavato utilizzando tre iniezioni vuoto (cioè, buffer di sistema) per fornire lo sfondo per i segnali di interazione. Poi, un approccio a cascata è stato utilizzato per determinare l’affinità tra i componenti del complesso. A tal fine, il sensore è stato incubato con tampone seguito da neutravidina, D-@BMP7 o B-@BMP7, BMP7, e infine soluzione di biotina. Il tempo di associazione delle interazioni a cascata è stato di 30 min seguito da 15 min di dissociazione. Tra ogni iniezione il sensore è stato lavato con il buffer del sistema. Il tempo di associazione dell’interazione di spostamento con la biotina era di 180 min ed è stato eseguito due volte. La cinetica potrebbe essere descritta con una semplice interazione di Langmuir 1:1 che può essere catturata con una Eq. esponenziale (3).
In questa equazione Rmax è la capacità di legame del ligando (RU), kon è la velocità di associazione (M-1 s-1), koff è la velocità di dissociazione (s-1), c è la concentrazione di analita (M), e t è il tempo dall’inizio dell’interazione (s). La costante di dissociazione Kd è definita come koff/kon. Il software Matlab con script personalizzati è stato utilizzato per analizzare i dati di affinità adattando l’interazione di Langmuir. In breve, gli spazi vuoti sono stati sottratti e il segnale è stato azzerato alla prima interazione. Per determinare l’affinità di una specifica interazione, prima è stato determinato il tasso koff nella fase di dissociazione. Successivamente, il tasso kon è stato determinato utilizzando un koff fisso. Per lo spostamento con la biotina il tasso di koff è stato determinato nella fase di associazione.
Sintesi e caratterizzazione del Dex-TAB
Il destrano è stato fatto reagire con p-nitrofenil cloroformiato (PNC) per formare coniugati p-nitrofenil carbonato, che sono stati poi trattati con composti contenenti ammina primaria (Fig. 2 supplementare). Destrano-p-nitrofenil carbonato coniugati (Dex-PNC) sono stati sintetizzati come segue. In un tipico esperimento, destrano (3,0 g, 56,3 mmol gruppi OH) è stato sciolto in DMF (200 mL, contenente 2,4 g di LiCl) a 90 ° C in atmosfera di azoto. Dopo che il destrano è stato sciolto, la miscela è stata raffreddata a 0 °C. La piridina (1,5 mL, 18,6 mmol) e successivamente il PNC (2,8 g, 13,9 mmol) sono stati aggiunti alla soluzione in piccole porzioni mentre si agitava e si manteneva la temperatura a 0 °C. La reazione è stata lasciata procedere per un’ora e il prodotto è stato precipitato in etanolo freddo. Il precipitato è stato filtrato e lavato con etanolo e successivamente con etere dietilico, e poi asciugato in un forno a vuoto. Il destrano-tiramina-butilammina (Dex-TA-NH2) è stato sintetizzato come segue. Il Dex-PNC è stato fatto reagire prima con N-Boc-1,4-diaminobutano e poi con la tiramina. Il gruppo t-butirrossicarbonile di protezione è stato rimosso per reazione con TFA. In un tipico esperimento, Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol di gruppi PNC) è stato sciolto in 16 mL di DMF. N-Boc-1,4-diaminobutano (0,09 g, 0,48 mmol) è stato aggiunto sotto un flusso di azoto e la reazione è stata lasciata procedere per 15 minuti. Successivamente è stata aggiunta la tiramina (0.20 g, 1.46 mmol) e la reazione è stata lasciata procedere per un’ora. Il prodotto è stato precipitato in etanolo freddo, il precipitato è stato filtrato e lavato con etanolo ed etere dietilico, e poi asciugato in un forno a vuoto. Boc-protetto Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) è stato sciolto in 10 mL di acqua deionizzata. L’acido trifluoroacetico (TFA) (1 mL, 13.06 mmol) è stato aggiunto sotto un’atmosfera di azoto e mescolato durante la notte. La miscela di reazione è stata neutralizzata da una soluzione di NaOH 2 M e purificata mediante dialisi (cut-off di peso molecolare 1000 Da) contro una soluzione di NaCl 150 mM per 48 h e acqua deionizzata per 24 h e poi isolata mediante liofilizzazione. Dex-TA-NH2 è stato ulteriormente funzionalizzato con biotina facendo reagire 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 con un eccesso molare di 20 volte di biotina-LC-NHS per almeno 1 h in 0,1 M tampone bicarbonato (pH 8,5) (Figura 3 supplementare). Dex-TAB è stato poi purificato e concentrato utilizzando una colonna filtro di spin con 3 kDa peso molecolare cut-off. Le sintesi di successo di Dex-PNC, Dex-TA-NH2, e Dex-TAB sono stati confermati utilizzando 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) in DMSO-d6 o D2O. Il numero di coniugati tiramina e butilammina moieties per 100 anelli anidroglucosio destrano sono stati determinati calcolando i rapporti dei segnali integrati dal destrano (δ 4.0-5.8 ppm) e dei gruppi tiramina (δ 6.66 e δ 6.98 ppm), e quelli di destrano e dei gruppi butilammina (δ 1.4-1.5 ppm), rispettivamente. Il numero di coniugati biotina moieties per 100 anelli anidroglucosio destrano è stato determinato calcolando il rapporto dei segnali integrati dai gruppi tiramina (δ 6.66 ppm e δ 6.98 ppm) e il accoppiato 6-aminocaproic spaziatore (δ 2.13).
Dex-TAB reticolazione e ortogonale post-funzionalizzazione
Dex-TAB costrutti idrogel sono stati preparati mescolando 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 perossidasi di rafano, e 0,05% (w/v) H2O2. Per post-funzionalizzazione ortogonale, Dex-TAB idrogeli sono stati consecutivamente incubati con 1 µM neutravidina in tampone di lavaggio che consisteva di 1% (w / v) BSA in PBS, lavato con tampone di lavaggio per rimuovere neutravidina non legato, incubato con 1 µM biotinilato o desthiobiotinylated molecola di interesse in tampone di lavaggio, e lavato nuovamente con tampone di lavaggio per rimuovere le molecole non legate. I costrutti Dex-TAB/neutravidina/desthiobiotin potrebbero successivamente essere esposti a molecole biotinilate di interesse per creare un gradiente biochimico contro-direzionale. Per la microscopia a fluorescenza (EVOS FL), la microscopia confocale a fluorescenza (Zeiss LSM 510 e Nikon A1+) e il recupero della fluorescenza dopo il photobleaching (FRAP; Zeiss LSM 510), i microgel sono stati funzionalizzati direttamente con streptavidina-FITC, o dopo la funzionalizzazione della neutravidina come descritto sopra, funzionalizzati con biotina-atto565, biotina-FITC, e/o desthiobiotin-FITC che è stato prodotto in casa accoppiando desthiobiotin-NHS a 6-aminofluoresceina in 1 M tampone bicarbonato (pH 8). Le curve FRAP sono state ottenute tracciando, in funzione del tempo, l’intensità fluorescente della macchia di candeggina meno lo sfondo normalizzato per il tasso di candeggina corretta intensità media prima dello sbiancamento, dove il tasso di candeggina è stato determinato normalizzando l’intensità fluorescente del campione oltre alla macchia di candeggina normalizzata per la sua intensità media prima dello sbiancamento. Per caratterizzare la destribiotina / biotina spostamento, Dex-TAB costrutti idrogel sono stati consecutivamente funzionalizzati con neutravidina, lavato con PBS, funzionalizzato con destribiotina-FITC, lavato con PBS, e funzionalizzato con biotina-atto565, mentre imaged utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza. Infine, gli idrogeli sono stati accuratamente lavati più volte con PBS per rimuovere il B-ATTO non legato e ripreso utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza per quantificare la quantità relativa di D-FITC che era stato sostituito da B-ATTO. L’esperimento è stato ripetuto con altri composti di biotina per dimostrare l’universalità dell’approccio. In particolare, neutravidina / D-FITC funzionalizzato Dex-TAB idrogeli sono stati incubati e continuamente monitorati per 8 giorni in presenza di 1 µM biotina, peptide biotinilato (cioè, B-peptide; sequenza aminoacidica KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), immunoglobulina G (B-IgG), o nanoparticelle d’oro (B-GNP) in PBS. I campioni sono stati accuratamente lavati con PBS per almeno un giorno per rimuovere le società non legate prima dell’analisi dell’intensità D-FITC. Funzione biologica del supramolecolarmente complessato B-HRP è stato valutato utilizzando un kit di colorazione DAB seguendo il protocollo del produttore. 3D a forma di osso biotinilato idrogeli sono stati creati da iniezione stampaggio Dex-TAB in un polidimetilsilossano (PDMS) stampo che è stato fabbricato utilizzando una miniatura a forma di osso master. Le ossa dell’idrogel sono state funzionalizzate con FITC in modo omogeneo attraverso una successiva incubazione notturna con soluzioni di neutravidina 1 µM, PBS e 1 µM D-FITC. Dopo un accurato lavaggio con PBS, le parti superiori degli idrogeli a forma di osso sono state incubate con 1 µM B-ATTO usando un dip-coating temporizzato e successivamente lavate con PBS per rimuovere i fluorofori non legati, e analizzate usando la microscopia a fluorescenza. Per studiare la stabilità a lungo termine di complessazione supramolecolare, due Dex-TAB idrogeli di circa 5 × 5 × 5 mm sono stati etichettati esclusivamente con D-FITC e B-FITC, accuratamente lavato con PBS, e covalentemente legato utilizzando un intermediario di incontaminata (cioè, non etichettato) Dex-TA tramite reticolazione enzimatica di tiramina moieties. I costrutti idrogel combinati sono stati poi incubati in PBS e continuamente imaged utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale per 2 settimane per indagare la stabilità dei modelli desthiobiotinylated e biotinylated. Intensità trasversale di tutte le immagini fluorescenti sono stati determinati utilizzando il software ImageJ.
Analisi della rete idrogel
L’analisi di diffusione è stata eseguita per analizzare l’effetto della post-funzionalizzazione dei costrutti di idrogel Dex-TAB con neutravidina multivalente sulle proprietà della rete idrogel. A tal fine, incontaminati Dex-TAB idrogel costrutti e costrutti che sono stati omogeneamente post-funzionalizzati utilizzando una quantità eccessiva di neutravidina sono stati combinati con FITC marcato destrano con raggi idrodinamici RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa), e RH = 27 nm (2000 kDa). I costrutti idrogel nelle soluzioni fluorescenti sono stati poi analizzati utilizzando l’imaging confocale a fluorescenza (Zeiss LSM 510) e l’intensità fluorescente all’interno e all’esterno dei costrutti è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. La permeazione relativa delle molecole di destrano etichettate fluorescentemente in Dex-TAB è stata determinata normalizzando l’intensità con l’intensità fluorescente fuori idrogeli. Lo stesso approccio è stato utilizzato per quantificare e confrontare la permeabilità relativa del 5% (w / v) Dex-TAB per FITC-marcato anticorpi IgG convenzionali e VHH.
VHH modifica e caratterizzazione
Maleimide coniugato desthiobiotin è stato sintetizzato facendo reagire amino-maleimide e desthiobiotin-NHS per 2 ore in tampone bicarbonato (pH 8). Desthiobiotin-maleimide è stato purificato mediante cromatografia liquida ad alta pressione su un modulo 2545 Gradiente quaternario (Waters) dal 90%/10% Acqua / Acetonitrile (0,1% acido trifluoroacetico (TFA)) al 100% Acetonitrile (0,1% TFA). Il prodotto raccolto è stato caratterizzato con la spettrometria di massa; MS(ESI): m/z = 336.96 (m/z calcolato = 337.18 per C16H24N4O4). I solventi sono stati evaporati utilizzando un evaporatore a vuoto rotante, dopo di che la desthiobiotin-maleimide è stato risospeso in acqua milliQ, congelato in azoto liquido, e liofilizzato durante la notte. Desthiobiotinylated e biotinylated VHH sono stati sintetizzati da QVQ BV facendo reagire la cisteina immodificata del VHH con maleimide coniugato desthiobiotin e maleimide coniugato biotina, rispettivamente. Abbiamo usato l’ELISA per valutare l’affinità contro BMP7 del VHH non modificato rispetto a quello desthiobiotinilato (D-@BMP7) e biotinilato (B-@BMP7). A tal fine, una piastra Maxisorp a 96 pozzetti è stata rivestita per una notte a 4 °C con 0,5 µg ml-1 di BMP7 umana in PBS. Le piastre sono state bloccate con il 4% di latte scremato in PBS e sono state aggiunte varie concentrazioni (0-5 µM) di VHH in 1% di latte scremato. La rilevazione di VHHs è stata fatta usando un anticorpo policlonale di coniglio contro VHH e un anticorpo secondario di capra coniugato con HRP contro il coniglio. L’aggiunta di H2O2 insieme a TMB ha identificato la quantità di HRP mediante conversione in un prodotto colorato. H2SO4 è stato aggiunto per fermare la reazione. Le misure di assorbimento spettrofotometrico sono state effettuate a 450 nm utilizzando un lettore di piastre (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Le curve dose-risposta sono state ottenute adattando una funzione logistica ai dati misurati utilizzando l’Eq. (4).
Cultura cellulare
Le cellule C2C12-BRE-Luc sono state coltivate in un terreno di coltura composto da 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml Penicillina e 100 µg/ml Streptomicina in DMEM. Le cellule sono state coltivate sotto il 5% di CO2 a 37 °C e il mezzo è stato sostituito 2 volte a settimana. Quando la coltura cellulare ha raggiunto quasi la confluenza, le cellule sono state staccate usando 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA a 37 °C e successivamente sub-coltivate o utilizzate per la sperimentazione. Vitalità delle cellule incapsulate in enzimaticamente reticolato 5% (w / v) Dex-TAB è stato analizzato immediatamente dopo l’incapsulamento (cioè, giorno 0) e dopo quattro e sette giorni di cultura in vitro incubando le cellule per 30 min con 2 µM calceina AM (vivo) e 4 µM EthD-1 (morto) in PBS, e visualizzando le cellule etichettate utilizzando microscopia a fluorescenza. Live / Dead analisi è stata eseguita anche dopo post-modifica di cellule caricate Dex-TAB idrogeli con neutravidina, D-@BMP7, e B-@BMP7 utilizzando la stessa post-produzione protocollo di funzionalizzazione come descritto nella sezione metodi precedenti “Dex-TAB crosslinking e ortogonale post-funzionalizzazione”. L’attività metabolica delle cellule è stata analizzata colorando le cellule con 0,5 g l-1 MTT nel terreno di coltura e la successiva visualizzazione con microscopia a campo chiaro. Per gli esperimenti di induzione di BMP7, le cellule sono state seminate a 10.000 cellule cm-2 su plastica per coltura di tessuti e coltivate durante la notte. Le cellule sono state affamate utilizzando un terreno di coltura contenente 0,5% (v/v) FBS per un periodo di 12 ore. Dopo l’inedia, prefabbricati Dex-TAB/neutravidina, Dex-TAB/neutravidina/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidina/B-@BMP7, o biotina trattata Dex-TAB/neutravidina/D-@BMP7 costrutti idrogel sono stati aggiunti alla cultura cellulare, che sono stati successivamente esposti a 100 ng ml-1 di BMP7 per 10 a 15 h (Fig. 12 supplementare). Successivamente, le cellule sono state lisate utilizzando il buffer di lisi reporter e un singolo ciclo di congelamento-disgelo. L’espressione della luciferasi è stata determinata utilizzando un saggio di luciferasi seguendo il protocollo del produttore e un luminometro (Victor X3, Perkin Elmer). L’espressione della luciferasi è stata normalizzata al contenuto totale di DNA, che è stato quantificato utilizzando il QuantiFluor dsDNA System seguendo il protocollo del produttore e un fluorimetro (Victor X3).
Rappresentazione dei dati e statistiche
Misure di assorbimento spettrofotometrico di HABA sono state eseguite su sei campioni per condizione e riportate come media ± deviazione standard. Le misurazioni SPRi sono state eseguite su sei spot per condizione e riportate come media ± deviazione standard (linee chiare). Le letture SPRi dei singoli punti sono stati normalizzati rispetto alla Rmax delle curve di legame neutravidina per correggere le differenze di densità spotting (Fig. 1 supplementare). Il kon, koff, e Kd di interazioni supramolecolari sono stati determinati da almeno tre esperimenti SPRi e riportati come la media ± deviazione standard o sovrapponendo singoli datapoints. Misure FRAP di streptavidina marcata in modo fluorescente sono stati eseguiti su almeno quattro costrutti idrogel per condizione e riportati come la media ± deviazione standard normalizzata all’intensità media prima dello sbiancamento. La fluorescenza (confocale) misure di intensità (compresi gli esperimenti time-lapse) sono stati eseguiti su almeno quattro costrutti idrogel per condizione e riportati come la media ± deviazione standard o sovrapposizione di singoli datapoint, tutti normalizzati alla più alta intensità media. Analisi di regressione lineare è stata eseguita utilizzando il software OriginPro 2016. Spostamento di D-FITC da biotinilati moieties è stato misurato utilizzando la microscopia a fluorescenza su dieci campioni per condizione. La significatività delle differenze è stata studiata utilizzando un ANOVA a una via con il test post-hoc di Tukey (i dati erano normalmente distribuiti come indicato dal test di Shapiro-Wilk: p > 0,1). La permeazione di molecole di destrano marcate con fluorescenza, VHH e IgG in Dex-TAB è stata misurata su quattro costrutti di idrogel per condizione e riportata come media ± deviazione standard. Significatività delle differenze tra VHH e IgG permeabilità è stato determinato utilizzando un test di Mann-Whitney. Live / morto quantificazione è stata eseguita su tre idrogeli carico di cellule per condizione e riportato come la media sovrapponendo i singoli datapoint. La significatività delle differenze è stata determinata utilizzando un test Kruskal-Wallis ANOVA. Le analisi di risposta alla dose sono state eseguite utilizzando tre campioni per concentrazione e riportate come media ± deviazione standard e una funzione logistica sovrapposta basata sull’Eq. (4). Gli intervalli di confidenza delle curve dose-risposta sono stati generati automaticamente dal software di plottaggio grafico. L’induzione relativa delle cellule C2C12-BRE-Luc è stata misurata su tre campioni in vitro per condizione e riportata come media ± deviazione standard. Significatività delle differenze è stato determinato utilizzando Kruskal-Wallis ANOVA test.
Schemi
Tutti i grafici sono stati fatti utilizzando OriginPro 2016 software. Tutti gli schemi sono stati realizzati utilizzando il software ChemDraw Professional 16.0 e il software CorelDRAW X7.
Reporting summary
Più informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.