2 Lebensgeschichte
FBF-Zerkarien sind winzig, morphologisch schwer zu identifizieren und haben typischerweise eine extrem niedrige Prävalenz der Infektion unter wirbellosen Zwischenwirtspopulationen (Cribb et al., 2011). Vielleicht ist dies der Grund dafür, dass die Zwischenwirte für alle bis auf einige wenige FBF-Arten unbekannt sind: mehrere Arten der Süßwasser-Gattung Sanguinicola (siehe Bullard und Overstreet, 2008) und die marinen Arten Aporocotyle simplex (siehe Køie, 1982; Køie und Petersen, 1988, experimentelle Infektionen; keine molekularen Marker verwendet), Paracardicoloides yamagutii (siehe Nolan und Cribb, 2004a; siehe nachfolgenden Text), C. forsteri (siehe Cribb et al., 2011; siehe nachfolgender Text) und Cardicola opisthorchis (siehe Sugihara et al., 2014; siehe nachfolgender Text). ITS2 rDNA-Sequenzen wurden verwendet, um morphologisch unbestimmte larvale FBF-Exemplare, d. h. Zerkarien, Sporozysten und Redien, die von wirbellosen Wirten gesammelt wurden, mit morphologisch unterscheidbaren erwachsenen Exemplaren von sympatrischen Fischwirten zu vergleichen. Molekulare Marker ermöglichen schnell und kostengünstig den Nachweis von Infektionen, die Identifizierung des infektiösen Erregers durch phylogenetische Schlussfolgerungen oder durch Sequenzhomologie mit einem bereits sequenzierten Taxon und die Identifizierung von Zwischenwirten, wodurch die Lebensstadien potenziell pathogener FBF miteinander verbunden werden. Die Bestimmung der Identität von Zwischen- und Endwirten ist zweifellos ein wichtiger erster Schritt zum Verständnis des Lebenszyklus von FBF. Über diagnostische Ansätze hinaus bleibt jedoch noch viel über die spezifischen Details der Wirts-Parasiten-Beziehung zwischen FBFs und ihren Polychaeten-, Gastropoden- und Muschel-Zwischenwirten zu lernen. Schließlich könnte ihre Evolutionsgeschichte von diesen Zwischenwirten ebenso stark oder sogar stärker beeinflusst werden als von ihren Endwirten. Wir argumentieren daher, dass molekulare Studien die klassischen experimentellen Studien nicht vollständig ersetzen sollten, die direkte mikroskopische Beobachtungen von larvalen und adulten FBFs in Wirtsgeweben nach der Exposition von naiven wirbellosen und endgültigen Fischwirten vornehmen (Køie, 1982).
Ein Großteil der Informationen über die Lebenszyklen von FBFs stammt aus Gesundheitsprogrammen für Wassertiere in Verbindung mit kommerzieller Aquakultur: 17 von 109 (16 %) der in der GenBank verfügbaren FBF-Sequenzen stammen von Infektionen in der marinen Aquakultur (Tabelle 1.1). FBF sind eine der wenigen Trematodengruppen, deren Mitglieder den endgültigen Fischwirt schädigen können: als adulte Tiere, die Blutgefäße verstopfen und Asphyxie verursachen, als Eier, die Kiemenepithelien und Astialgefäße schädigen oder verstopfen, und als Miracidien, die aus Eiern schlüpfen, die im Kiemenepithel eingebettet sind und sich aus dem Fisch herausbohren (Bullard und Overstreet, 2002, 2008). Ihre Lebenszyklen sind daher für kommerzielle Aquakulturbetriebe von Bedeutung, da FBF Fische töten oder schwächen und wirtschaftliche Verluste in Süßwasserteichen, Zuchtanlagen und Hochseekäfigen verursachen können. Sequenzen, die von nicht erwachsenen FBF stammen, die Schnecken-, Muschel- und Polychaeten-Wirte infizieren, die asexuelle Fortpflanzungsstadien von FBF beherbergen – Sporozysten, Redien und Zerkarien – sind weit weniger zahlreich (4 von 109) (Tabelle 1.1) als die von erwachsenen Exemplaren, die Fischwirte infizieren.
In der ersten veröffentlichten Studie über den Lebenszyklus von FBF, die durch die Anwendung einer molekularen Methode bestimmt wurde, dokumentierten Nolan und Cribb (2004a) zwei Zerkarien-Morphotypen („Typ A“ und „Typ B“), die 80 von 11.314 (0,7 %) Exemplaren der hydrobiiden Schnecke Posticobia brazieri in den Gezeitenbächen von Queensland, Australien, infizierten. Die ITS2 rDNA-Sequenzen von Zerkarien des Typs A stimmten zu 100 % mit denen adulter Exemplare von P. yamagutii überein, die aus dem Blut (dorsale Aorta, Atrium, Ventrikel, Kiemen, Niere und Blutgefäße des Darms und der Schwimmblase) von gefleckten Langflossenaalen Anguilla reinhardtii gewonnen wurden. In einer anderen Studie untersuchten Cribb et al. (2011) 9351 Individuen aus 11 Muschel-, 2 Gastropoden- und 24 Polychaetenfamilien auf FBF-Infektionen, um auf die Besorgnis über Krankheiten zu reagieren, die mit Infektionen von C. forsteri bei gezüchteten südlichen Blauflossen-Thunfischen T. maccoyii vor Südaustralien in Zusammenhang stehen. Die ITS2 rDNA-Sequenzdaten von Zerkarien, die Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) infiziert hatten, stimmten zu 100 % mit adulten Exemplaren von C. forsteri aus dem Herzen eines nahegelegenen südlichen Blauflossenthunfischs in einem Netzgehege in Port Lincoln, Australien, überein. Sie sequenzierten auch das 28S rDNA-Fragment (721 bp in der D1-D2-Region) von Zerkarien von C. forsteri, die L. modestus infizierten. Dem Ansatz von Cribb et al. (2011) folgend, konzentrierten sich Sugihara et al. (2014) auf Polychaeten, während sie 744 wirbellose Tiere auf FBF-Infektionen in einer Zuchtstätte des pazifischen Roten Thunfischs Thunnus orientalis vor Südjapan untersuchten. Sporozysten und Zerkarien von FBF wurden in fünf Individuen einer Terebelliden-Polychaete (Terebella) gefunden, die aus der Schale von toten Seepocken gesammelt wurden, die vom Substrat und von Seilen und Schwimmern unter dem Seekäfig stammen. Die ITS2- und 28S-Sequenzen von Sporozysten waren identisch (100 %) mit denen von adulten C. opisthorchis aus dem Herzen von gezüchtetem pazifischen Blauflossenthun.
Shirakashi et al. (2012) untersuchten gleichzeitige Infektionen von Cardicola orientalis und C. opisthorchis bei pazifischem Blauflossenthun. Sie verwendeten ITS2 rDNA-Sequenzdaten, um die sichelförmigen Eier von C. opisthorchis in der afferenten Filamentarterie von den eiförmigen Eiern von C. orientalis zu unterscheiden, die die Kiemenlamellen infizieren. Sie stellten fest, dass artspezifische PCR-Primer, die auf Kiemengewebeproben angewendet werden, die Histopathologie ergänzen und dabei helfen können, Infektionen zu diagnostizieren, bevor die Eier und adulten Tiere zahlreich genug sind, um mit dem Lichtmikroskop beobachtet zu werden. Yong et al. (2013) verwendeten vollständige ITS2 rDNA-Sequenzdaten, um die in den Kiemen von fünf Arten von Falterfischen (Perciformes: Chaetodontidae) aus dem Great Barrier Reef befindlichen FBF-Eier als eine einzige Art Cardicola chaetodontis zu identifizieren (ein einziges Basenpaar Unterschied in zwei Proben). FBF-Eier werden nicht selten im Kiemenepithel und in den Arteriolen von Fischen bei routinemäßigen Fischnekropsien beobachtet (SAB, persönliche Beobachtungen), aber in vielen Fällen werden entsprechende erwachsene Exemplare, die das Blut der einzelnen Fische infizieren, nicht gefunden. Molekulare Techniken, mit denen DNA aus den winzigen Eiern von FBF effektiv extrahiert und amplifiziert werden kann – die Eier von C. chaetodontis haben beispielsweise eine Gesamtlänge von 40-60 μm -, versprechen, das Vorhandensein unbenannter FBF-Arten und bisher nicht dokumentierter Wirte aufzudecken, wenn die resultierenden Sequenzen in einen phylogenetischen Zusammenhang mit Sequenzen von benannten Arten gestellt werden. Dasselbe gilt für Sequenzen, die von Zerkarien stammen (siehe nachfolgender Text). Mithilfe der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) identifizierten Norte Do Santos et al. (2012) die Eier von C. forsteri, die sich in den Kiemen von gezüchtetem Südlichen Blauflossenthun befanden. In ähnlicher Weise wendeten Kirchhoff et al. (2012) diese Methode an, um Eier von C. forsteri zu diagnostizieren, die T. maccoyii infizieren. Polinski et al. (2013) gingen noch einen Schritt weiter und entwickelten ein empfindliches und genaues Echtzeit-PCR-Verfahren, das auch für die Identifizierung von C. forsteri, C. orientalis und C. opisthorchis in nicht tödlichen Proben verwendet werden kann. Bei beiden getesteten Methoden, d. h. der SYBR-basierten qPCR und dem gemeinsamen Reporter-TaqMan-Assay, wurde keine artenübergreifende oder wirtsgenomische Amplifikation festgestellt; ihre kombinierte Anwendung verbesserte jedoch die Zuverlässigkeit bei der Differenzierung der Arten. Diese Methoden bestätigten gleichzeitige Infektionen mit C. forsteri und C. orientalis in T. maccoyii, was auch auf die höhere Prävalenz und Verbreitung von C. orientalis im Wirt hinweist.
Kürzlich wurde die Nützlichkeit der beiden entwickelten Techniken zur Bewertung der pathologischen Folgen von FBF-Infektionen bestätigt. Polinski et al. (2014) kombinierten qPCR mit der Immuntranskription von Wirtsgenen, um die Mengen an DNA aus Geweben zu quantifizieren, die mit C. opisthorchis und C. orientalis infiziert waren. Außerdem quantifizierten sie die zeitliche Immunreaktion des Wirts auf diese Infektionen bei eingesperrtem pazifischem Rotem Thun. Frühere Daten dokumentierten, dass adulte Tiere und Eier von C. orientalis in den Kiemen vorkommen (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), während adulte Tiere und Eier von C. opisthorchis das Herz bzw. die afferenten Astialarterien infizierten (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Die Ergebnisse von Polinski et al. (2014) zeigten jedoch eine Korrelation der IgM-Transkription mit den hohen Mengen von „C. orientalis only“-Infektionen im Kiemengewebe, nicht aber mit der DNA von C. opisthorchis, was darauf hindeutet, dass eine solche Immunreaktion in diesem Organ eher durch die Anwesenheit von adulten Tieren als von Eiern ausgelöst werden könnte. Darüber hinaus wurden hohe Mengen an DNA von C. orientalis im Herzen auf das Vorhandensein von juvenilen Egeln zurückgeführt. Obwohl mit solchen Methoden nicht festgestellt werden kann, in welchen Lebensstadien sich die FBF befinden und ob die Egel lebendig oder tot sind, ermöglicht dieser quantitative Ansatz Vermutungen über die Infektionsintensität und den Infektionsstatus, was wiederum ein vielversprechendes Instrument für künftige epidemiologische Studien mit Wild- oder Zuchtfischen darstellt.
Brant et al. (2006) verwendeten phylogenetische Schlussfolgerungen (28S, 18S und COI) bei der Behandlung mehrerer nicht identifizierter mutmaßlicher FBF-Zerkarien, die aus Gastropoden (Planorbidae und Thiaridae) in Uganda, Kenia und Australien isoliert wurden. Sie charakterisierten die Zerkarien morphologisch anhand von Mikroaufnahmen und anhand des Vorhandenseins bzw. Fehlens von Augenflecken, Flossenfalten am Zerkarienschwanz und -körper sowie der Schwanzform. Obwohl eine konsistente und phylogenetisch kohärente, auf der Morphologie basierende Definition (Diagnose) von FBF-Zerkarien fehlt, sind diese Zerkarien typischerweise unverwechselbar: winzig, mit Gabelschwanz, ohne ventralen Saugnapf, mit einem ausgeprägten Penetrationsorgan, das wahrscheinlich einen spezialisierten vorderen Saugnapf umfasst (Truong und Bullard, 2013), einer Flossenfalte am Zerkarienkörper und einer Flossenfalte, die an den Schwanzfurkae vorhanden ist oder fehlt (Cribb et al., 2011). Eine dieser Zerkarien (W5004) war morphologisch besonders bizarr, d. h. sie wurde als apharyngeat und furcocercous beschrieben, aber mit „extravaganten seitlichen Schwanzmembranen und einer spitzen Körperform“, und keine dieser Zerkarien wies alle typischen Merkmale von FBF-Zerkarien auf (siehe vorstehenden Text). Die kombinierte 18S- und 28S-Analyse dieser Zerkarien führte jedoch dazu, dass sie mit anderen FBF-Sequenzen geclustert wurden (wir nehmen an, dass „Sanguinicolid sp.“ zu „Sanguinicola cf. inermis“ (AY222180) gehört). Aus diesem Grund und weil sie im Vergleich zu bekannten FBF-Zerkarien morphologisch bizarr waren, stellten diese Autoren die These auf, dass es eine viel größere morphologische Vielfalt von FBF-Zerkarien gibt, als bisher in der Literatur anerkannt wurde. Die taxonomische Identität und die phylogenetische Bedeutung dieser Sequenzen werden weiter unten im Text diskutiert.