Cultivo celular
Las células de riñón embrionario humano 293FT (HEK293) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml). Las líneas celulares no fueron autentificadas. Las células estaban libres de micoplasma. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Para las líneas celulares estables, las células transfectadas se seleccionaron en presencia de puromicina (3 μg por ml). Para los estudios de transfección transitoria, se sembraron células HEK293 en placas de 6 pocillos en presencia de los vectores utilizando Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Se establecieron líneas celulares de podocitos a partir de orina humana42 y se llevó a cabo el genotipado de APOL1, tras obtener el consentimiento informado en virtud de los protocolos de investigación (94-DK-0127, 94-DK-0133) aprobados previamente por la Junta de Revisión Institucional del NIDDK. El caso A es un varón G0/G0 con GFS, el caso B es un varón G0/G0 con GFS asociada al VIH, el caso C es un varón G0/G0 con GFS (HP55-345O-1), el caso D es un varón G1/G2 con GFS y el caso E es un varón G1/G2 con GFS asociada al VIH. Las células se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS, ITS y 1% de penicilina/estreptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml). Las células se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 33 °C y se diferenciaron a 37 °C durante 7-10 días. Las líneas celulares no fueron autentificadas. Las células estaban libres de micoplasma. Antes de recoger los lisados celulares, las células fueron tratadas con 103 U por ml de IFNα (Abcam) durante 24-72 h y 100 mM de caliculina A (LC Laboratories) durante 30 min. Para los experimentos de inhibición de la PKR, las células se trataron con 1 μM de imidazolo-oxindol inhibidor de la PKR C16 (Sigma Aldrich) durante 1 h43.
Tejido humano
Los tejidos de biopsia de riñón humano desidentificados se obtuvieron de la Dra. Preeti Chandra, Universidad de Maryland. La investigación fue aprobada previamente por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Maryland y del NIDDK, NIH.
Información sobre el plásmido
El vector de expresión de APOL1 G0 consiste en ADNc de APOL1 humano derivado del promotor CMV (NM_001136540: 298-1453). Para APOL1 G1 (rs73885319 A→G y/o rs60910145 T→G) y G2 (rs71785313 del), se realizó mutagénesis dirigida al sitio para fabricarlo. Para el vector de expresión de APOL1 que carece de expresión de la proteína se produjo mediante la inserción de un codón de parada y la secuencia frameshift (TAATAGATGA) después del codón 138. Para el vector de mutación de la estructura secundaria, las secuencias originales están alteradas por ocho cambios sinónimos (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G, y 1242T→C). Para el vector estable dsRNA G0 las secuencias originales están alteradas por 5 mutaciones en la 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Para el ARN de flanqueo alrededor de los alelos APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453), se utilizó pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) como vector de fondo. Los esquemas de los mapas de vectores se encuentran en la Figura Suplementaria 1.
Inmunoblotting
Las células se lisaron en un tampón RIPA que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas/fosfatasas. Los lisados se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y las proteínas se sometieron a western blotting y se bloquearon durante 30 minutos en tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR). Las manchas se incubaron con anticuerpos primarios contra APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actina (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), fosfo-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), fosfo-GCN (Abcam ab75836), y GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) y p62 (Cell signaling #5114). Los blots se incubaron con un anticuerpo anti-conejo marcado con colorante (LI-COR). Todos los blots se visualizaron con el escáner de infrarrojos Odyssey (LI-COR). Las imágenes de gel sin procesar se muestran en la Figura Suplementaria 13.
PCR de transcriptasa inversa y PCR cuantitativa en tiempo real
Se cosecharon células o riñón total en reactivo TRIzol y se aisló el ARN total. El ARN total se trató con DNasa antes de la síntesis del ADNc con oligo (dT). Se utilizó una alícuota de 5-μg de ARN para la síntesis de ADNc mediante la transcriptasa inversa Superscript II. Las muestras se analizaron mediante PCR (RT) o RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) utilizando la mezcla maestra Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). La expresión relativa en cada muestra se calculó como un ratio (gen específico de attamoles por β-actina). Los pares de cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
Asunto de síntesis de proteínas
Las células HEK293 transfectadas o las líneas celulares de podocitos humanos se cultivaron en placas de 96 pocillos y se trataron con 103 U por ml de IFNα (Abcam) para su cuantificación o con portaobjetos de cámara para su visualización. El ensayo de síntesis (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, catálogo no. C10289, Invitrogen) se realizó según las instrucciones del fabricante. La contratinción nuclear se realizó con Hoechst. Las células HEK293 sin vector tratadas con 1 μM de puromicina (InvivoGen, San Diego, CA) se utilizaron como control negativo para este ensayo, con el fondo fijado en un 0% de intensidad de señal. Las células HEK293 con vector APOL1 G0 se fijaron con una intensidad de señal del 100%.
Viabilidad celular
Los ensayos de viabilidad celular se realizaron utilizando ensayos de ATP. Para cuantificar el ATP generado por las células metabólicamente activas, se utilizó un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se cultivaron en placas estériles de 96 pocillos en presencia de 103 U por ml de IFNα (Abcam) durante 72 h, y luego se añadieron 100 μL de reactivo CellTiter-Glo para lisar las células. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, se detectó la luminiscencia utilizando un luminómetro con un tiempo de integración de 1 s por pocillo. Las señales de luminiscencia de las células se normalizaron por el recuento de células.
Asunto de velocidad de proliferación celular
Se sembraron células a 5,0 × 103 células por 150 µl de medio de cultivo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se añadió el inhibidor de PKR C16 a la concentración indicada. Después de 0, 24, 48 y 50 µl, se midió el número de células con el Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Tasa de consumo de oxígeno en podocitos humanos cultivados
Se utilizó el analizador de flujo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) para evaluar la tasa de consumo de oxígeno celular (OCR) según las instrucciones de la empresa. Brevemente, se sembraron podocitos humanos cultivados en placas de pocillos XF24 compradas a Seahorse Bioscience, a una densidad de 2,0 × 104 células por pocillo (superficie de 0,33 cm2) en 100 μL de medio de cultivo y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las células se trataron con IFNα (1 × 103 U por ml) con/sin el inhibidor de PKR C16 (100 nM) durante 72 h, seguido de 24 h de tratamiento en las placas de pocillos XF24. Antes de las mediciones de OCR, la placa experimental XF24 que contenía las células se lavó con medio de ensayo DMEM sin bicarbonato (Seahorse Bioscience) que contenía 25 mM de glucosa y 1 mM de piruvato sódico, y las células se preincubaron durante 1 h a 37 °C sin suministro de CO2 en 625 μL de medio de ensayo. Antes de las mediciones de OCR, se calibró el XF24 utilizando un cartucho de calibración según las instrucciones de la empresa. Después de la calibración, se realizaron mediciones de OCR de referencia en la placa de ensayo durante 4 min.
Inmunoprecipitación de ARN (ARN-IP)
Las células HEK293 estables con la variante APOL1-G0, G1 o G2 se trataron de forma simulada con lo siguiente: (a) 103 U por ml de IFNα durante 24-72 h y 100 μM de ácido palmítico (Sigma) durante 2 h, o (b) 100 mM de 103 U por ml de IFNα durante 24-72 h y caliculina A durante 30 min. El ácido palmítico se une directamente a la PKR e inhibe la unión del dsRNA a la PKR44 y, por tanto, el ácido palmítico se utilizó como control negativo. Las células fueron irradiadas con luz UV a 200 mJ por cm2. Se guardó el 10% de cada lisado celular para que sirviera de muestra de entrada para la RT-qPCR. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando el kit de inmunoprecipitación de la proteína de unión al ARN (EMD Millipore) basado en el informe anterior utilizando PKR45. Se utilizó el anticuerpo fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) o la IgG de conejo de control para el ARN-IP. El ARN se extrajo con TRIzol, seguido de un tratamiento con DNasa y precipitación con etanol. Se generaron cDNAs utilizando cebadores hexámeros aleatorios y SuperScript Reverse transcriptase II. Las muestras se analizaron mediante PCR (RT) o qRT-PCR utilizando la mezcla maestra Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). El enriquecimiento se calculó como un ratio (muestra IP por muestra de entrada). Los pares de cebadores se enumeran en la tabla suplementaria 1. No se detectó ninguna señal SYBR en los controles negativos, en las células tratadas con un anticuerpo fosfo-PKR IP y en las células tratadas con interferón-α + caliculina A con IgG de conejo IP
Expresión y purificación de la proteína PKR
La PKR recombinante se purificó como se informó previamente46. La PKR pPET-PKR/PPasa (Addgene #42934) se transformó en células BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Las células se cultivaron en medio LB a 37 °C hasta que A600 nm ~ 0,7 y la expresión de la proteína se indujo con 1 mM de IPTG durante 3 h a ~20 °C. Para la purificación de PKR, las células se resuspendieron en tampón A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% de glicerol) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma). Las células se lisaron mediante la incubación con 5 mg por ml de lisozima durante 30 minutos, seguida de una sonicación durante 3 minutos. El lisado se centrifugó durante 20 min a 20.000 g. El sobrenadante se aplicó a una columna de heparina Sepharose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) equilibrada en tampón A y la PKR se eluyó utilizando un gradiente de NaCl. Las fracciones de pico se diluyeron dos veces con tampón A y se aplicaron a una columna de agarosa poli(I:C) (Amersham) equilibrada en tampón A. La PKR se eluyó a 1,1 M de NaCl, se concentró a ~10 mg por ml y se almacenó a -80 °C.
Ensayo de activación de la PKR
Los ensayos de activación de la PKR se realizaron como se informó previamente47. La PKR fue desfosforilada por la λ-proteína fosfatasa durante 1 h a 30 °C y luego se inhibió con ortovanadato de sodio 2 mM. La PKR (4 μM) se incubó con ARN largo (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng por ml)/ARN corto (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng por ml)/polímeros (I:C) 20 μg por ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT y 100 μM ATP (Ambion). Las mezclas de reacción se incubaron a 30 °C durante los tiempos indicados y se apagaron con tampón de carga 1× SDS. Las PKR fosforiladas se detectaron con el anticuerpo fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
Preparación del ARN para los experimentos de migración en gel y SHAPE
Los ARNs APOL1 truncados con varios casetes de estructura 3′ se prepararon mediante transcripción in vitro utilizando el kit MegaShortScript (ThermoFisher) según las recomendaciones del fabricante. Las plantillas de transcripción se generaron en dos reacciones de PCR semianidadas a partir de plásmidos que contenían alelos de APOL1 (G0, G1, G2) o variantes mutantes de los mismos (mG0, mG1, mG2). Para la primera reacción, se utilizaron cebadores directos e inversos para añadir un promotor T7 de 5′ y un SC de 3′ de 45 nt, respectivamente, a las secuencias truncadas de APOL1 (Tabla Suplementaria 1). Este último elemento se introduce para proporcionar un sitio de hibridación de transcripción inversa para SHAPE. Una fracción de cada reacción se reamplificó utilizando el cebador delantero original y un cebador inverso más corto para que las plantillas de transcripción finales fueran más homogéneas. Las reacciones de transcripción se trataron con Turbo DNasa I durante 5 minutos a 37 °C, se incubaron a 85 °C durante 2 minutos y se fraccionaron en un gel desnaturalizante (poliacrilamida al 5%-19:1, 1× TBE, 7 M de urea) a temperatura constante (45 °C, 30 W máx.). Los productos de ARN deseados se detectaron mediante sombra UV, se extrajeron del gel, se electroeluyeron a 200 V durante 2 h a 4 °C, se precipitaron con etanol y se almacenaron a -20 °C en Tris 10 mM, pH 7,0 antes de su uso. Las soluciones de ARN madre se cuantificaron por espectrofotometría.
Ensayo de migración en gel
Cada ARN truncado de APOL1 se diluyó a 1 μM en 20 μL de tampón de renaturalización de ARN (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 5% de glicerol (w por v)), se desnaturalizó calentando a 85 °C durante 2 min y se renaturalizó enfriando lentamente (0,1 °C por s) hasta 25 °C. A continuación, se añadió MgCl2 a una concentración final de 0, 1 o 3 mM y las mezclas se incubaron 30 minutos más a 37 °C para promover la formación de interacciones terciarias de ARN dependientes de Mg y/o de otro tipo. Los conformadores de ARN se estabilizaron mediante enfriamiento rápido a 4 °C, tras lo cual se fraccionaron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5% (acrilamida al 5%, 19:1) durante 16-18 h a 4 °C. Tanto el gel como el tampón de corrimiento contenían 1× TBE y 1 mM de MgCl2, y los geles se corrieron previamente durante ~1 hora antes de cargarlos. Los geles se expusieron al colorante SybrGreen (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las posiciones de migración de los conformadores de ARN se detectaron utilizando un generador de imágenes de modo variable Typhoon Trio+ (GE Healthcare).
SHAPE y generación de modelos estructurales secundarios de ARN
Los métodos experimentales de SHAPE se han descrito previamente48,49. Brevemente, el ARN APOL1 truncado con un ARN SC se plegó como en el ensayo de migración en gel, excepto que el volumen de la mezcla fue de 150 μL, la concentración final de MgCl2 fue de 1 mM y se excluyó el glicerol. Las soluciones de ARN se dividieron en alícuotas de control (1M7-) y experimentales (1M7+) (72 μL cada una), y se añadieron 8 μL de DMSO u 8 μL de 30 mM de 1M7 en DMSO, respectivamente. Las reacciones de modificación se incubaron a 37 °C durante 5 minutos, se enfriaron a 4 °C, se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 10 μL de agua libre de nucleasas. Los ARN tratados se transcribieron de forma inversa a partir de cebadores marcados de forma diferente y complementarios al casete de estructura 3′ (cebador 1M7-, Cy5,5; cebador 1M7+, Cy5) y se hidrolizaron mediante tratamiento con álcalis. Las bibliotecas de ADNc resultantes se precipitaron con etanol y se volvieron a disolver en la solución de carga de muestras (Genome Lab), y a continuación se combinaron con escaleras de secuenciación ddA y ddG marcadas con WellRED D2 (Beckman Coulter) e IRDye 800RS (LI-COR), respectivamente. Las muestras combinadas se fraccionaron mediante electroforesis capilar (CE) utilizando un analizador genético CEQ 8000 de Beckman Coulter. Para cada ARN, se generaron perfiles de reactividad a partir de los electroferogramas de CE utilizando el software SHAPEfinder50 y luego se introdujeron en el software RNAstructure versión 5.751,52 junto con las secuencias de ARN para generar modelos estructurales secundarios. Se utilizaron los parámetros predeterminados de pendiente (1,8 kcal por mol) e intercepción (-0,6 kcal por mol) para transformar los valores de reactividad en las restricciones de pseudoenergía que modulan el algoritmo de plegado del ARN. RNAstructure genera automáticamente múltiples modelos estructurales que se ajustan mejor a los perfiles de reactividad derivados de SHAPE y los clasifica por energía libre de Gibbs. Los modelos estructurales de menor energía producidos de esta manera se ilustran en la Fig. 3a, b y en la Fig. 4 suplementaria.
Down in vitro
Realizamos experimentos de knock down utilizando líneas celulares humanas condicionalmente inmortalizadas establecidas a partir de orina humana42. Transfectamos estas células con Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) o con stealth siRNA prediseñado contra APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) utilizando Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo fue co-transfectado y utilizado como control de transfección. Las eficiencias de knock down fueron del 52,4 al 75,4% (niveles de ARN) o del 31,1% (niveles de proteína).
Ratones
Utilizamos ratones transgénicos del locus del gen APOL1 humano (ratones BAC-APOL1), generados mediante un cromosoma artificial bacteriano que contiene el locus para APLOL-G0, o APOL1-G1, o APOL1-G2. Se aisló y subclonó un ADN humano de ~47 kb, que abarcaba sólo el gen APOL1 con las regiones flanqueantes 5′ y 3′ (incluidos los exones 1 y 2 de APOL2 y la región 3′ que incluye los exones 39-41 de parte del gen MYH9), a partir de un clon BAC humano (ENST00000397278, que corresponde a NM_003661). Se inyectaron subclones BAC individuales G0, G1 y G2 en embriones 129SvJ/B6N F1 y los fundadores se retrocruzaron posteriormente con 129SvJ. El subclon fue secuenciado para asegurar que era como la secuencia del genoma de referencia del NCBI y Ensembl. Las únicas diferencias fueron los polimorfismos en las regiones intrónicas. En los experimentos con ratones transgénicos condicionales, utilizamos ratones transgénicos de ARN truncado APOL1 específicos para podocitos de fondo FVB. Produjimos estos ratones mediante un sistema transgénico condicional utilizando la secuencia de ARN truncado impulsada por la nefrina (NPHS1) (NM_001136540, 1031-1453). Generamos dos cepas: NPHS1-APOL1-G0-delta-ARN con rs73885319 A y rs60910145 G y NPHS1-APOL1-G1-delta-ARN con rs73885319 G y rs60910145 G.
Aislamiento de glomérulos
Los ratones BAC/APOL1 (entre 8 y 12 semanas de edad) recibieron IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 días antes de la toma de muestras de tejido. El protocolo de aislamiento glomerular se ha descrito en detalle53. Brevemente, los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de Avertin (alcohol 2,2,2-tribometil y terciario amílico; 17 μL por g) y perfundidos con 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04) diluidas en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato a través del corazón. Los riñones se digirieron con colagenasa A y DNasa I a 37 °C durante 10 minutos. El tejido digerido con colagenasa se presionó suavemente a través de un colador celular de 100 μm y se lavó con HBSS. Las muestras se lavaron y resuspendieron utilizando un soporte magnético. Se recogieron los glomérulos y se incubaron en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS, ITS, 1% de penicilina/estreptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml) y 100 mM de caliculina A (LC Laboratories) durante 30 min y se utilizaron para el análisis de Western blot.
Inmunohistoquímica (muestras de ratón)
Los ratones BAC/APOL1 (entre 8 y 12 semanas de edad) recibieron IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 días. Los ratones se perfundieron con caliculina A 100 mM contenida en PBS antes de la toma de muestras de tejido. A continuación, los riñones se cortaron en trozos pequeños y se incubaron en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS, ITS y 100 mM de caliculina A durante 30 minutos. A continuación, los tejidos se fijaron inmediatamente con formalina tamponada al 10%. A los ratones BAC/APOL1 (de entre 8 y 12 semanas de edad) se les administró IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 días. A los ratones NPHS1-APOL1-ΔRNA se les administró IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 días antes de la toma de muestras de tejido. Se utilizaron secciones de tejido de 4-5 μm fijadas en parafina. Las secciones fueron desparafinadas/rehidratadas, la recuperación de antígenos se realizó por calentamiento en medio tamponado con citrato durante 5 min en un microondas. Los tejidos se bloquearon con BSA al 1% y saponina al 0,1%. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios que incluían los siguientes: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) y podocalixina (R&D Systems AF1556). Para la inmunofluorescencia, se utilizaron anticuerpos secundarios Alexa Fluor (ThermoFisher) y se visualizaron mediante microscopía confocal. Para la tinción ABC, se utilizó un anticuerpo secundario conjugado con biotina y Avidina-HRP (Vector). Para la visualización se utilizó un kit DAB (Vector). En los experimentos con ratones, éstos (de entre 8 y 12 semanas de edad) fueron tratados con IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP), inyectado durante 3 días antes de la toma de muestras de tejido. Para la cuantificación de la señal, se detectó la señal fosfo-PKR del podocito mediante la contratinción para WT1 en los experimentos con ratones.
Inmunohistoquímica (especímenes humanos)
Este estudio fue aprobado previamente por el IRB de la Universidad de Maryland y del NIDDK, NIH. Las características básicas de los casos se enumeran en la Fig. Suplementaria 5b. La tinción se realizó utilizando secciones de tejido de 5 μm de grosor fijadas con formalina e incluidas en parafina. Tras la desparafinación, se realizó una recuperación de antígenos inducida por calor durante 20 min en un tampón de pH 6,0 utilizando una olla a presión (Pascal, Agilent Technologies Dako). Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios que incluían los siguientes: fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) y WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Se utilizaron anticuerpos secundarios Alexa Fluor (ThermoFisher) y se visualizaron mediante microscopía confocal.
Inmunohistoquímica e imagen de células vivas
Las células se incubaron con 200 nM de Mito Tracker Green (Invitrogen) y 200 nM de TMRE (Invitrogen) durante 20 min antes de la detección de la señal, tras el tratamiento con 20 μM de FCCP y se visualizaron mediante microscopía confocal.
Cuantificación de la señal de las imágenes microscópicas
Para el tejido humano, se contaron los glomérulos sin esclerosis global (6 casos de genotipo sin riesgo: 5, 6, 7, 10, 5 y 9 glomérulos por cada caso, respectivamente; 6 casos de genotipo de riesgo: 13, 6, 4, 5, 10 y 5 glomérulos, respectivamente). Para los tejidos de ratón y humanos, la potencia del láser se ajustó de forma que no se saturara la señal máxima. El procesamiento de imágenes y los análisis de colocalización se realizaron utilizando el software Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania)54 . El coeficiente de colocalización ponderado y la intensidad media en las células positivas a WT-1 se calcularon como se informó previamente54. Para la intensidad media, estandarizamos la intensidad de la señal de los podocitos utilizando las señales de las células intraglomerulares WT1-negativas para cada glomérulo. Los valores fueron una puntuación relativa con la intensidad de la señal de APOL1-G0 como 100%. Las cuantificaciones se realizaron de forma ciega.
Hibridación in situ
La detección cromogénica in situ se realizó en secciones de tejido de los bloques de ratón fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) utilizando la hibridación in situ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Brevemente, se desparafinaron secciones de tejido FFPE de 5 μm, se hirvieron con un reactivo de pretratamiento durante 15 minutos y luego se digirieron con proteasa a 40 °C durante 30 minutos, seguido de hibridación durante 2 h a 40 °C con la sonda-Hs-APOL1-01 (Catálogo # 439871, Advanced Cell Diagnostics). Además, se utilizaron la sonda-Mm-PPIB (Catálogo # 313911) y la sonda-DapB (Catálogo # 310043) como control positivo y negativo, respectivamente. La detección de los sitios de unión de las sondas específicas se visualizó con el kit de reactivos RNAScope 2.0 HD (Brown) (Catálogo nº 310035).
Modelo de proteinuria en ratones
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados previamente por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (Propuesta de estudio de animales (K097-KDB-14)). Se utilizaron ratones machos y hembras de entre 8 y 15 semanas de edad. Los ratones de cada experimento estaban emparejados por sexo, edad y peso corporal. Se realizaron aleatorizaciones con respecto al peso corporal. El tamaño de las muestras para los experimentos se determinó sin cálculos formales de potencia. Los criterios de exclusión fueron la pérdida de peso superior al 20% durante el periodo experimental. Para la inducción de la proteinuria, se inyectaron ratones (de entre 8 y 12 semanas de edad) con bFGF y puromicina aminonucleósido, como se ha descrito previamente30. Para la cepa de ratones NPHS1-APOL1-deltaRNA, se inyectó puromicina aminonucleósido (Sigma-Aldrich) por vía subcutánea en el día 0 (200 mg por kg de peso corporal), y se inyectó bFGF (Kaken Pharmaceutical) por vía intravenosa en los días 0 y 2 (5 μg por animal), respectivamente. Para los experimentos con inhibidores de PKR, el inhibidor de PKR C16 (10 μg por kg IP) diariamente desde el día 0 hasta el día 1055. Para la cepa de ratones BAC-APOL1, se inyectó interferón γ (Prospec) en el día -1 y en el día 1 (106 U por kg de peso corporal), se inyectó puromicina aminonucleósido por vía subcutánea en el día 0 (300 mg por kg de peso corporal), y se inyectó bFGF (Kaken Pharmaceutical) por vía intravenosa en los días 0 y 2 (5 μg por animal), respectivamente. Para los experimentos con inhibidores de la PKR, se utilizó el inhibidor de la PKR C16 (10 μg por kg IP) diariamente desde el día 0 hasta el día 1055.
Medición de albúmina y creatinina urinaria
Determinamos los niveles de albúmina urinaria con ELISA utilizando un kit ELISA de microalbuminuria murina (Exocell). Se midió la concentración de creatinina en orina con un kit de creatinina (Exocell). Todas las mediciones se realizaron por duplicado. Se determinó la albuminuria como la relación entre la albúmina urinaria y la creatinina. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Los investigadores no estaban cegados en cuanto a la asignación de grupos, pero sí lo estaban al evaluar los resultados.
Análisis estadístico
Se analizaron los datos de al menos tres experimentos individuales y se presentaron como gráfico de puntos y media. Los métodos de análisis estadístico se escribieron en las leyendas de cada figura. No se ajustó para comparaciones múltiples. Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.