Cosmide sind in erster Linie Plasmide mit einem bakteriellen oriV, einem antibiotischen Selektionsmarker und einer Klonierungsstelle, aber sie tragen auch eine oder neuerdings zwei cos-Stellen, die von Bakteriophagen lambda abgeleitet sind. Je nach Zielsetzung des Experiments sind Cosmide mit breitem Wirtsspektrum, Shuttle-Cosmide oder „Säugetier“-Cosmide (verbunden mit SV40-oriV und Säugetier-Selektionsmarkern) erhältlich. Die Ladekapazität der Cosmide hängt von der Größe des Vektors selbst ab, liegt aber in der Regel bei 40-45 kb. Das Klonierungsverfahren umfasst die Erzeugung von zwei Vektorarmen, die dann mit der Fremd-DNA verbunden werden. Die Selektion gegen Wildtyp-Cosmid-DNA erfolgt einfach durch Größenausschluss. Cosmide bilden daher immer Kolonien und keine Plaques. Auch die Klon-Dichte ist mit ca. 105 – 106 KBE pro µg ligierter DNA wesentlich geringer.
Nach der Konstruktion rekombinanter Lambda- oder Cosmid-Bibliotheken wird die gesamte DNA mit Hilfe einer Technik, die als in vitro-Packaging bezeichnet wird, in einen geeigneten E. coli-Wirt übertragen. Die erforderlichen Verpackungsextrakte werden aus E. coli cI857-Lysogenen (red- gam- Sam und Dam (head assembly) bzw. Eam (tail assembly)) gewonnen. Diese Extrakte erkennen und verpacken die rekombinanten Moleküle in vitro und erzeugen entweder reife Phagenpartikel (Lambda-basierte Vektoren) oder rekombinante Plasmide, die in Phagenhüllen enthalten sind (Cosmide). Diese Unterschiede spiegeln sich in den unterschiedlichen Infektionshäufigkeiten wider, die zugunsten der Lambda-Ersatzvektoren zu beobachten sind. Dadurch wird ihre etwas geringere Ladekapazität kompensiert. Phagenbibliotheken lassen sich auch leichter aufbewahren und screenen als Cosmidbibliotheken.
Ziel-DNA: Die zu klonierende genomische DNA muss in den geeigneten Größenbereich von Restriktionsfragmenten geschnitten werden. Dies geschieht in der Regel durch partielle Restriktion und anschließende Größenfraktionierung oder Dephosphorylierung (unter Verwendung von Kalb-Intestin-Phosphatase), um Chromosomen-Scrambling zu vermeiden, d.h. die Ligation physikalisch unverbundener Fragmente.