Abstract
Der Hauptübertragungsweg der SARS-CoV-Infektion sind vermutlich Atemtropfen. Das Virus ist jedoch auch in anderen Körperflüssigkeiten und Ausscheidungen nachweisbar. Die Stabilität des Virus bei verschiedenen Temperaturen und relativer Luftfeuchtigkeit auf glatten Oberflächen wurde untersucht. Das getrocknete Virus auf glatten Oberflächen behielt seine Lebensfähigkeit für mehr als 5 Tage bei Temperaturen von 22-25°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-50%, d.h. in typischen klimatisierten Umgebungen. Bei höheren Temperaturen und höherer relativer Luftfeuchtigkeit (z. B. 38 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von >95 %) ging die Lebensfähigkeit des Virus jedoch rasch verloren (>3 log10). Die bessere Stabilität des SARS-Coronavirus bei niedrigen Temperaturen und geringer Luftfeuchtigkeit könnte seine Übertragung in Gemeinschaften in subtropischen Gebieten (wie Hongkong) im Frühjahr und in klimatisierten Umgebungen erleichtern. Dies könnte auch erklären, warum in einigen asiatischen Ländern in tropischen Gebieten (wie Malaysia, Indonesien oder Thailand) mit hohen Temperaturen und hoher relativer Luftfeuchtigkeit keine größeren Ausbrüche von SARS in der Bevölkerung auftraten.
1. Einleitung
Das Schwere Akute Respiratorische Syndrom (SARS) war eine neu auftretende Krankheit, die mit schwerer Lungenentzündung einherging und sich 2003 auf über 30 Länder in 5 Kontinenten ausbreitete. Als Ursache wurde ein neuartiges Coronavirus identifiziert. SARS hatte dramatische Auswirkungen auf die Gesundheitsversorgung und die Wirtschaft der betroffenen Länder, und die Gesamtsterblichkeitsrate wurde auf 9 % geschätzt, wobei sie bei Personen über 60 Jahren auf 50 % anstieg. Ein bemerkenswertes Merkmal dieser Krankheit war ihre Vorliebe für die Übertragung im Gesundheitswesen und auf enge familiäre und soziale Kontakte. Es wird vermutet, dass die Krankheit durch Tröpfcheninfektion, engen direkten oder indirekten Kontakt übertragen wird, aber die relative Bedeutung dieser Übertragungswege ist derzeit noch unklar. In einer Studie wurde gezeigt, dass ein SARS-Patient virale Aerosole erzeugen kann, so dass die Übertragung durch Tröpfchen in der Luft ein möglicher Übertragungsweg ist. Die Rolle von Fomiten und Umweltkontamination bei der Übertragung der Infektion ist jedoch derzeit noch unklar. Ein Krankheitsausbruch in einem Hochhaus (Amoy Gardens) in Hongkong, an dem mehr als 300 Bewohner erkrankt waren, konnte nicht durch eine Übertragung durch Tröpfcheninfektion von infizierten Patienten erklärt werden. Das infektiöse Virus ist in den Fäkalien nachweisbar, und es wird angenommen, dass die Aerosolisierung des Virus in kontaminierten Fäkalien der Übertragungsweg dieses Ausbruchs war.
Wir und andere haben berichtet, dass die Infektiosität des SARS-CoV (SARS-Coronavirus) nach 15-minütigem Erhitzen auf 56 °C verloren ging, dass es aber nach dem Trocknen auf Kunststoff mindestens zwei Tage lang stabil war. Es wurde durch übliche Fixierungsmittel, die im Labor verwendet werden, vollständig inaktiviert. Eine andere Studie zeigte, dass es durch ultraviolettes Licht, alkalische () oder saure () Bedingungen inaktiviert wurde. Humane Coronaviren überleben nachweislich mehrere Tage in PBS oder Kulturmedium mit 5-10 % FCS, aber nur wenige Stunden nach dem Trocknen. Es gibt einige Studien, die einen Zusammenhang zwischen dem Ausbruch von SARS, meteorologischen Faktoren und Luftverschmutzung herstellen. Daher sind Informationen über das Überleben des SARS-Coronavirus (SCoV) in der Umwelt bei unterschiedlichen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen von großem Interesse für das Verständnis der Virusübertragung. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde anhand von Surrogat-Coronaviren (transmissibles Gastroenteritis-Virus (TGEV) und Maushepatitis-Virus (MHC)) untersucht, wie sich die Lufttemperatur und die relative Luftfeuchtigkeit auf das Überleben des Coronavirus auf der Oberfläche auswirken. Die Überlebenswirkung dieser Umweltfaktoren auf das SARS-Coronavirus ist nach wie vor unklar. In der vorliegenden Studie berichten wir über die Stabilität des SARS-Coronavirus bei verschiedenen Temperaturen und relativer Luftfeuchtigkeit.
2. Material und Methoden
2.1. Virusstamm und Zelllinie
Der in dieser Studie verwendete SARS CoV-Stamm ist HKU39849. Fötale Affennierenzellen (FRhK-4) wurden in minimalem essentiellem Medium (MEM, Gibco, USA) mit 10 % fötalem Kälberserum und Penicillin-Streptomycin (Gibco, USA) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert und für die Anzucht von Stammviren und für die Titration der viralen Infektiosität verwendet.
2.2. Herstellung des Stammvirus
Das Stammvirus wurde geerntet, wenn etwa 75 % der Zellmonolayer eines virusinfizierten Kolbens einen zytopathischen Effekt (CPE) zeigten. Infizierte Zellen wurden einem Zyklus von Einfrieren und Auftauen unterzogen und 20 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und der Kulturüberstand wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
2.3. Bestimmung der Gewebekultur-Infektionsdosis (50%) (TCID50)
96-Well-Mikrotiterplatten, die 100 μL konfluierende FRhK-4 enthielten, wurden mit 100 μL seriellen 10-fachen Verdünnungen des Stammvirus in minimalem essentiellem Medium mit 1% FCS (Erhaltungsmedium) beginnend von 10-1 bis 108 infiziert. Die Titrationen wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt. Die infizierten Zellen wurden 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Das Auftreten von CPE wurde täglich erfasst. Die TCID50 wurde nach der Methode von Reed und Muench bestimmt.
2.4. Auswirkung von Trocknung, Wärme und relativer Luftfeuchtigkeit
Zehn Mikroliter des Erhaltungsmediums, das 107 TCID50 pro ml Virus enthält, wurden in einzelne Vertiefungen einer Kunststoffplatte mit 24 Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur (22~25°C) und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-50% (d.h. Bedingungen, die in einem typischen klimatisierten Raum herrschen) trocknen gelassen. Einhundert Mikroliter MM wurden verwendet, um das Virus nach 0 Stunden, 3 Stunden, 7 Stunden, 11 Stunden, 13 Stunden, 24 Stunden und bis zu 4 Wochen zu resuspendieren, und die Restvirusinfektiosität wurde titriert. Kontrollen in geschlossenen Eppendorf-Röhrchen mit Schraubverschluss wurden jedes Mal mit einbezogen und ähnlich behandelt, aber nicht getrocknet.
Das Experiment wurde bei verschiedenen Temperaturen (38°C, 33°C, 28°C) und relativen Luftfeuchtigkeiten (>95%, 80~89%) für 3 h, 7 h, 11 h, 13 h und 24 h wiederholt. Ein Vernebler wurde unter kontrollierten Bedingungen verwendet, um eine Umgebung mit hoher und relativ niedriger Luftfeuchtigkeit zu erzeugen. Alle oben genannten Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt und die verbleibende virale Infektiosität wurde titriert.
2.5. Infektiositätsassay
Die Infektiosität des Restvirus wurde in vierfacher Ausführung auf 96-Well-Mikrotiterplatten titriert, die 100 μl konfluente FRhK-4-Zellen enthielten. 100 μl serielle 10-fache Verdünnungen des Virus im Erhaltungsmedium, beginnend mit 10-1 bis 108, wurden den FRhK-4-Zellen zugesetzt. Die infizierten Zellen wurden 4 Tage lang bei 37 °C bebrütet. Das Auftreten von CPE wurde täglich erfasst. Die TCID50 wurde nach der Methode von Reed und Muench bestimmt.
3. Ergebnisse
Zehn Mikroliter von 107 TCID50 pro mL Virus wurden in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Plastikplatte (die eine nicht poröse Oberfläche darstellt) gegeben und getrocknet. Das getrocknete Virus wurde dann bei verschiedenen Temperaturen (38°C, 33°C, 28°C) und unterschiedlicher relativer Luftfeuchtigkeit (>95%, 80~89%) für 3 Std., 7 Std., 11 Std., 13 Std. und 24 Std. bebrütet und die verbleibende virale Infektiosität wurde titriert. Ein ähnlicher Versuch wurde bei Raumtemperatur und einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 40-50 % (klimatisierter Raum) bis zu 4 Wochen lang durchgeführt. Auf Kunststoff getrocknete Viren behielten ihre Lebensfähigkeit bis zu 5 Tage lang bei 22~25°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40~50% bei, wobei nur der Titer abnahm (Abbildung 1). Danach geht die Virusinfektiosität mit der Zeit allmählich verloren. Der Verlust der Virusinfektiosität in Lösung war im Allgemeinen ähnlich wie bei getrocknetem Virus unter diesen Umweltbedingungen. Dies deutet darauf hin, dass SARS CoV ein stabiles Virus ist, das potenziell durch indirekten Kontakt oder Fomite übertragen werden kann, insbesondere in klimatisierten Umgebungen.
Restliche Virusinfektiosität bei 22-25°C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-50% (Ausgangstiter 105/10 μL) und bei 33°C oder 38°C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit >95%.
Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit (>95%) bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen (28°C und 33°C) hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Virusinfektiosität (Abbildung 2(a)). Eine hohe Temperatur (38°C) bei 80-90% relativer Luftfeuchtigkeit führte zu einem Titerverlust von 0,25~2 nach 24 Stunden (Abbildung 2(b)). Wurde das getrocknete Virus jedoch bei hoher Temperatur (38°C) und hoher relativer Luftfeuchtigkeit (>95%) gelagert, kam es im Vergleich zu hoher Temperatur (38°C) bei niedrigerer relativer Luftfeuchtigkeit (80-90%) zu einem weiteren Titerverlust von ~1,5 für jeden Zeitpunkt bis zu 24 Stunden (0,38~3,38 ) (Abbildungen 3(a)-3(c)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Infektiosität des SARS-Coronavirus (105/10 μL) bei verschiedenen Temperaturen bei (a) >95% relativer Luftfeuchtigkeit, (b) >80-89%.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Infektiosität des SARS-Coronavirus (Ausgangstiter 105/10 μL) bei unterschiedlicher relativer Luftfeuchtigkeit bei (a) 38°C, (b) 33°C, und (c) 28°C.
4. Diskussion
Viren vermehren sich nicht außerhalb lebender Zellen, aber infektiöse Viren können auf kontaminierten Oberflächen in der Umwelt persistieren, und die Dauer der Persistenz lebensfähiger Viren wird deutlich von Temperatur und Luftfeuchtigkeit beeinflusst. Es ist bekannt, dass kontaminierte Oberflächen bei der Übertragung von Infektionen sowohl im Krankenhaus als auch in der Gemeinschaft eine wichtige Rolle spielen. Die Rolle von Fomiten bei der Übertragung von RSV wurde eindeutig nachgewiesen. Das Überleben von Viren auf einer Vielzahl von Trägermaterialien wurde für Influenzaviren, Paramyxoviren, Pockenviren und Retroviren untersucht. Das humane Coronavirus, das mit der Erkältung in Verbindung gebracht wird, bleibt Berichten zufolge nach dem Trocknen nur 3 Stunden lang auf Umgebungsoberflächen lebensfähig, obwohl es in flüssiger Suspension viele Tage lang lebensfähig bleibt. Parainfluenza- und RSV-Viren waren nach dem Trocknen auf Oberflächen für 2 bzw. 6 Stunden lebensfähig. In aerosolierter Form ist das humane Coronavirus 229E bei hoher Luftfeuchtigkeit generell weniger stabil. Die Umweltstabilität von SCoV war bisher nicht bekannt, und diese Information ist für das Verständnis der Übertragungsmechanismen dieses Virus im Krankenhaus und in der Gemeinde von großer Bedeutung.
In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass SARS-CoV mindestens zwei Wochen nach dem Trocknen bei Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in einer klimatisierten Umgebung überleben kann. Das Virus ist bei Raumtemperatur in einer flüssigen Umgebung drei Wochen lang stabil, wird aber durch 15-minütige Erhitzung auf 56 °C leicht abgetötet. Dies deutet darauf hin, dass das SARS-CoV ein stabiles Virus ist, das potenziell durch indirekten Kontakt oder über Ansteckungsstoffe übertragen werden kann. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass kontaminierte Oberflächen eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Infektion im Krankenhaus und in der Gemeinschaft spielen.
Unsere Studien deuten darauf hin, dass SCoV relativ stabiler ist als die humanen Coronaviren 229E oder OC43 und einige andere virale Erreger der Atemwege wie das Respiratorische Synzytialvirus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Tröpfchenübertragung zwar ein wichtiger Übertragungsweg ist, dass aber auch Fomite und Umweltkontamination bei der Virusübertragung eine wichtige Rolle spielen können. Insbesondere können Fomite zur fortgesetzten Übertragung von Infektionen in der nosokomialen Umgebung beitragen, die trotz der großen Aufmerksamkeit und der strengen Vorsichtsmaßnahmen zur Verhinderung der Tröpfchenübertragung weiterhin stattfindet. Zusätzlich zu den Tröpfchenvorkehrungen sind verstärkte Kontaktvorkehrungen und Händewaschen erforderlich.
Die fäkale Kontamination des SCoV-Coronavirus kann somit ein wirksamer Übertragungsweg für die Krankheit sein. Der Ausbruch in Amoy Garden in Hongkong, bei dem über 300 Bewohner eines Wohnblocks betroffen waren, wurde vermutlich durch kontaminiertes Abwasser übertragen. Die Stabilität des Virus auf Oberflächen in der Umwelt und sein Vorhandensein in Fäkalien deutet darauf hin, dass fäkale Verunreinigungen bei der Produktion von frischen Lebensmitteln eine Gefahr für die Übertragung des Virus darstellen können, insbesondere in Ländern mit schlechten sanitären Einrichtungen und Abwasserentsorgungssystemen, und dass Studien erforderlich sind, um diese Möglichkeit zu untersuchen.
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass eine hohe Temperatur bei hoher relativer Luftfeuchtigkeit einen synergistischen Effekt auf die Inaktivierung der Lebensfähigkeit von SARS CoV hat, während niedrigere Temperaturen und niedrige Luftfeuchtigkeit ein längeres Überleben des Virus auf kontaminierten Oberflächen unterstützen. Die Umweltbedingungen in Ländern wie Malaysia, Indonesien und Thailand sind daher für ein längeres Überleben des Virus nicht förderlich. In Ländern wie Singapur und Hongkong, in denen Klimaanlagen intensiv genutzt werden, fand die Übertragung hauptsächlich in gut klimatisierten Umgebungen wie Krankenhäusern oder Hotels statt. Außerdem hat eine separate Studie gezeigt, dass während der Epidemie das Risiko einer erhöhten täglichen Inzidenz von SARS an Tagen mit niedrigerer Lufttemperatur 18,18-mal höher war als an Tagen mit höherer Temperatur in Hongkong und anderen Regionen. Zusammengenommen können diese Beobachtungen erklären, warum es in einigen asiatischen Ländern in tropischen Gebieten (mit hohen Temperaturen und hoher relativer Luftfeuchtigkeit) wie Malaysia, Indonesien und Thailand nicht zu nosokomialen Ausbrüchen von SARS kam (Tabellen 1 und 2(a)-2(c)). Dies könnte auch erklären, warum in Singapur, das ebenfalls in einem tropischen Gebiet liegt (Tabelle 2(d)), die meisten SARS-Ausbrüche in Krankenhäusern (klimatisierte Umgebung) auftraten. Interessanterweise hielten die Ärzte während des Ausbruchs von SARS in Guangzhou die Fenster der Patientenzimmer offen und lüfteten gut, was die Überlebensrate des Virus und damit die nosokomiale Übertragung verringert haben könnte. Das SARS-CoV kann seine Infektiosität bis zu zwei Wochen lang bei niedriger Temperatur und geringer Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten, was die Virusübertragung in der Gemeinschaft erleichtern könnte, wie in Hongkong, das in einem subtropischen Gebiet liegt (Tabelle 2(e)). Andere Umweltfaktoren wie Windgeschwindigkeit, tägliche Sonneneinstrahlung und Luftdruck, die nachweislich mit der SARS-Epidemie in Zusammenhang stehen, sollten ebenfalls berücksichtigt werden. An der Dynamik der SARS-Epidemie sind mehrere Faktoren beteiligt, darunter die physikalischen Eigenschaften des Virus, die Außen- und Innenumgebung, die Hygiene, der Raum und die genetischen Prädispositionen. Das Verständnis der Stabilität von Viren unter verschiedenen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen ist wichtig für das Verständnis der Übertragung neuartiger Infektionserreger, einschließlich der jüngsten Grippe-Apandemie H1N12009.
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| *Daten sind auf der BBC-Wetter-Website (http://www.bbc.co.uk/weather/world/city_guides/results) verfügbar. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.