Todos los organismos vivos han desarrollado formas de protegerse contra los ataques abióticos y bióticos. Por ejemplo, los microbios utilizan sistemas de restricción/modificación del ADN para protegerse contra el ADN extraño; también contienen sistemas para desintoxicar y/o extruir xenobióticos o especies reactivas de oxígeno (ROS) excesivas. Los organismos pluricelulares utilizan otros sistemas, y a menudo intervienen uno o más niveles de inmunidad. El más estudiado y apreciado en los vertebrados con mandíbula es el sistema inmunitario adquirido/adaptativo, con sus conocidas células B y T y sus anticuerpos específicos contra antígenos. Este nivel de inmunidad se superpone al sistema inmunitario innato, mucho más fundamental y evolutivamente antiguo, que está presente no sólo en los mamíferos sino también en otros animales y en las plantas. Sólo en las últimas décadas se ha empezado a apreciar la importancia de la inmunidad innata para la supervivencia de los organismos multicelulares. Protege a los seres humanos, a otros animales y a las plantas de los miles de microbios potencialmente dañinos que se encuentran a diario. El desarrollo de la inmunidad innata en los organismos pluricelulares requirió la evolución de los receptores de la superficie celular que podían reconocer/ligar moléculas cuya estructura/patrón químico se conserva generalmente dentro de varias clases de organismos extraños pero está ausente en las moléculas «propias». Estas moléculas extrañas conservadas (no propias) se denominan patrones moleculares asociados a microbios (MAMP), también denominados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), y su presencia es detectada por los miembros de una gran familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Los PRR activan una o más vías de señalización, a menudo con la ayuda de correceptores, para inducir respuestas de defensa posteriores. Algunos ejemplos de MAMP son el lipopolisacárido bacteriano, la flagelina, el EF-Tu, el ADN, las lipoproteínas, los peptidoglicanos y la quitina fúngica. Existen varias revisiones excelentes sobre los MAMPs.
Además de las agresiones bióticas, los organismos deben hacer frente a una serie de agresiones abióticas, como los daños mecánicos o celulares, así como al estrés ambiental, como la sequía y la salinidad. Algunas moléculas endógenas activan el sistema inmunitario innato cuando se liberan en el espacio extracelular (incluido el apoplasto de la planta) desde su ubicación normal debido a un daño (trauma); estas moléculas se denominan patrones moleculares asociados a daños (DAMP). Los DAMPs son liberados pasivamente por las células moribundas debido a daños, traumatismos, isquemia o necrosis inducida por infecciones. Además, pueden ser secretados activamente por ciertas células inmunitarias o células gravemente estresadas (por ejemplo, ciertas células cancerosas). Mientras que los MAMP se derivan de los microorganismos y activan el sistema inmunitario innato, los DAMP se derivan de las células del huésped y tanto inician como perpetúan las respuestas inmunitarias innatas. En general, se acepta que estas defensas ayudan a proteger el tejido dañado, que es vulnerable a la infección debido a la interrupción de las barreras físicas que, de otro modo, impedirían la entrada de microbios. En los mamíferos, la inflamación es otro componente de la respuesta inmunitaria innata; no sólo ayuda a prevenir/suprimir la infección, sino que también contribuye a la curación.
Esta revisión se centrará en los DAMPs, particularmente los de las plantas. Los DAMPs se compararán con los MAMPs y con una clase recientemente identificada de activadores de la inmunidad innata denominada Patrones Moleculares Asociados a Nematodos (NAMPs) ya que las tres clases inducen muchas de las mismas respuestas de defensa y comparten algunos componentes de transducción de señales.
DAMPs de animales
Empezamos nuestra discusión con los DAMPs de animales ya que fueron reconocidos por primera vez y estudiados más extensamente. El término DAMPs fue acuñado por Seong y Matzinger en 2004. La Tabla 1 enumera 26 DAMPs, incluyendo purinas, pirimidinas, ADN (CpG no metilado), lipoproteínas de baja densidad oxidadas, péptidos N-formilo y una variedad de proteínas. Se han identificado los receptores de la mayoría de ellos (Tabla 1). Además, algunos DAMPs forman complejos con moléculas asociadas/interactores para mejorar o facilitar la señalización. Entre ellos está el High Mobility Group Box 1 (HMGB1), que es uno de los primeros DAMPs identificados y mejor caracterizados. HMGB1 es una proteína muy abundante, asociada a la cromatina, que está presente en todas las células animales. Consta de dos dominios básicos de unión al ADN, designados como cajas HMG A y B, y una cola C-terminal altamente ácida que participa en interacciones intramoleculares específicas . En el núcleo, la HMGB1 se une al surco menor del ADN para facilitar la condensación del ADN, la formación de nucleosomas y la unión de factores de transcripción. Cuando se libera en el medio extracelular a partir de células necróticas, dañadas o gravemente estresadas, funciona como un DAMP con actividades quimioatrayentes e inductoras de citoquinas .
El HMGB1 extracelular media una serie de respuestas biológicas en asociación con múltiples receptores como el receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE), el receptor tipo Toll 2 (TLR2), el TLR4, el TLR9, el receptor de quimioquinas C-X-C tipo 4 (CXCR4), el Siglec-10 y el receptor de inmunoglobulina de células T 3 (TIM3). En particular, la formación de heterocomplejos específicos entre HMGB1 y una variedad de interactores, como el adaptador MD-2 o los ligandos proinflamatorios lipopolisacáridos y oligodeoxinucleútidos CpG, mejora o facilita la señalización y, en algunos casos, es fundamental para el reconocimiento de HMGB1 por parte de distintos receptores (Tabla 1). La formación de heterocomplejos específicos parece estar regulada, al menos parcialmente, por los diferentes estados redox de la HMGB1, que en parte dependen de un enlace disulfuro intramolecular reversible formado entre los residuos de cisteína 23 y 45 . Estudios recientes han demostrado que la HMGB1 reducida forma un heterocomplejo con CXCL12, que promueve el reclutamiento de células inflamatorias en el tejido dañado a través del reconocimiento del receptor CXCR4 . El HMGB1 que contiene enlaces disulfuro se une específicamente a MD-2, lo que facilita el reconocimiento por parte de TLR4, dando lugar a la inducción de la activación transcripcional de citoquinas proinflamatorias mediada por NF-κB . El HMGB1 también interactúa con otros receptores, como el RAGE y el TLR2; actualmente no está claro si se requieren estados redox específicos para su reconocimiento por parte de estos receptores. Las diversas actividades, moléculas asociadas y receptores de HMGB1 probablemente explican sus múltiples funciones en muchas enfermedades humanas prevalentes y devastadoras.
Recientemente descubrimos que HMGB1 se une al ácido salicílico (SA); esto suprime tanto la actividad quimioatrayente de HMGB1 reducida como la capacidad de HMGB1 que contiene enlaces disulfuro para inducir la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias y COX-2 . Los sitios de unión a SA en HMGB1 se identificaron en los dominios HMG-box mediante estudios de RMN y se confirmaron mediante análisis mutacional. Una proteína HMGB1 mutada en uno de los sitios de unión a SA retuvo la actividad quimioatrayente, pero perdió la unión y la inhibición por SA, estableciendo así firmemente que la unión de SA a HMGB1 suprime directamente sus actividades proinflamatorias. También se identificaron derivados naturales y sintéticos de SA con una potencia mucho mayor para la inhibición de HMGB1, proporcionando así una prueba de concepto de que se pueden conseguir nuevas moléculas basadas en SA con una alta eficacia.
DAMPs de plantas
En contraste con los animales, hasta la fecha se han identificado muchos menos DAMPs en las plantas (Tabla 2). La clase más grande y posiblemente la mejor caracterizada son los polipéptidos producidos a partir de proteínas precursoras más grandes. Entre ellos se encuentran tres familias descubiertas por Ryan y sus colegas durante sus estudios para identificar la sistemina, un término «utilizado para describir las señales de defensa polipeptídicas que son producidas por la planta en respuesta al daño físico y que inducen genes de defensa, ya sea local o sistémicamente». Se aisló un polipéptido de 18 aminoácidos (aa) a partir de 60 lb de plántulas de tomate y se demostró que induce la síntesis de proteínas inhibidoras de la proteína inducible por la herida . Esta sistemina del tomate se genera por el procesamiento inducido por la herida de una prohormona de 200 aa, la prosistemina, que se localiza en el citoplasma de las células del parénquima del floema vascular. La sistemina induce a las células vecinas y a los elementos cribosos del haz vascular a sintetizar ácido jasmónico (JA), que a su vez activa sistémicamente la expresión de los genes inhibidores de las proteinasas.
Aunque la sistemina está presente en muchas otras especies de solanáceas, como la patata, el pimiento y la belladona, no se encuentra en el tabaco. Este hallazgo llevó al grupo de Ryan a buscar otro tipo de sistemina. Finalmente, se identificaron dos polipéptidos ricos en hidroxiprolina de 18 aa, que se procesan a partir de una preproteína de 165 aa pero que no comparten ninguna homología de secuencia con la sistemina del tomate.
En Arabidopsis se descubrió una tercera familia de DAMPs basados en péptidos. Estos péptidos elicitores de plantas (Peps) de 23 aa se derivan de un precursor de 92 aa. Se han identificado dos receptores para AtPepl, PEPR1 y PEPR2. Los AtPeps inducen una serie de respuestas inmunitarias innatas y una mayor resistencia, y recientemente se ha demostrado que una forma del precursor ProPep3 se libera en el espacio extracelular tras la infección de Arabidopsis con Pseudomonas syringae hemi-biotrófica . Posteriormente se identificó un ortólogo del maíz (Zea mays), ZmPep1, y se demostró que mejora la resistencia a los patógenos microbianos, al igual que AtPepl . Para un análisis más profundo de los elicitores peptídicos endógenos, véase Yamaguchi y Huffaker.
Otra clase de DAMPs que se encuentran en las plantas, así como en los animales, se deriva de la matriz extracelular. En los vertebrados, los fragmentos de hialuronano, un polisacárido lineal simple que consiste en la repetición de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, inducen la inmunidad innata cuando se liberan por daños mecánicos o enzimas hidrolíticas . Estos fragmentos son percibidos por los receptores TLR2 y TLR4 que contienen repeticiones ricas en leucina. Asimismo, las plantas contienen el polisacárido péctico homogalacturonan, un polímero lineal de ácido α-D galacturónico ligado a 1,4, que ayuda a mantener la integridad de la pared celular. Los fragmentos de este polímero, denominados oligogalacturónidos (OG), pueden ser liberados mecánicamente o, más comúnmente, por enzimas hidrolíticas codificadas por los patógenos. Los OGs inducen respuestas inmunitarias innatas, incluyendo la activación de las MAPK, la deposición de calosa, la producción de ROS, la elevación del Ca2+ citosólico y la activación de genes de defensa. La quinasa asociada a la pared 1 (WAK1) ha sido identificada como un probable receptor para los OGs.
El ATP extracelular (eATP) comprende otra clase de DAMPs vegetales que se encuentran tanto en plantas como en animales. A pesar de décadas de evidencia creciente de que el eATP actúa como una molécula de señalización, esta función fue en gran medida descartada/desacreditada, probablemente debido a la naturaleza ubicua del ATP y su papel central como moneda de energía universal en todos los organismos vivos, desde las bacterias hasta los seres humanos . Sólo con la identificación de sus receptores localizados en la membrana plasmática, primero en los animales (ver ) y luego en las plantas , se aceptó su función de señalización en ambos reinos. En los animales, el eATP actúa como neurotransmisor y molécula de señalización que participa en la contracción muscular, la muerte celular y la inflamación. Hay dos tipos de receptores implicados: un receptor P2Y acoplado a la proteína G y un receptor P2X de canal iónico activado por ligando. En las plantas, la función de señalización del eATP se ha confirmado más recientemente con la identificación de su receptor, el DORN1 (Does not Respond to Nucleotides 1). La designación del eATP como un DAMP vegetal se basa en las observaciones combinadas de que i) el mutante dorn1 muestra una respuesta transcripcional suprimida no sólo al ATP sino también a las heridas, ii) la mayoría de los genes inducidos por la aplicación de eATP son también inducibles por las heridas, y iii) el tratamiento con eATP induce respuestas inmunitarias innatas típicas, incluyendo la afluencia de Ca2+ citosólico, la activación de MAPK y la inducción de genes asociados a la densidad, incluyendo algunos implicados en la biosíntesis de JA y etileno. Sin embargo, todavía no se sabe si contribuye a la resistencia a los patógenos.
Recientemente hemos identificado una cuarta clase de DAMPs de plantas, la proteína HMGB de Arabidopsis AtHMGB3 . Todas las células eucariotas, incluidas las plantas, tienen proteínas relacionadas con HMGB1. En Arabidopsis, 15 genes codifican proteínas que contienen el dominio HMG-box. Se han subdividido en cuatro grupos: (i) proteínas de tipo HMGB, (ii) proteínas de dominio de interacción A/T (ARID)-HMG, (iii) proteínas 3xHMG que contienen tres cajas HMG, y (iv) la proteína de reconocimiento de estructura específica 1 (SSRP1) . Basándose en su localización nuclear y en la estructura de sus dominios, se cree que las ocho proteínas de tipo HMGB (HMGB1/2/3/4/5/6/12/14) funcionan como proteínas arquitectónicas cromosómicas, similares a la HMGB1 de los mamíferos. En particular, AtHMGB2/3/4 están presentes en el citoplasma y en el núcleo. Se desconoce la función citoplasmática de estas proteínas. Sin embargo, las subpoblaciones citoplasmáticas deberían tener un mayor acceso al espacio extracelular (apoplasto) después de un daño celular en comparación con las AtHMGBs localizadas exclusivamente en el núcleo , ya que no están unidas al ADN y sólo necesitan cruzar la membrana plasmática para entrar en el apoplasto. Dado el papel bien establecido del HMGB1 de mamíferos como DAMP prototípico, la presencia de una subpoblación citoplasmática de AtHMGB3 planteó la posibilidad de que esta proteína cumpla una función similar. De hecho, cuando se infiltró AtHMGB3 recombinante en las hojas de Arabidopsis, mostró actividades similares a las de AtPep1. El tratamiento con cualquiera de las dos proteínas indujo la activación de MAPK, la deposición de calosa, la expresión de genes relacionados con la defensa y una mayor resistencia a la Botrytis cinerea necrotrófica.
En contraste con la HMGB1 de mamíferos, que puede ser secretada activamente tras una modificación postraduccional, no hay evidencia de la secreción de AtHMGB3. Probablemente entra en el espacio extracelular de forma pasiva cuando las células son dañadas mecánicamente, como por los insectos, o durante la infección por patógenos necrótrofos. De hecho, la infección por B. cinerea provocó la liberación de AtHMGB3 en el apoplasto en las 24 horas siguientes a la inoculación. Esta rápida liberación durante la fase inicial de la necrosis celular inducida por los necrótrofos podría aumentar la resistencia mediante la activación de las respuestas inmunitarias.
Análisis adicionales revelaron que AtHMGB3, al igual que HMGB1, se une a SA, y que esta interacción, que está mediada por residuos de Arg y Lys conservados en la única caja HMG de AtHMGB3, inhibe su actividad DAMP . Este hallazgo parece entrar en conflicto con el conocido papel de SA como regulador positivo de las respuestas inmunitarias . Sin embargo, mientras que las respuestas de defensa inducidas por SA son críticas para la resistencia a los patógenos biotróficos y hemi-biotróficos, la principal hormona responsable de la activación de las defensas contra los patógenos necrótrofos y los insectos es JA . Las vías de señalización de defensa de JA y SA suelen ser mutuamente antagónicas. Por lo tanto, la inhibición de la actividad DAMP de AtHMGB3 mediada por SA puede proporcionar un mecanismo a través del cual estas vías se entrecruzan. En este escenario, el daño celular causado por la infección de patógenos necrótrofos llevaría a la liberación de AtHMGB3 en los espacios extracelulares; esto activaría las defensas asociadas a JA/etileno para ayudar a neutralizar esta amenaza. Por el contrario, la infección por patógenos biotróficos induce la biosíntesis de SA . El aumento de los niveles de SA podría entonces antagonizar la activación de las defensas asociadas a JA mediante la supresión de la actividad DAMP de AtHMGB3, así como promover la activación de las defensas asociadas a SA que son más efectivas contra este tipo de patógenos.
El descubrimiento de que AtHMGB3 extracelular es un DAMP vegetal cuya actividad inductora de la respuesta inmune es inhibida por la unión a SA proporciona evidencia interdominio de que las proteínas HMGB funcionan extracelularmente como DAMPs tanto en plantas como en animales. Además, pone de manifiesto la existencia de dianas comunes y mecanismos de acción compartidos para el SA en plantas y humanos. Curiosamente, la mayoría de los DAMPs vegetales identificados hasta la fecha tienen homólogos en los animales. Nuestros estudios han indicado además que las plantas y los animales comparten objetivos comunes de SA más allá de los HMGB. Por ejemplo, la enzima glicolítica gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), tanto en plantas como en humanos, se une al SA y como resultado tiene una actividad alterada. El SA suprime las funciones de la GAPDH en la replicación del virus del atrofiamiento del tomate en las plantas y puede tener efectos similares en la replicación del virus de la hepatitis C en los seres humanos. También suprime la muerte de células neuronales mediada por GAPDH en animales. Los análisis preliminares de las pantallas de alto rendimiento sugieren la existencia de muchas más dianas de SA tanto en plantas como en humanos. Tal vez la presencia de múltiples dianas de SA en los animales haya evolucionado en respuesta a la ingestión de bajos niveles de SA que están presentes de forma natural en el material vegetal, o a la síntesis endógena de SA a partir de benzoatos. Serán necesarios futuros estudios para evaluar si estas nuevas proteínas que interactúan con el SA en plantas y animales funcionan como DAMPs.
NAMPs
Los nematodos, uno de los animales más abundantes en la naturaleza, parasitan tanto plantas como animales. Varios estudios indicaron que las plantas podían percibir la infección por nematodos , pero se desconocía la identidad de la señal percibida derivada de los nematodos. Recientemente hemos identificado un grupo de moléculas de señalización de defensa de varios géneros de nematodos parásitos de las plantas, incluidos los nematodos del nudo de la raíz y los nematodos del quiste. Se trata de una familia evolutivamente conservada de feromonas de nematodos llamadas ascarósidos. Ascr#18, el ascarósido más abundante en los nemátodos parásitos de las plantas, induce respuestas inmunitarias innatas características que incluyen la activación de i) MAPKs, ii) genes de defensa, y iii) las vías de señalización de defensa SA y JA, así como una mayor resistencia a los patógenos virales, bacterianos, fúngicos y oomicetos y a los nematodos del nudo de la raíz en varias especies de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.
MAMPs, DAMPs, y NAMPs
Aunque las fuentes de las señales inductoras son muy diferentes, siendo los MAMPs derivados de los microbios, los NAMPs derivados de los nematodos, y los DAMPs moléculas endógenas localizadas de forma aberrante, Los estudios realizados en Arabidopsis sugieren que la mayoría de los miembros de estas tres clases de moléculas inductoras del sistema inmunitario activan la señalización inmunitaria innata a través de vías que comparten las mismas quinasas similares a los receptores ricos en leucina BRI1 (BAK1) y BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, para los NAMP resultado no publicado M. Manohar, F.C. Schroeder y D.F. Klessig). Además, estas moléculas inducen muchas de las mismas respuestas de defensa inmune innata, incluyendo un influjo de Ca+2 en el citosol, la deposición de calosa, la activación de las MAPKs MPK3 y MPK6 asociadas a la defensa, la producción de ROS y el aumento de la expresión de muchos genes relacionados con la defensa (Tabla 3). Se han identificado receptores vegetales para varios MAMPs, como FLS2 para la flagelina/flg22 y EFR para EF-Tu/elf18 . También se han descubierto receptores para la mayoría de los DAMPs de las plantas, incluyendo Arabidopsis PEPR1/2 para Peps , Arabidopsis WAK1 para OGs , y Arabidopsis DORN1 para eATP . Aunque inicialmente se informó de que el SR160 del tomate era el receptor de la sistemina, dos estudios recientes sostienen que no lo es. Los receptores vegetales para AtHMGB3 y el NAMP ascr#18 siguen siendo desconocidos (Tabla 2). Tampoco se sabe si la señalización DAMP de AtHMGB3 es mejorada o facilitada por moléculas que interactúan como se ha demostrado para el HMGB1 de mamíferos.