La planta acuática Azolla como materia prima universal para la producción de biocombustibles

Tratamiento de aguas residuales sintéticas con Azolla filiculoides

Para el experimento de biorremediación, se preparó agua residual sintética rica en selenio (SeSW) mezclando una alta concentración de fosfatos (PO4-P), 1.3 g/L con una cantidad moderada de amoníaco (NH4-N), 55 mg/L y una baja concentración de nitratos (NO3-N), 15 mg/L (Archivo adicional 4: Tabla S3). Esta composición simula las características de los efluentes de las industrias típicas de tintura, acabado y producción de detergentes para ropa. Las aguas residuales se complementaron con 0,8 mg/L de SeO2. En este experimento, se utilizó un tratamiento de 5 días de SeSW por A. filiculoides. Las tasas de crecimiento de algunas plantas acuáticas que crecen en aguas residuales normalmente aumentan exponencialmente después de una fase de retraso observada durante los primeros 4-5 días en los que la biomasa no cambia significativamente. Este periodo, sin embargo, está asociado con la absorción intensiva de los nutrientes clave de las aguas residuales, lo que conduce al fuerte crecimiento exponencial de las plantas acuáticas después de la fase de retardo . La eliminación de nutrientes en el SeSW durante los primeros 5 días de tratamiento por parte de A. filiculoides no condujo a cambios estadísticamente significativos (P ≤ 0,05) en la producción de biomasa (0,3 ± 0,1 g dw). Sin embargo, condujo hasta un 25,4 % de absorción de NH4-N, un 69,5 % de absorción de NO3-N y un 24,3 % de absorción de PO4-P a partir del 100 % de SeSW (Tabla 1; Fig. 1). El SeSW diluido (50 %) fue menos estresante para A. filiculoides como se refleja en las mayores tasas de absorción de nutrientes: 33,4, 93 y 39,8 % para NH4-N, NO3-N y PO4-P, respectivamente. Las tasas de absorción de nutrientes por parte de A. filiculoides fueron reportadas anteriormente por varios grupos de investigación.

El tratamiento de SeSW con A. filiculoides condujo a una absorción del 40% de Se en el 100 % de SeSW y del 76% en el 50 % de SeSW con tasas de absorción de 47,6 µg de Se/L día y 39,9 µg de Se/L día, respectivamente (Fig. 2; Tabla 2). Esto se correlacionó con tasas de acumulación de 158,8 µg de Se/g dw-día en A. filiculoides a partir del 100 % de SeSW y 133,5 µg de Se/g dw-día a partir del 50 % de SeSW (Tabla 2). Esta eficiencia de absorción representa el 85 y el 83 % del valor máximo teórico de absorción para el 50 % de SeSW y el 100 % de SeSW, respectivamente. Otro representante de Azolla, Azolla caroliniana, mostró una tasa de absorción de Se aproximadamente similar, ya que absorbió hasta 1 mg de Se/g de peso vivo a partir de una solución de 2,5 mg/L de Se durante 2 semanas de tratamiento. Esta cifra es superior a la de otras plantas acuáticas, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) y Eichhornia (300 mg Se/g dw).

La tasa de supervivencia de P. australiensis expuesta a diluciones de SeSW se muestra en el archivo adicional 5: Figura S2. La supervivencia fue nula (0 %) cuando se expusieron durante 96 h al 100 % de SeSW sin tratar (control). Tampoco se observaron camarones vivos en el SeSW al 80 % o al 50 %. Tras el tratamiento con A. filiculoides, la toxicidad del SeSW se redujo 2,6 veces y la CL50 aumentó del 11,22 al 29,80 %. Esto indicó que cuando el 100 % de SeSW fue tratado por A. filiculoides, su toxicidad se redujo significativamente después de sólo 5 días de tratamiento.

Producción de biocombustible a partir de Azolla

Análisis íntimos y próximos de Azolla filiculoides

Los resultados de los análisis próximos y últimos de la muestra de A. filiculoides, incluyendo el contenido total de volátiles, humedad, carbono fijo y cenizas (es decir, componentes inorgánicos de las muestras), se resumen en el archivo adicional 6: Tabla S4. Los volátiles totales recogidos a 950 °C representan el 88 % del producto total. El producto total tenía un 11 % de humedad, un 7,3 % de cenizas y un 4,4 % de carbono fijo. El análisis proximal mostró que los elementos clave comprendían un 46,2 % de C, un 7,4 % de H, un 3,0 % de N, un 43,2 % de O y un 0,2 % de S (calculado por diferencia).

El análisis termogravimétrico de Azolla filiculoides

El análisis TGA-DTG de la muestra de A. filiculoides se llevó a cabo a un rango de temperatura de 23-900 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min bajo una atmósfera de nitrógeno y se muestra en la Fig. 3. Las curvas de TGA y DTG revelaron las tres fases de descomposición de A. filiculoides en el proceso de pirólisis; resultados similares fueron reportados por Agrawal y Chakraborty . La biomasa sufrió tres fases de pérdida de peso, una entre 154 y 160 °C, la segunda entre 180 y 580 °C y la tercera entre 580 y 900 °C. La primera zona representa una ligera pérdida de peso (7 %) causada por la deshidratación de la muestra de biomasa. La mayor parte de la pérdida de peso (51 %) debida a la pirólisis tuvo lugar en la segunda zona, donde se liberan la mayoría de los volátiles; el pico fuerte denota la descomposición de proteínas, carbohidratos y lípidos . En la tercera zona, se produce la descomposición del producto carbonoso, por lo que la pérdida de peso se debe principalmente a la gasificación, donde los compuestos de carbono altamente no volátiles se vaporizan formando CO y CO2 debido a las altas temperaturas.

La licuefacción hidrotermal de Azolla filiculoides

La licuefacción hidrotermal de A. filiculoides se realizó utilizando agua destilada como disolvente a 260, 280 y 300 °C con tiempos de residencia de 15 min. Las condiciones de reacción se seleccionaron basándose en nuestros estudios anteriores y en la literatura para entender el efecto de la temperatura en el rendimiento del producto de bio-aceite de A. filiculoides bajo agua subcrítica . La distribución del producto de la muestra de A. filiculoides tratada con HTL se presenta en la Fig. 4. Los rendimientos totales de bioaceite fueron de 15,83, 21,50 y 16,0 % a 260, 280 y 300 °C, respectivamente; por lo tanto, el rendimiento máximo se obtuvo a 280 °C. El bioaceite total estaba compuesto por la fracción de éter (Bio-oil1) obtenida de la extracción de la parte líquida, y la fracción de acetona (Bio-oil2) obtenida de la extracción de la fracción sólida (sección «Métodos»). El Bio-oil2 tenía una alta viscosidad y se veía como un líquido alquitranado. El rendimiento del residuo sólido disminuyó continuamente del 66,83 al 33,83 % a medida que la temperatura aumentaba de 260 a 300 °C. El rendimiento de los gases disminuyó en la transición de 260 a 280 °C. Cuando la temperatura fue superior a 280 °C, el rendimiento de los gases aumentó hasta el 7,1 % . El HTL de la biomasa de A. filiculoides mostró una distribución similar de los dos productos principales, el biogás y el biocarbón, con datos obtenidos después de la pirólisis con una media de biogás de 6,05 y 12 % para el HTL y la pirólisis, respectivamente, y de biocarbón en torno al 50 % para ambos. El HTL generó un mayor nivel de bioaceite, hasta el 21,5 % (14 % para la pirólisis). Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los rendimientos de bioaceite obtenidos tanto de la pirólisis como de la HTL de microalgas.

Además de los datos del balance de materiales, se investigó la conversión sobre la base del carbono orgánico total (COT) obtenido después de la licuefacción hidrotermal a diferentes temperaturas, y los resultados se presentan en el archivo adicional 7: Tabla S5. Había un 46,9 % de carbono orgánico en la alimentación, lo que se traduce en 2,8 g de carbono orgánico en los 6 g de la muestra utilizada para la licuefacción hidrotermal. La conversión relativa al carbono orgánico aumentó del 13,93 al 48,93 % con el aumento de la temperatura de 260 a 300 °C. Los resultados indicaron que a una temperatura más baja, la descomposición de la biomasa era incompleta y dejaba una gran cantidad de biomasa sin reaccionar que podía suprimir la formación de bioaceite. El aumento de la temperatura pudo acelerar la descomposición de la materia prima y benefició la formación de bio-aceite; sin embargo, un mayor aumento de la temperatura, superior a 280 °C en nuestros experimentos, descompondría el bio-aceite/intermedios formados previamente en gases y productos solubles en agua y, por lo tanto, conduciría a una disminución del rendimiento de bio-aceite. La reducción del rendimiento del residuo sólido (biocarbón) sugirió un aumento de la conversión global de la biomasa cuando la temperatura se elevó de 260 a 300 °C.

Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier del bioaceite

Espectro F-IR de la alimentación de A. filiculoides y del bioaceite1 obtenido por HTL a 260, 280 y 300 °C se muestran en las Figs. 5A y B. La banda ancha en torno a 3200-3405 cm-1 se atribuye a la vibración de estiramiento O-H o N-H causada por el agua o los grupos O-H o N-H presentes en el bioaceite (Fig. 5B). En la materia prima se observó una absorbencia amplia en torno a 3314 cm-1, lo que indicaba un alto contenido en carbohidratos y proteínas (Fig. 5A).

Los bioaceites mostraron una absorbencia más débil en 3200-3405 cm-1, lo que sugiere que tanto los carbohidratos como las proteínas se descompusieron en el proceso HTL (Fig. 5B). Las bandas de 2854 a 2950 cm-1 fueron más fuertes para todos los bioaceites debido a las vibraciones de estiramiento C-H, indicando la presencia de grupos alquilos C-H. La vibración de estiramiento C=O en torno a 1645-1720 cm-1 en los bioaceites indica la presencia de cetonas, aldehídos, ésteres o ácidos. Las bandas de vibración de flexión en torno a 1580-1650 cm-1 indican la presencia de los grupos N-H de la amina. Las bandas en la región de 1430 a 1480 cm-1 se atribuyen a las vibraciones de flexión α-CH2 presentes en los bioaceites. La presencia de bandas de estiramiento C-N en torno a 1266-1342 cm-1 en los bioaceites se debe a los grupos aromáticos de la amina. Además, otros picos de absorción que aparecen a 780-850 cm-1 se atribuyen a las vibraciones de flexión C-H fuera del plano de los aromáticos. La banda a 1040 cm-1 apareció sólo en el perfil de absorción del alimento de A. filiculoides, y podría ser C-O conectado con grupos hidroxilos que fueron deshidratados después de la licuefacción. En general, los espectros de las muestras de bioaceite1 de HTL a las diferentes temperaturas muestran los mismos picos, lo que indica la presencia de los mismos grupos funcionales, y fueron los diversos picos obtenidos en los espectros de RMN.

Análisis de RMN del bioaceite

El análisis de RMN de las muestras de bioaceite1 se llevó a cabo para comprender las relaciones de los entornos químicos de los protones. Los espectros de RMN proporcionaron información de grupos funcionales complementaria a los espectros FTIR y la capacidad de cuantificar y comparar las áreas de integración entre los espectros. Al igual que el FT-IR, los espectros de RMN de 1H mostraron un alto porcentaje de grupos funcionales alifáticos para todos los bioaceites, y en la Fig. 6 se ofrece un resumen de las regiones de áreas de pico integradas asignadas a diferentes clases de grupos funcionales. La región más ascendente de los espectros, de 0,5 a 1,5 ppm, representa protones alifáticos unidos a átomos de carbono a una distancia de al menos dos enlaces de un C=C o un heteroátomo (O o N). La siguiente región integral de 1,5 a 3,0 ppm representa protones en átomos de carbono alifáticos que pueden estar unidos a un doble enlace C=C. Todos los bioaceites tenían un mayor porcentaje de protones en la región espectral de 0,5 a 3,0 ppm. Tenían un mayor porcentaje (63,15-71,76 %) de protones en la región de 0,5 a 1,5 que en la región de 1,5 a 3,0 (18,73-28,8 %), lo que posiblemente se deba al gran número de compuestos nitrogenados y oxigenados que han demostrado resonar en esta zona y que pueden derivarse del alto contenido en proteínas de la materia prima.

La siguiente porción del espectro de RMN de 1H a 3,0-4,5 ppm representa protones de metoxilo o un grupo de metileno que une dos anillos aromáticos; se observaron porcentajes de protones muy bajos en esta región. Todos los bioaceites mostraron un bajo porcentaje de funcionalidad metoxilo/carbohidrato (4,5-6,0 ppm). En esta región, los valores máximos de porcentaje de protones de los bioaceites fueron de 4,33 y 4,32 % para las licuaciones a 260 y 280 °C, siendo el valor marcadamente inferior de 0,94 % para la licuación a 300 °C. La región del espectro entre 6,0 y 8,5 ppm corresponde a la región aromática. El contenido máximo de protones en esta región, en torno al 7,2 %, se obtuvo para el bioaceite fabricado a 300 °C. Se observó funcionalidad aromática/heteroaromática en todos los bioaceites (6,0-8,5 ppm) de acuerdo con los resultados de la espectroscopia FT-IR. Las regiones del espectro de abajo (8,5-10 ppm) provienen de los aldehídos. La funcionalidad aldehídica (9,5-10,0 ppm) estaba ausente en todos los bioaceites a pesar de los grupos funcionales C=O (1645-1720 cm-1) observados por FT-IR. La aparición de estas bandas de FT-IR también puede deberse a otros grupos carbonílicos como los ácidos carboxílicos protonados, los ésteres de ácidos carboxílicos, las amidas y las cetonas.

El análisis de GC-MS del bioaceite

La GC-MS se utilizó para comprender mejor la composición del producto líquido y para confirmar los resultados de los análisis de FT-IR y RMN. La GC-MS mostró claramente que la temperatura de licuefacción afectaba a los componentes de los bioaceites1. La identificación de los principales picos de compuestos se realizó utilizando la base de datos de espectros de masas del NIST. Los experimentos de HTL dieron como resultado bioaceites procedentes de la descomposición de lignina, proteínas, flavonoides y lípidos, junto con una serie de compuestos derivados de los carbohidratos. Los componentes de los bioaceites se identificaron como compuestos aromáticos monocíclicos y policíclicos, cetonas, aldehídos, ésteres, alcoholes, amidas y otros compuestos que contienen nitrógeno (incluyendo amidas y compuestos N-heterocíclicos) e hidrocarburos. Se realizó un análisis semicuantitativo calculando el porcentaje relativo del área de los picos cromatográficos con los resultados que se muestran en la Tabla 3. Los principales compuestos observados en la licuefacción hidrotermal de A. filiculoides fueron la metilpirazina, la 2-metilciclopenten-1-ona, el fenol, el 2-metoxifenol, el 3-piridinol, el catecol, la l-prolina, el N-butoxi carbonil-éster, el ftalato de bis(2-etilhexilo) y el beta-sitosterol. A medida que la temperatura de licuefacción hidrotermal variaba de 260 a 300 °C, se producían diferentes compuestos, así como diferentes proporciones de los mismos. El porcentaje de área de los compuestos fenólicos, como el fenol (6,1-18,8 % de área) y el catecol (10,0-15,7 % de área), se incrementó al aumentar la temperatura de 260 a 280 °C, pero luego disminuyó hasta el 11,1 % de área para el fenol y el 11,8 % de área para el catecol a 300 °C. Los fenoles en el bioaceite de A. filiculoides se produjeron probablemente a partir de la lignina o de la porción de carbohidratos de la biomasa . Los compuestos nitrogenados se forman por reacciones de descarboxilación, desaminación, deshidratación, despolimerización y descomposición de las proteínas . El mayor porcentaje de área de 3-pirindiol (13,3 % de área) se observó a la temperatura más baja de 260 °C y disminuyó a 11,9 y 10,1 % de área para 280 y 300 °C, respectivamente. Además, se observó el área más alta (13,6, 12,4 y 8,7 % de área) a 260, 280 y 300 °C. Como la composición del producto líquido es tan compleja, sería necesaria una mejora adicional, como la desnitrogenación y la desoxigenación, para hacer que el bioaceite sea adecuado para los combustibles de los motores.

La composición de las moléculas obtenidas en el bioaceite de HTL se comparó con el espectro de moléculas identificado en el bioaceite generado por pirólisis . A diferencia del HTL, la pirólisis es la descomposición termoquímica de la materia orgánica seca con un contenido de humedad inferior al 10% de la fracción de masa en ausencia de oxígeno, a presión atmosférica y a temperaturas más altas (350-550 °C) . Ambas tecnologías termoquímicas mostraron un gran potencial para convertir la biomasa entera de Azolla en bioaceites que tienen densidades energéticas más altas que la materia prima inicial de la biomasa. Los bioaceites procedentes de ambas reacciones termoquímicas tienen una composición muy compleja como resultado de la despolimerización y descomposición de los monómeros de la biomasa por escisión, deshidratación, descarboxilación y desaminación . Los compuestos derivados de proteínas estaban representados por fenoles, alquilfenoles, pirrolidinona, indol y nitrilo como resultado de la descomposición de los aminoácidos tirosina y fenilalanina presentes en la Azolla . Los productos derivados de los lípidos incluían una gama de alcanos saturados de cadena larga y ácidos grasos de tamaño entre C12 y C21: dodecano, tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano, octadecano, nonadecano, eicosano y heneicosano. En las algas se encontró una mezcla similar de productos bio-líquidos de pirólisis derivados de lípidos de cadena larga. La principal diferencia fue que la pirólisis de A. filiculoides mostró la acumulación de fitol, 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol, alcohol diterpénico acíclico, ya que el producto de la degradación de la clorofila fue el producto de pirólisis más abundante.

Análisis de los productos de los biorresiduos

La figura 7 muestra los espectros FT-IR del alimento de Azolla y de los biorresiduos. Las bandas anchas a 3200-3405 cm-1 se asignan a las vibraciones de estiramiento de los grupos O-H unidos por hidrógeno y de los grupos N-H e indican la presencia de polisacáridos, carbohidratos y proteínas presentes en el pienso de Azolla. Los piensos de Azolla iniciales tienen fuertes picos de vibraciones de estiramiento correspondientes a los grupos O-H y N-H, pero esa transmitancia disminuye en el biorresiduo. El pico a 1030 cm-1 desapareció en el biorresiduo. El pico alrededor de 1600-1620 cm-1 correspondiente a la vibración de flexión N-H estaba presente en el alimento de Azolla y en el biorresiduo de Azolla. Los picos entre 2800 y 2930 cm-1 en los espectros de los residuos se volvieron mucho más débiles que los del alimento crudo de Azolla. La presencia de un único pico a 1590 cm-1, atribuido al estiramiento de C=C, indica la formación de biocarbón aromático.

Los espectros de difracción de rayos X (DRX) del pienso y de los biorresiduos de A.filiculoides a diferentes temperaturas no mostraron diferencias significativas en el difractograma de rayos X del polvo (archivo adicional 8: figura S3). La alimentación y el residuo de biomasa obtenidos a distintas temperaturas mostraron la típica naturaleza amorfa que indica que la estructura del carbono en el residuo es de láminas aromáticas altamente conjugadas reticuladas de forma aleatoria. Los cambios morfológicos fueron evidentes en las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la Azolla y del biorresiduo (Archivo adicional 9: Figura S4). Las imágenes del biorresiduo obtenido por licuefacción hidrotérmica de los tres biocarbones de Azolla mostraron que el residuo era de naturaleza esponjosa, y no había una estructura porosa ordenada.

Producción de hidrógeno a partir de biomasa de Azolla tratada con ácido por Enterobacter cloacae DT-1

Bajo pretratamiento con calor-H2SO4, la biomasa de A. filiculoides se hidrolizó a diferentes azúcares reducidos solubles que consistían principalmente en glucosa (1,18 g/L), xilosa (1,39 g/L) y arabinosa (0,063 g/L). El prehidrolizado tratado con ácido se utilizó como materia prima para la producción de hidrógeno por Enterobacter cloacae (E. cloacae) en modo discontinuo bajo una presión parcial reducida de pH2. El pH2 afecta significativamente a la eficiencia del rendimiento de hidrógeno de la producción fermentativa de hidrógeno por parte de las bacterias anaerobias, ya que las vías de producción de hidrógeno son sensibles a la concentración de hidrógeno, lo que conduce a la inhibición del producto final. Se ha reportado que una alta presión parcial de hidrógeno resulta en la producción de más productos reducidos como etanol y lactato en lugar de acetato, butirato y H2. El fermentador por lotes se dispuso para ejercer presión en el espacio de cabeza del fermentador, lo que permitió que el biogás saliera del espacio de cabeza inmediatamente después de su generación, reduciendo así la presión parcial total y, por lo tanto, la presión parcial de hidrógeno del fermentador por lotes.

La fermentación con E. cloacae DT-1 condujo a la producción de 53 mmol/L de hidrógeno (Tabla 4). Durante la producción de hidrógeno fermentativo, el pH final del caldo de fermentación descendió de 7,5 a 5,42, lo que puede atribuirse a la producción de ácidos grasos orgánicos de cadena corta . La producción total de ácidos grasos volátiles fue de 1150 mg/L, compuesta en gran parte por ácido acético (986 mg/L) y ácido butírico (161 mg/L), con una relación B/A de 0,165. Por lo tanto, la cepa DT-1 siguió la vía del ácido mixto y utilizó eficazmente los azúcares C5 (xilosa, arabinosa y glucosa) del prehidrolizado tratado con ácido. La eficiencia del rendimiento de hidrógeno fue de 2,43 mol de H2/mol de azúcar reductor. Como la máxima eficiencia teórica de rendimiento de hidrógeno de la ruta de fermentación oscura es de 4 mol de H2/mol de glucosa, se obtuvo aproximadamente el 60% del máximo rendimiento de hidrógeno posible a partir del prehidrolizado de biomasa tratado con ácido. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la producción de hidrógeno a partir de los azúcares de la biomasa de A. filiculoides.

Producción de hidrógeno a partir de biomasa de Azolla tratada enzimáticamente por E. cloacae DT-1

La hidrólisis enzimática de biomasa de A. filiculoides tratada con ácido liberó glucosa y xilosa a una concentración de 1,49 y 0,181 g/L, respectivamente. A partir de los azúcares de la biomasa hidrolizada enzimáticamente se obtuvieron alrededor de 34,8 mmol/L de producción volumétrica de hidrógeno (bajo un pH2 reducido). El pH final del caldo de fermentación bajó a 5 durante la producción de hidrógeno, lo que fue acompañado por la producción de ácido acético (990 mg/L) y ácido butírico (164 mg/L). La concentración total de AGV fue de 1156 mg/L y la relación B/A fue de 0,165 (Tabla 4). Estos resultados muestran que se siguió la vía de fermentación de ácidos mixtos. La eficiencia del rendimiento de hidrógeno fue de 2,04 mol de H2/mol de azúcar reductor, por lo que fue inferior a la obtenida a partir del prehidrolizado tratado con ácido. En general, la eficiencia de producción de hidrógeno de la cepa DT-1 a partir de la biomasa de Azolla filiculoides fue de 2,2 ± 2 mol/mol de azúcar reductor. La eficiencia de producción de hidrógeno a partir de Azolla es similar a la obtenida para materia prima lignocelulósica terrestre que cubre el rango de 044-2,76 mol H2/mol de azúcares (Archivo adicional 1: Tabla S1, Archivo adicional 10: Tabla S6).

La relación carbono-nitrógeno (C/N) de la biomasa es importante para la digestión anaerobia eficiente ya que los microorganismos requieren significativamente más C que N (C:N de 25:1) para la producción óptima de hidrógeno. Por esta razón, la aplicación de las microalgas para la producción de hidrógeno es limitada porque son ricas en proteínas y tienen una baja relación C/N (media de 4) . La cofermentación con macroalgas (como Laminaria digitata), que son ricas en carbohidratos con una alta relación (C/N), mejora el rendimiento de la producción de hidrógeno . A. filiculoides contiene un 41 % de carbohidratos totales y un 20 % de proteínas, por lo que el análisis proximal de la biomasa mostró una relación C/N de 15 (archivo adicional 6: tabla S4), lo que se acerca a ser una materia prima eficiente para la producción de biohidrógeno.

Producción de etanol a partir de Azolla filiculoides y A. pinnata

El análisis químico de las biomasas de A. filiculoides y A. pinnata se muestra en el archivo adicional 3: tabla S2. A. filiculoides mostró una alta concentración de biomoléculas que pueden ser utilizadas como materia prima para la producción de bioetanol: almidón (6,05 %), celulosa (21,8 %) y hemicelulosa (13,5 %). Tiene un 10,3 % de lignina, que es más alta que en la lenteja de agua y otras plantas acuáticas, pero más baja que en los principales cultivos bioenergéticos lignocelulósicos (archivo adicional 1: Tabla S1). El análisis químico de A. pinnata mostró una menor concentración de moléculas productoras de bioetanol: almidón (4,7 %), celulosa (12,8 %) y hemicelulosa (10,1 %) y un mayor contenido de lignina (hasta el 13,2 %).

El componente de almidón de A. filiculoides y A. pinnata fue hidrolizado enzimáticamente por α-amilasa y α-amiloglucosidasa, y los componentes de celulosa/hemicelulosa fueron hidrolizados por celulasa y celobiasa. Las cantidades de glucosa liberada se muestran en la Tabla 5. Como se esperaba, la combinación de cuatro enzimas hidrolizando la biomasa de A. filiculoides produjo una mayor cantidad de glucosa que en el caso de A. pinnata (hasta 65,9 y 29,5 g/L, respectivamente). Este rendimiento de glucosa fue mucho mayor que tras el tratamiento de la biomasa de A. filiculoides con una suspensión de Aspergillus niger vivo cultivado en caldo de dextrosa de patata (2,5 g/L de glucosa) mostrado por Pandey et al. .

Tras la fermentación de los azúcares reducidos con Saccharomyces cerevisiae los rendimientos de etanol, YE/G (etanol/glucosa, g/g) reflejaron la cantidad de glucosa liberada en las muestras, con rendimientos de 0,56 g/g observados para A. filiculoides y 0,28 g/g para A. pinnata. El rendimiento de 0,56 g/g es comparable a los registrados en la fermentación de hidrolizados de lenteja de agua y de algunos cultivos energéticos (archivo adicional 1: tabla S1). Curiosamente, la suplementación de la fermentación con nutrientes adicionales no mostró una mejora significativa del rendimiento de etanol (no mostrado). Esto puede explicarse por la presencia de los nutrientes clave para el crecimiento de la levadura en la biomasa de ambas especies de Azolla.

El rendimiento de etanol basado en la biomasa de A. filiculoides (YE/B) se determinó en 0,09 g/g, que es similar al rendimiento de S. cerevisiae ATCC 24859 cultivado en la lenteja de agua L. minor, que contenía una media del 10% de almidón. Se observó un mayor rendimiento de etanol, 0,19 g/g, en la cepa 6000 de Lemna aequinoctialis, que tiene una tasa de crecimiento rápida y la capacidad de acumular altos niveles de almidón (hasta el 39 %) . El potencial de otro representante de la lenteja de agua, Spirodela polyrrhiza, para aumentar su nivel de almidón en condiciones de estrés hasta el 45,7 %, junto con la hidrólisis enzimática con α-amilasa, pullulanasa y α-amiloglucosidasa, condujo a un YE/B de 0,28 g/g . La composición química de las paredes celulares y la menor acumulación de almidón fueron la razón probable del menor rendimiento de etanol de la biomasa de A. pinnata (YE/B = 0,05 g/g). La utilización de diferentes cepas de levadura que puedan fermentar mejor el espectro de azúcares liberados, y que sean más tolerantes a los posibles inhibidores, será el siguiente paso en la optimización del rendimiento de etanol a partir de la biomasa de Azolla.

Azolla como materia prima universal para la producción de biocombustibles

Un análisis sistemático de las plantas terrestres por su potencial para ser cultivos bioenergéticos ideales condujo a una serie de criterios de selección importantes que incluyen: (1) composición química y alta proporción de moléculas productoras de biocombustible; (2) altas tasas de crecimiento/producción de biomasa; (3) alto índice de cosecha/período de rotación; (4) capacidad de crecimiento en tierras marginales y falta de competencia con los cultivos agrícolas por las tierras cultivables; (5) alta eficiencia en el uso de agua dulce y bajo coste de crecimiento; (6) bajo coste de cosecha; y (7) producción de coproductos de alto valor . Estos criterios han desencadenado una intensa búsqueda de la domesticación de la próxima generación de cultivos energéticos.

Las especies de Azolla, junto con su simbionte cianobacteriano evolutivo, A. azollae, han atraído la atención debido a su potencial para abordar todos los criterios mencionados anteriormente. En primer lugar, la biomasa de Azolla contiene los principales tipos de moléculas energéticas que incluyen celulosa/hemicelulosa, almidón y lípidos, asemejándose a las combinaciones de cultivos bioenergéticos terrestres lignocelulósicos, productores de almidón y aceite, y de microalgas/cianobacterias. En segundo lugar, al duplicar su biomasa cada 5-6 días y su alta productividad anual, son una de las plantas de más rápido crecimiento, siendo la segunda después de las microalgas en cuanto a tasas de producción de biomasa. Al igual que las microalgas, su producción de biomasa no es estacional. En tercer lugar, la Azolla puede cultivarse eficazmente fuera de su hábitat natural utilizando las aguas residuales como principal fuente de nutrientes. La biorremediación de las aguas residuales puede conducir a la absorción de hasta 2,6 y 0,434 t/ha-año de N y P totales, respectivamente. La azolla también puede crecer eficientemente en medios con escasez de N, asimilando hasta 0,4 t N/ha-año de nitrógeno de la atmósfera a través de la simbiosis con A. azollae. En cuarto lugar, son fáciles de cosechar. Y, por último, las especies de Azolla se han utilizado durante décadas como biofertilizantes de nitrógeno y como alimento para el ganado y los peces (debido a sus altos niveles de proteínas y carbohidratos). La falta de necesidad de utilizar fertilizantes sintéticos a base de nitrógeno para el cultivo de Azolla tiene un impacto positivo sustancial en la reducción de la generación de óxido nitroso (N2O), cuyo impacto en el calentamiento de la atmósfera es casi 300 veces mayor que el del dióxido de carbono.

Tecnologías termoquímicas

La biomasa de Azolla se utilizó como materia prima para la producción de bioaceite, biocarbón y biogás utilizando dos tecnologías termoquímicas, la pirólisis y el HTL (este trabajo). Dada la elevada productividad anual de la Azolla, esto conduce a la producción teórica de bioaceites basados en la pirólisis y en la HTL, valorados en 13,2 y 20,2 t/ha-año, respectivamente. Ambos bioaceites contienen una serie de productos petroquímicos que pueden utilizarse directamente como componentes sin glicerina del biodiésel o pueden convertirse en biocombustibles mediante algunas tecnologías bien establecidas. Ambas tecnologías termoquímicas también pueden producir biosólidos, como el biocarbón y las cenizas (hasta 48 t/ha-año en ambos casos), que pueden utilizarse para mejorar la calidad del suelo aumentando su capacidad de retención de nutrientes y humedad, apoyar a las comunidades microbianas y promover la actividad radicular . La ceniza de Azolla contiene elementos alcalinos (Li, Na, K, Mg, Ca) así como microelementos como Fe, Mn y Cu, lo que la convierte en un buen candidato para su uso como fertilizante.

Producción de biodiésel

Cuando se cultiva en aguas residuales, el rendimiento teórico anual de lípidos crudos de A. filiculoides puede estimarse en 1,68 t/ha-año. Esta cantidad puede aumentar hasta 8 t/ha-año si la planta crece en condiciones naturales con una productividad de unas 100 t dw/ha-año. Esta productividad de aceite es significativamente superior a la de la soja (0,44 t/ha-año), el girasol (0,78 t/ha-año), la colza (1,17 t/ha-año) y la palma aceitera (6,0 t/ha-año), pero inferior al rendimiento teórico de las microalgas (hasta 73 t/ha-año, para Nannochloropsis sp.) . Como la Azolla/A. azollae contiene una gama de ácidos grasos C16:0, C18:2 y C18:3, su conversión en ésteres metílicos significa que el biodiésel resultante cumple los requisitos cruciales de densidad de combustible, número de cetano y valor de yodo para el biodiésel establecidos por la norma EN14214 .

Producción de etanol

La producción teórica de etanol a partir de A. filiculoides es de 9,3 t/ha-año (11,7 × 103 L/ha-año, sobre la base de un volumen específico de etanol = 0,789 g/mL) que es inferior a la producción de etanol a partir de la caña de azúcar (25 × 103 L/ha-año), cercana a la del rastrojo de maíz (13.31 × 103 L/ha-año), pero superior a la de miscanthus (2,3 × 103 L/ha-año), sauce (0,3 × 103 L/ha-año) y álamo (1,3 × 103 L/ha-año) (Archivo adicional 1: Tabla S1).

Producción de biohidrógeno

El alto rendimiento de producción de biomasa, la composición química (relación C/N) y el alto rendimiento de biohidrógeno de 2.2 mol/mol de sustrato hacen de Azolla una materia prima competitiva para la producción de hidrógeno en comparación con otros cultivos bioenergéticos (Archivo adicional 1: Tabla S1, Archivo adicional 10: Tabla S6).