Wpływ temperatury i wilgotności względnej na żywotność koronawirusa SARS

Abstrakt

Przyjęto, że główną drogą przenoszenia zakażenia SARS CoV są kropelki oddechowe. Jednak wirus jest również wykrywalny w innych płynach ustrojowych i wydalinach. Badano stabilność wirusa w różnych temperaturach i wilgotności względnej na gładkich powierzchniach. Wysuszony wirus na gładkich powierzchniach zachowywał żywotność przez ponad 5 dni w temperaturze 22-25°C i wilgotności względnej 40-50%, czyli w typowym środowisku klimatyzowanym. Jednakże żywotność wirusa była szybko tracona (>3 log10) w wyższych temperaturach i przy wyższej wilgotności względnej (np. 38°C i wilgotności względnej >95%). Lepsza stabilność koronawirusa SARS w niskiej temperaturze i środowisku o niskiej wilgotności może ułatwiać jego transmisję w społeczności w obszarze subtropikalnym (takim jak Hong Kong) w okresie wiosennym i w środowiskach klimatyzowanych. Może to również wyjaśniać, dlaczego niektóre kraje azjatyckie w obszarze tropikalnym (takie jak Malezja, Indonezja lub Tajlandia) z wysoką temperaturą i wysoką wilgotnością względną środowiska nie miały poważnych ognisk SARS.

1. Wprowadzenie

Sever acute respiratory syndrome (SARS), był nową pojawiającą się chorobą związaną z ciężkim zapaleniem płuc i rozprzestrzeniał się obejmując ponad 30 krajów na 5 kontynentach w 2003 roku. Jako jej przyczynę zidentyfikowano nowy koronawirus. SARS miał dramatyczny wpływ na usługi opieki zdrowotnej i gospodarki krajów dotkniętych chorobą, a ogólny wskaźnik śmiertelności szacowany był na 9%, ale wzrastał do 50% u osób w wieku 60 lat lub starszych. Znamienną cechą tej choroby było jej upodobanie do przenoszenia się w placówkach służby zdrowia oraz na bliskie kontakty rodzinne i społeczne. Przypuszcza się, że choroba rozprzestrzenia się drogą kropelkową, przez bliski kontakt bezpośredni lub pośredni, ale względne znaczenie tych dróg przenoszenia jest obecnie niejasne. W jednym z badań wykazano, że możliwe jest wytwarzanie aerozolu wirusowego przez pacjenta z SARS, a zatem przenoszenie drogą kropelkową przez powietrze jest możliwą drogą przenoszenia. Jednakże rola fomitów i skażenia środowiska w przenoszeniu infekcji jest obecnie nadal niejasna. Ognisko choroby dotykające ponad 300 mieszkańców wieżowca (Amoy Gardens) w Hongkongu nie mogło być wyjaśnione przez przenoszenie drogą kropelkową od zakażonych pacjentów. Wirus zakaźny jest wykrywalny w kale, a aerozolizacja wirusa w skażonym kale jest uważana za sposób przenoszenia tej epidemii.

My i inni zgłosiliśmy, że zakaźność SARS CoV (koronawirus SARS) została utracona po podgrzaniu w temperaturze 56°C przez 15 minut, ale że był stabilny przez co najmniej 2 dni po wysuszeniu na plastiku. Był on całkowicie inaktywowany przez powszechnie stosowane w laboratorium utrwalacze. Inne badanie wykazało, że był on inaktywowany przez światło ultrafioletowe, warunki alkaliczne () lub kwaśne () . Wykazano, że ludzkie koronawirusy mogą przetrwać w PBS lub podłożu hodowlanym z 5-10% FCS przez kilka dni, ale przeżywają tylko kilka godzin po wysuszeniu. Istnieją pewne badania donoszące o związku między wybuchem SARS, czynnikami metrologicznymi i zanieczyszczeniem powietrza. Dlatego informacje na temat przeżywalności koronawirusa SARS (SCoV) w środowisku w różnych warunkach temperatury i wilgotności mają istotne znaczenie dla zrozumienia transmisji wirusa. W ostatnim badaniu z wykorzystaniem zastępczych koronawirusów (transmissible gastroenteritis virus (TGEV) i mouse hepatitis virus (MHC)) zbadano wpływ temperatury powietrza i wilgotności względnej na przeżywalność koronawirusów na powierzchni . Wpływ tych czynników środowiskowych na przeżywalność koronawirusa SARS pozostaje niejasny. W obecnym badaniu donosimy o stabilności koronawirusa SARS w różnych temperaturach i wilgotności względnej.

2. Materiał i Metody

2.1. Virus Strain and Cell Line

Stosowany w tym badaniu szczep SARS CoV to HKU39849. Płodowe komórki małpiej nerki (FRhK-4) hodowano w minimalnej pożywce podstawowej (MEM, Gibco, USA) z 10% płodową surowicą cielęcą i streptomycyną penicylinową (Gibco, USA) w temperaturze 37°C w 5% CO2 i używano do hodowania wirusa podstawowego oraz do miareczkowania zakaźności wirusa.

2.2. Preparation of Stock Virus

Stock virus was harvested when infection approximately 75% of the cell monolayer of a virus infected flask manifested cytopathic effect (CPE). Zakażone komórki poddawano jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania, odwirowywano przy 2000 obr/min przez 20 minut w celu usunięcia resztek komórkowych, a supernatant hodowlany pobierano w odpowiedniej ilości i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu użycia.

2.3. Oznaczanie dawki zakaźnej w kulturze tkankowej (50%) (TCID50)

96-dołkowych płytek mikromiareczkowych zawierających 100 μL zlewnych FRhK-4 zakażano 100 μL seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wirusa wyjściowego w minimalnej pożywce podstawowej z 1% FCS (pożywka konserwująca), zaczynając od 10-1 do 108. Miareczkowanie przeprowadzono w czterech powtórzeniach. Zainfekowane komórki inkubowano przez 4 dni w temperaturze 37°C. Pojawienie się CPE rejestrowano codziennie. TCID50 oznaczano zgodnie z metodą Reeda i Muencha.

2.4. Effect of Drying, Heat, and Relative Humidity

Dziesięć mikrolitrów podłoża konserwującego zawierającego 107 TCID50 na mL wirusa umieszczano w poszczególnych studzienkach plastikowych płytek z 24 studzienkami i pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (22~25°C) i wilgotności względnej 40-50% (tj. w warunkach panujących w typowym klimatyzowanym pomieszczeniu). Sto mikrolitrów MM używano do ponownego zawieszenia wirusa po 0 godz., 3 godz., 7 godz., 11 godz., 13 godz., 24 godz. i do 4 tygodni, a następnie miareczkowano zakaźność resztkową wirusa. Kontrole w zamkniętych zakręcanych probówkach eppendorfa były włączane za każdym razem i traktowane podobnie, ale bez suszenia.

Doświadczenie powtarzano w różnych temperaturach (38°C, 33°C, 28°C) i wilgotnościach względnych (>95%, 80~89%) przez 3 hr, 7 hr, 11 hr, 13 hr i 24 hr. Nebulizator w kontrolowanych warunkach był używany do generowania środowiska o wysokiej i względnej niskiej wilgotności. Wszystkie powyższe eksperymenty przeprowadzono w dwóch egzemplarzach i miareczkowano pozostałą infekcyjność wirusa.

2.5. Infectivity Assay

Zakaźność resztkowego wirusa miareczkowano poczwórnie na 96-studzienkowych płytkach mikromiareczkowych zawierających 100 μL zlewnych komórek FRhK-4. Do komórek FRhK-4 dodawano 100 μl seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wirusa w pożywce konserwującej, począwszy od 10-1 do 108. Zakażone komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 dni. Pojawienie się CPE rejestrowano codziennie. TCID50 oznaczano zgodnie z metodą Reeda i Muencha.

3. Wyniki

Dziesięć mikrolitrów 107 TCID50 na mL wirusa umieszczano w poszczególnych studzienkach plastikowej płytki 24-studzienkowej (reprezentującej nieporowatą powierzchnię) i suszono. Wysuszony wirus był następnie inkubowany w różnych temperaturach (38°C, 33°C, 28°C) przy różnej wilgotności względnej (>95%, 80~89%) przez 3 h, 7 h, 11 h, 13 h i 24 h, a następnie miareczkowano pozostałą zakaźność wirusa. Podobny eksperyment przeprowadzono w temperaturze pokojowej i wilgotności względnej około 40-50% (pomieszczenie klimatyzowane) przez okres do 4 tygodni. Wirus wysuszony na plastiku zachowywał żywotność do 5 dni w temperaturze 22~25°C przy wilgotności względnej 40~50%, jedynie z utratą miana (Rysunek 1). Po tym czasie zakaźność wirusa jest stopniowo tracona. Utrata zakaźności wirusa w roztworze była ogólnie podobna do wysuszonego wirusa w tych warunkach środowiskowych. Wskazuje to, że SARS CoV jest stabilnym wirusem, który może być potencjalnie przenoszony przez kontakt pośredni lub fomity, szczególnie w środowiskach klimatyzowanych.

Rycina 1

Zakaźność resztkowa wirusa w 22-25°C przy wilgotności względnej 40-50% (miano początkowe 105/10 μL) i w 33°C lub 38°C przy wilgotności względnej >95%.

Wysoka wilgotność względna (>95%) w stosunkowo niskiej temperaturze (28°C i 33°C) nie wpływała znacząco na zakaźność wirusa (Rysunek 2(a)). Wysoka temperatura (38°C) przy wilgotności względnej 80-90% prowadziła do utraty miana o 0,25~2 w ciągu 24 godzin (Rysunek 2(b)). Jednakże, jeśli wysuszony wirus był przechowywany w wysokiej temperaturze (38°C) i wysokiej wilgotności względnej (>95%), nastąpiła dalsza ~1,5 utrata miana dla każdego punktu czasowego do 24 h (0,38~3,38 ) w porównaniu z wysoką temperaturą (38°C) przy niższej wilgotności względnej 80-90% (Rysunki 3(a)-3(c)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 2

Infekcyjność koronawirusa SARS (105/10 μL) w różnych temperaturach przy (a) >95% wilgotności względnej, (b) >80-89%.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Rysunek 3

Infekcyjność koronawirusa SARS (miano początkowe 105/10 μL) przy różnej wilgotności względnej w (a) 38°C, (b) 33°C, i (c) 28°C.

4. Dyskusja

Wirusy nie replikują się poza żywą komórką, ale zakaźny wirus może utrzymywać się na skażonych powierzchniach środowiskowych, a na czas utrzymywania się zdolnego do życia wirusa ma znaczący wpływ temperatura i wilgotność. Wiadomo, że zanieczyszczone powierzchnie są znaczącymi wektorami w przenoszeniu zakażeń w środowisku szpitalnym, jak również w społeczności. Rola fomitów w przenoszeniu RSV została wyraźnie wykazana. Przeżywalność wirusów na różnych powierzchniach była badana dla wirusów grypy, paramyksowirusów, poxwirusów i retrowirusów. Stwierdzono, że ludzki koronawirus związany ze zwykłym przeziębieniem pozostaje żywy tylko przez 3 godziny na powierzchniach środowiskowych po wysuszeniu, chociaż pozostaje żywy przez wiele dni w płynnej zawiesinie. Wirusy parainfluenzy i RSV były żywotne po wysuszeniu na powierzchniach odpowiednio przez 2 i 6 godzin. W postaci aerozolowej ludzki koronawirus 229E jest ogólnie mniej stabilny w wysokiej wilgotności . Stabilność środowiskowa SCoV była wcześniej nieznana, a informacja ta jest niewątpliwie ważna dla zrozumienia mechanizmów przenoszenia tego wirusa w warunkach szpitalnych i środowiskowych.

W obecnym badaniu wykazaliśmy, że SARS CoV może przetrwać co najmniej dwa tygodnie po wysuszeniu w warunkach temperatury i wilgotności występujących w klimatyzowanym środowisku. Wirus jest stabilny przez 3 tygodnie w temperaturze pokojowej w środowisku płynnym, ale jest łatwo zabijany przez ogrzewanie w temperaturze 56°C przez 15 minut. Wskazuje to, że SARS CoV jest stabilnym wirusem, który może być potencjalnie przenoszony przez kontakt pośredni lub fomity. Wyniki te mogą wskazywać, że zanieczyszczone powierzchnie mogą odgrywać główną rolę w przenoszeniu infekcji w szpitalu i społeczności.

Nasze badania wskazują, że SCoV jest stosunkowo bardziej stabilny niż ludzkie koronawirusy 229E lub OC43 i niektóre inne wirusowe patogeny układu oddechowego, takie jak wirus syncytialny układu oddechowego. Wyniki te sugerują, że podczas gdy bezpośrednie przenoszenie drogą kropelkową jest ważną drogą przenoszenia, rola fomitów i skażenia środowiska w przenoszeniu wirusa może odgrywać znaczącą rolę w przenoszeniu wirusa. W szczególności, fomity mogą przyczyniać się do ciągłego przenoszenia infekcji w środowisku szpitalnym, które nadal występuje pomimo dużej uwagi i rygorystycznych środków ostrożności podjętych w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się kropli. Oprócz środków ostrożności dotyczących kropli, należy wzmocnić środki ostrożności dotyczące kontaktu i mycia rąk.

Zanieczyszczenie kałem koronawirusa SCoV może być zatem skuteczną drogą przenoszenia choroby. Uważa się, że epidemia w Amoy Garden w Hong Kongu, która dotknęła ponad 300 mieszkańców bloku mieszkalnego, została przeniesiona przez skażone ścieki. Stabilność wirusa na powierzchniach środowiska i jego obecność w odchodach wskazuje na możliwość, że skażenie odchodami produkcji świeżej żywności może stanowić zagrożenie dla przenoszenia wirusa; szczególnie w krajach o złych warunkach sanitarnych i systemach odprowadzania ścieków oraz że potrzebne są badania w celu uwzględnienia tej możliwości.

W tym badaniu wykazaliśmy, że wysoka temperatura przy wysokiej wilgotności względnej ma synergistyczny wpływ na inaktywację żywotności SARS CoV, podczas gdy niższe temperatury i niska wilgotność wspierają przedłużone przeżycie wirusa na skażonych powierzchniach. Warunki środowiskowe w krajach takich jak Malezja, Indonezja i Tajlandia nie sprzyjają zatem przedłużonemu przeżyciu wirusa. W krajach takich jak Singapur i Hong Kong, gdzie intensywnie korzysta się z klimatyzacji, do transmisji dochodziło głównie w dobrze klimatyzowanych pomieszczeniach, takich jak szpitale czy hotele. Ponadto odrębne badanie wykazało, że podczas epidemii ryzyko zwiększonej dziennej zachorowalności na SARS było 18,18 razy wyższe w dniach o niższej temperaturze powietrza niż w dniach o wyższej temperaturze w Hongkongu i innych regionach. Obserwacje te mogą wyjaśniać, dlaczego w niektórych krajach azjatyckich położonych w strefie tropikalnej (o wysokiej temperaturze i wysokiej wilgotności względnej), takich jak Malezja, Indonezja i Tajlandia, nie wystąpiły szpitalne ogniska SARS (tabele 1 i 2(a)-2(c)). Może to również wyjaśniać, dlaczego Singapur, który również znajduje się w strefie tropikalnej (Tabela 2(d)), miał większość ognisk SARS w szpitalach (środowisko klimatyzowane). Co ciekawe, podczas wybuchu SARS w Guangzhou lekarze utrzymywali otwarte okna w pokojach pacjentów i dobrze je wietrzyli, co mogło zmniejszyć przeżywalność wirusa, a tym samym ograniczyć transmisję szpitalną. SARS CoV może zachować zakaźność do 2 tygodni w środowisku o niskiej temperaturze i wilgotności, co może ułatwiać transmisję wirusa w społeczności, tak jak w Hong Kongu, który znajduje się w strefie subtropikalnej (Tabela 2(e)). Należy również wziąć pod uwagę inne czynniki środowiskowe, w tym prędkość wiatru, dzienne nasłonecznienie i ciśnienie powietrza, które okazały się być związane z epidemią SARS. Dynamika epidemii SARS obejmuje wiele czynników, w tym właściwości fizyczne wirusa, środowisko zewnętrzne i wewnętrzne, higienę, przestrzeń i predyspozycje genetyczne. Zrozumienie stabilności wirusów w różnych warunkach temperatury i wilgotności jest ważne w zrozumieniu transmisji nowego czynnika zakaźnego, w tym niedawnej apandemii grypy H1N12009.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

.