Akvatisk plante Azolla som universelt råmateriale til produktion af biobrændstof

Behandling af syntetisk spildevand med Azolla filiculoides

For bioremedieringsforsøget blev der fremstillet selenrigt syntetisk spildevand (SeSW) ved at blande en høj koncentration af fosfater (PO4-P), 1.3 g/L med en moderat mængde ammoniak (NH4-N), 55 mg/L, og en lav koncentration af nitrat (NO3-N), 15 mg/L (Additional file 4: Table S3). Denne sammensætning simulerer karakteristika for spildevand fra typiske tekstilfarvnings-, efterbehandlings- og vaskepulverproduktionsindustrier . Spildevandet blev suppleret med 0,8 mg/L SeO2. I dette forsøg anvendte vi 5 dages behandling af SeSW med A. filiculoides. Vækstraten for nogle af de vandplanter, der vokser på spildevand, stiger normalt eksponentielt efter en forsinkelsesfase, der observeres i løbet af de første 4-5 dage, hvor biomassen ikke ændrer sig væsentligt . Denne periode er imidlertid forbundet med den intensive optagelse af de vigtigste næringsstoffer fra spildevand, hvilket fører til en stærk eksponentiel vækst af vandplanter efter forsinkelsesfasen . Fjernelse af næringsstoffer i SeSWW i løbet af de første 5 dage af behandlingen med A. filiculoides førte ikke til statistisk signifikante ændringer (P ≤ 0,05) i biomasseproduktionen (0,3 ± 0,1 g dw). Det førte imidlertid til op til 25,4 % optag af NH4-N, 69,5 % optag af NO3-N og 24,3 % optag af PO4-P fra 100 % SeSW (tabel 1; fig. 1). Fortyndet (50 %) SeSW var mindre stressende for A. filiculoides, hvilket afspejles i den højere optagelseshastighed af næringsstoffer: 33,4, 93 og 39,8 % for henholdsvis NH4-N, NO3-N og PO4-P. A. filiculoides’ optagelse af næringsstoffer er tidligere blevet rapporteret af flere forskningsgrupper.

Behandling af SeSW med A. filiculoides førte til 40 % optagelse af Se fra 100 % SeSW og 76 % optagelse fra 50 % SeSW med absorptionsrater på henholdsvis 47,6 µg Se/L-dag og 39,9 µg Se/L-dag (fig. 2; tabel 2). Dette var korreleret med akkumuleringsrater på 158,8 µg Se/g dw-dag i A. filiculoides fra 100 % SeSW og 133,5 µg Se/g dw-dag fra 50 % SeSW (tabel 2). Denne absorptionseffektivitet svarer til 85 og 83 % af den teoretiske maksimale absorptionsværdi for henholdsvis 50 % SeSW og 100 % SeSW. En anden Azolla-repræsentant, Azolla caroliniana, som absorberede op til 1 mg Se/g dw fra 2,5 mg/L Se-opløsning i løbet af 2 ugers behandling, viste en nogenlunde tilsvarende absorptionshastighed af Se . Dette er højere end for andre vandplanter, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) og Eichhornia (300 mg Se/g dw) .

Den overlevelsesrate af P. australiensis, der udsættes for fortyndinger af SeSW, er vist i Additional file 5: Figur S2. Der var nul overlevelse (0 %), når de blev udsat i 96 timer for 100 % ubehandlet (kontrol) SeSW i 100 % ubehandlet SeSW. Der blev heller ikke observeret nogen levende rejer i enten 80 % eller 50 % SeSW. Efter behandling med A. filiculoides blev SeSW’s toksicitet reduceret 2,6 gange, idet LC50 steg fra 11,22 til 29,80 %. Dette indikerede, at når 100 % SeSW blev behandlet med A. filiculoides, blev dets toksicitet reduceret betydeligt efter kun 5 dages behandling.

Biofuelproduktion fra Azolla

Ultimative og proximate analyser af Azolla filiculoides

Resultaterne af de proximate og ultimative analyser af A. filiculoides-prøven, herunder det samlede indhold af flygtige stoffer, fugt, fast kulstof og aske (dvs. uorganiske komponenter i prøverne), er opsummeret i Additional file 6: Tabel S4. De samlede flygtige stoffer indsamlet ved 950 °C udgør 88 % af det samlede produkt. Det samlede produkt indeholdt 11 % vand, 7,3 % aske og 4,4 % fast kulstof. Proximatanalysen viste, at nøgleelementerne bestod af 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O og 0,2 % S (beregnet ved differens).

Thermogravimetriske analyser af Azolla filiculoides

TGA-DTG-analyse af A. filiculoides-prøven blev udført ved et temperaturområde fra 23-900 °C med en opvarmningshastighed på 10 °C/min under nitrogenatmosfære og er vist i fig. 3. TGA- og DTG-kurverne afslørede de tre faser af nedbrydningen af A. filiculoides i pyrolyseprocessen; lignende resultater blev rapporteret af Agrawal og Chakraborty . Biomassen gennemgik tre faser af vægttab, en mellem 154 og 160 °C, den anden ved 180 og 580 °C og den tredje ved ca. 580 og 900 °C. Den første zone repræsenterer et lille vægttab (7 %) forårsaget af dehydrering af biomasseprøven. Størstedelen af vægttabet (51 %) som følge af pyrolyse fandt sted i den anden zone, hvor de fleste flygtige stoffer frigives; den kraftige top angiver nedbrydningen af proteiner, kulhydrater og lipider . I den tredje zone sker der en nedbrydning af det kulstofholdige produkt, og vægttabet skyldes således hovedsagelig forgasning, hvor meget ikke-flygtige kulstofforbindelser fordamper og danner CO og CO2 på grund af de høje temperaturer .

Hydrotermisk flydendegørelse af Azolla filiculoides

Hydrotermisk flydendegørelse af A. filiculoides blev udført med destilleret vand som opløsningsmiddel ved 260, 280 og 300 °C med opholdstider på 15 minutter. Reaktionsbetingelserne blev valgt på grundlag af vores tidligere undersøgelser og litteratur for at forstå virkningen af temperatur på bioolieproduktudbyttet af A. filiculoides under subkritisk vand . Produktfordelingen af den HTL-behandlede prøve af A. filiculoides er vist i fig. 4. Det samlede udbytte af bioolie var 15,83, 21,50 og 16,0 % ved henholdsvis 260, 280 og 300 °C; det maksimale udbytte blev således opnået ved 280 °C. Den samlede bioolie bestod af etherfraktionen (Bio-oil1), der blev fremstillet ved ekstraktion af den flydende del, og acetonefraktionen (Bio-oil2), der blev fremstillet ved ekstraktion af den faste fraktion (“Metoder”). Bio-oil2 havde en høj viskositet og viste sig at være en tjæreagtig væske. Udbyttet af den faste rest faldt kontinuerligt fra 66,83 til 33,83 %, efterhånden som temperaturen steg fra 260 til 300 °C. Udbyttet af gasser faldt i overgangen fra 260 til 280 °C. Når temperaturen var højere end 280 °C, steg udbyttet af gasser til 7,1 %. HTL af A. filiculoides-biomasse viste en lignende fordeling af de to hovedprodukter, biogas og biokul, med data opnået efter pyrolyse med en gennemsnitlig biogas på 6,05 og 12 % for henholdsvis HTL og pyrolyse, og biokul omkring 50 % for begge. HTL producerede et højere niveau af bioolie på op til 21,5 % (14 % for pyrolyse). Der blev opnået lignende resultater ved sammenligning med udbyttet af bioolie opnået ved både pyrolyse og HTL af mikroalger .

Foruden materialebalancedataene blev omdannelsen på grundlag af det samlede organiske kulstof (TOC), der blev opnået efter hydrotermisk flydendegørelse ved forskellige temperaturer, undersøgt, og resultaterne er præsenteret i Additional file 7: Tabel S5. Der var 46,9 % organisk kulstof i foderet, hvilket svarer til 2,8 g organisk kulstof i de 6 g af prøven, der blev anvendt til hydrotermisk flydendegørelse. Omsætningen af organisk kulstof steg fra 13,93 til 48,93 % med stigningen i temperaturen fra 260 til 300 °C. Resultaterne viste, at ved en lavere temperatur var nedbrydningen af biomassen ufuldstændig og efterlod en stor mængde uomdannet biomasse, som kan undertrykke biooliedannelsen. En yderligere temperaturstigning kunne fremskynde nedbrydningen af råmaterialet og gavnede biooliedannelsen; en yderligere temperaturstigning, højere end 280 °C i vores forsøg, ville imidlertid nedbryde den tidligere dannede bioolie/intermediater til gasser og vandopløselige produkter og dermed føre til et fald i bioolieudbyttet. Det reducerende udbytte af den faste rest (bio-char) tydede på en stigning i den samlede biomassekonvertering, når temperaturen blev hævet fra 260 til 300 °C.

Fouriertransform-infrarød spektroskopi af bio-olie

FT-IR-spektre af A. filiculoides-foder og bioolie1 fremstillet ved HTL ved 260, 280 og 300 °C er vist i figur 5A og B. Det brede bånd ved ca. 3200-3405 cm-1 tilskrives O-H- eller N-H-strækningsvibrationen forårsaget af vand eller O-H-grupper eller N-H-grupper, der er til stede i bioolien (figur 5B). Der blev vist en bred absorbans ved omkring 3314 cm-1 for råvaren, hvilket indikerede et højt indhold af kulhydrater og proteiner (Fig. 5A).

Bioolierne viste en svagere absorbans ved 3200-3405 cm-1, hvilket tyder på, at både kulhydrater og proteiner blev nedbrudt i HTL-processen (fig. 5B). Båndene fra 2854 til 2950 cm-1 var stærkere for alle bioolierne på grund af C-H strækningsvibrationer, hvilket indikerer tilstedeværelsen af alkyl-C-H-grupper. C=O-strækningsvibrationen omkring 1645-1720 cm-1 i bioolierne indikerer tilstedeværelsen af ketoner, aldehyder, estere eller syrer . De bøjende vibrationsbånd omkring 1580-1650 cm-1 indikerer tilstedeværelsen af N-H-grupper fra aminer. Båndene i området fra 1430 til 1480 cm-1 blev tilskrevet α-CH2-bøjningsvibrationer, der er til stede i bioolierne. Tilstedeværelsen af C-N-strækningsbånd omkring 1266-1342 cm-1 i bioolierne skyldes aromatiske amingrupper. Nogle andre absorbanstoppe ved 780-850 cm-1 skyldes også C-H-bøjningsvibrationer fra aromatiske stoffer, der er ude af plan. Båndet ved 1040 cm-1 optrådte kun i absorptionsprofilen af A. filiculoides-foderet og kunne være C-O forbundet med hydroxylgrupper, der blev dehydreret efter væskeopløsning. Samlet set viser spektrene af bioolie1-prøverne fra HTL ved de forskellige temperaturer de samme toppe, hvilket indikerer tilstedeværelsen af de samme funktionelle grupper, og var de forskellige toppe opnået i NMR-spektrene.

NMR-analyse af bioolie

NMR-analyse af bioolie1-prøverne blev foretaget for at forstå forholdet mellem de kemiske miljøer af protonerne. NMR-spektre gav supplerende oplysninger om funktionelle grupper i forhold til FTIR-spektre og mulighed for at kvantificere og sammenligne integrationsområder mellem spektrerne. I lighed med FT-IR viste 1H NMR-spektre en høj procentdel alifatiske funktionelle grupper for alle bioolier, og en oversigt over integrerede peakarealområder, der er tildelt forskellige funktionelle gruppeklasser, findes i fig. 6. Den mest opadgående område i spektret, fra 0,5 til 1,5 ppm, repræsenterer alifatiske protoner, der er knyttet til kulstofatomer mindst to bindinger væk fra et C=C- eller heteroatom (O eller N). Det næste integrerede område fra 1,5 til 3,0 ppm repræsenterer protoner på alifatiske kulstofatomer, der kan være bundet til en C=C-dobbeltbinding. Alle bioolierne havde en højere procentdel af protoner i spektralområdet fra 0,5 til 3,0 ppm. De havde en højere procentdel (63,15-71,76 %) af protoner i området fra 0,5 til 1,5 end området fra 1,5 til 3,0 (18,73-28,8 %), hvilket muligvis skyldes det store antal nitrogenholdige og oxygenholdige forbindelser, der har vist sig at resonere i dette område, som kan stamme fra råmaterialets høje proteinindhold.

Den næste del af 1H NMR-spektret ved 3,0-4,5 ppm repræsenterer methoxylprotoner eller en methylengruppe, der forbinder to aromatiske ringe; der blev observeret meget lave protonprocenter i dette område. Alle bioolier viste en lav procentdel af methoxy/kulhydratfunktionalitet (4,5-6,0 ppm). I dette område var de maksimale protonprocentværdier for bioolierne 4,33 og 4,32 % for væskeopløsninger ved 260 og 280 °C og den markant lavere værdi på 0,94 % for væskeopløsninger ved 300 °C. Spektrumområdet mellem 6,0 og 8,5 ppm svarer til det aromatiske område. Det maksimale protonindhold på ca. 7,2 % i dette område blev opnået for bioolien fremstillet ved 300 °C. Aromatisk/heteroaromatisk funktionalitet blev observeret i alle bioolierne (6,0-8,5 ppm), hvilket stemmer overens med resultaterne fra FT-IR-spektroskopi. De nedadrettede spektrumområder (8,5-10 ppm) stammer fra aldehyder. Aldehydfunktionaliteten (9,5-10,0 ppm) var fraværende i alle bioolier på trods af de C=O-funktionelle grupper (1645-1720 cm-1), der blev observeret ved FT-IR. Forekomsten af sådanne FT-IR-bånd kan også skyldes andre carbonylbærende grupper som protonerede carboxylsyrer, carboxylsyreestere, amider og ketoner.

GC-MS analyse af bioolie

GC-MS blev udnyttet til yderligere at forstå sammensætningen af det flydende produkt og til at bekræfte resultaterne af FT-IR- og NMR-analyserne. GC-MS viste tydeligt, at forvæsknings-temperaturen påvirkede biooliens komponenter1. Identifikationen af hovedtoppene af forbindelser blev udført ved hjælp af NIST’s massespektraldatabase. HTL-eksperimenterne resulterede i bioolier, som opstod ved nedbrydning af lignin, proteiner, flavonoider og lipider sammen med en række forbindelser af kulhydratafledte stoffer. Komponenterne i bioolierne blev identificeret som mono- og polycykliske aromatiske forbindelser, ketoner, aldehyder, estere, alkoholer, amider og andre nitrogenholdige forbindelser (herunder amider og N-heterocykliske forbindelser) samt kulbrinter. Der blev foretaget en semikvantitativ analyse ved beregning af den relative procentdel af arealet af de kromatografiske toppe, og resultaterne er vist i tabel 3. De vigtigste forbindelser, der blev observeret ved den hydrotermiske flydendegørelse af A. filiculoides var methylpyrazin, 2-methyl 2-cyclopenten-1-on, phenol, 2-methoxyphenol, 3-pyridinol, catechol, prolin, N-butoxycarbonyl-butylester, bis(2-ethylhexyl)phthalat og beta-sitosterol. Da den hydrotermiske forvæsknings-temperatur varierede fra 260 til 300 °C, blev der dannet forskellige forbindelser og også forskellige proportioner af forbindelser. Arealprocenten af phenolforbindelser såsom phenol (6,1-18,8 areal %) og catechol (10,0-15,7 areal %) steg, efterhånden som temperaturen steg fra 260 til 280 °C, men faldt derefter til 11,1 areal % for phenol og 11,8 areal % for catechol ved 300 °C. Phenolerne i bioolien fra A. filiculoides blev sandsynligvis produceret fra lignin- eller kulhydratdelen af biomassen . Nitrogenerede forbindelser dannes ved decarboxylering, deaminering, dehydrering, depolymerisering og nedbrydningsreaktioner af proteiner . Det højeste procentvise areal af 3-pyrindiol (13,3 areal %) blev observeret ved den laveste temperatur på 260 °C og faldt til henholdsvis 11,9 og 10,1 areal % ved 280 og 300 °C. Desuden blev der observeret det største areal på ca. (13,6, 12,4 og 8,7 areal %) ved 260, 280 og 300 °C. Da sammensætningen af det flydende produkt er så kompleks, vil det være nødvendigt med yderligere opgradering, såsom denitrogenering og deoxygenering, for at gøre bioolien egnet til motorbrændstof.

Sammensætningen af molekyler opnået i bioolien fra HTL blev sammenlignet med det molekylspektrum, der blev identificeret i den pyrolyseproducerede bioolie . I modsætning til HTL er pyrolyse den termokemiske nedbrydning af tørt organisk materiale med et vandindhold på under 10 % massefraktion i fravær af ilt ved atmosfærisk tryk og højere temperaturer (350-550 °C) . Begge termokemiske teknologier viste et stort potentiale for omdannelse af hele Azolla-biomassen til bioolier, som har en højere energitæthed end det oprindelige biomasseudgangsmateriale. Bioolier fra begge termokemiske reaktioner har en meget kompleks sammensætning som følge af depolymerisering og nedbrydning af biomassens monomerer ved spaltning, dehydrering, dekarboxylering og deaminering . Proteinafledte forbindelser var repræsenteret af phenoler, alkylphenoler, pyrrolidinon, indol og nitril som følge af nedbrydning af aminosyrerne tyrosin og phenylalanin, der findes i Azolla . Lipidafledte produkter omfattede en række langkædede mættede alkaner og fedtsyrer med en størrelse fra C12 til C21: dodecan, tridecan, tetradecan, pentadecan, hexadecan, heptadecan, octadecan, nonadecan, eicosan og heneicosan. En lignende blanding af langkædede lipidafledte alkaner, der stammer fra pyrolyse-biovæskeprodukter, blev fundet i alger . Den væsentligste forskel var, at pyrolysen af A. filiculoides viste akkumulering af phytol, 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, acyklisk diterpenalkohol, som et produkt af nedbrydningen af klorofyl var det hyppigst forekommende pyrolyseprodukt.

Analyse af bio-residualprodukter

Figur 7 viser FT-IR-spektre af Azolla-foderet og bio-residualerne. De brede bånd ved 3200-3405 cm-1 er tildelt strækningsvibrationerne fra hydrogenbundne O-H-grupper og N-H-grupper og indikerer tilstedeværelsen af polysaccharider, kulhydrater og proteiner i Azolla-foderet. De oprindelige Azolla-foderstoffer har stærke strækningsvibrationstækker svarende til O-H- og N-H-grupperne, men denne transmission falder i bio-residuen. Toppen ved 1030 cm-1 forsvandt i bio-residuen. Toppen omkring 1600-1620 cm-1 svarende til N-H-bøjningsvibrationen var til stede i Azolla-foderet og Azolla-bioresiduen. Toppene mellem 2800 og 2930 cm-1 i spektret af restprodukterne blev meget svagere end i Azolla-råfoderet. Tilstedeværelsen af et enkelt peak ved 1590 cm-1, der tilskrives C=C-strækningen, indikerer dannelsen af aromatisk biokul .

Røntgenpulverdiffraktionsspektre (XRD) af A.filiculoides-foder og bio-residue ved forskellige temperaturer viste ingen signifikante forskelle i pulverrøntgendiffraktogrammet (Additional file 8: Figur S3). Biomassefoderet og restprodukterne ved forskellige temperaturer viste typisk amorf karakter, hvilket indikerer, at kulstofstrukturen i restprodukterne er stærkt konjugerede aromatiske ark, der er tværbundet på en tilfældig måde. Morfologiske ændringer var tydelige i billederne af Azolla- og bioaffaldet ved scanningelektronmikroskopi (SEM) (Yderligere fil 9: Figur S4). Billederne af bio-residuen, der er fremstillet ved hydrotermisk flydendegørelse af de tre Azolla-biokarsten, viste, at residuet var svampet i naturen, og at der ikke var nogen ordnet porøs struktur.

Hydrogenproduktion fra syrebehandlet Azolla-biomasse af Enterobacter cloacae DT-1

Under varme-H2SO4-forbehandling blev A. filiculoides-biomasse hydrolyseret til forskellige opløselige reducerede sukkerarter, der hovedsageligt bestod af glukose (1,18 g/L), xylose (1,39 g/L) og arabinose (0,063 g/L). Det syrebehandlede præ-hydrolysat blev anvendt som råmateriale til brintproduktion af Enterobacter cloacae (E. cloacae) i batch-mode under nedsat partialtryk pH2. pH2 påvirker i betydelig grad effektiviteten af brintudbyttet ved fermentativ brintproduktion af anaerobe bakterier, da brintproduktionsvejene er følsomme over for brintkoncentrationen, hvilket fører til hæmning af slutproduktet. Det er blevet rapporteret, at et højt partialtryk for brint resulterer i produktion af flere reducerede produkter som ethanol og laktat i stedet for acetat, butyrat og H2. Batchfermenteren var indrettet således, at der blev udøvet tryk på fermenterens hovedrum, hvilket gjorde det muligt for biogassen at passere ud af hovedrummet umiddelbart efter dens dannelse, hvorved det samlede partialtryk og dermed brintpartialtrykket i batchfermenteren blev reduceret.

Fermentering med E. cloacae DT-1 førte til produktion af 53 mmol/L brint (tabel 4). Under den fermentative brintproduktion faldt den endelige pH-værdi i gæringsbouillonen fra 7,5 til 5,42, hvilket kan tilskrives produktionen af kortkædede organiske fedtsyrer . Den samlede produktion af flygtige fedtsyrer var på 1150 mg/L og bestod hovedsagelig af eddikesyre (986 mg/L) og smørsyre (161 mg/L) med et B/A-forhold på 0,165. DT-1-stammen fulgte således den blandede syrevej og udnyttede effektivt C5-sukkerstofferne (xylose, arabinose og glucose) fra det syrebehandlede præhydrolysat. Brintudbytteeffektiviteten var 2,43 mol H2/mol reducerende sukker. Da den maksimale teoretiske brintudbytteeffektivitet ved mørk fermentering er 4 mol H2/mol glukose, blev ca. 60 % af det maksimale mulige brintudbytte opnået fra det syrebehandlede præhydrolysat af biomasse. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om brintproduktion fra sukker fra A. filiculoides biomasse.

Hydrogenproduktion fra enzymatisk behandlet Azolla biomasse af E. cloacae DT-1

Enzymatisk hydrolyse af syrebehandlet A. filiculoides biomasse frigjorde glukose og xylose i en koncentration på henholdsvis 1,49 og 0,181 g/L. Omkring 34,8 mmol/L volumetrisk brintproduktion (under nedsat pH2) blev opnået fra de enzymatisk hydrolyserede biomassesukkerstoffer. Den endelige pH-værdi i gæringsbouillonen faldt til 5 under brintproduktionen, hvilket blev ledsaget af produktion af eddikesyre (990 mg/L) og smørsyre (164 mg/L). Den samlede VFA-koncentration var 1156 mg/L, og B/A-forholdet var 0,165 (tabel 4). Disse resultater viser, at der blev fulgt den blandede syrefermenteringsvej. Brintudbytteeffektiviteten var 2,04 mol H2/mol reducerende sukker; den var derfor lavere end den, der blev opnået fra det syrebehandlede præhydrolysat. Samlet set var brintudbytteeffektiviteten for DT-1-stammen fra Azolla filiculoides-biomasse 2,2 ± 2 mol/mol reducerende sukker. Effektiviteten af brintproduktion fra Azolla svarer til den, der er opnået for terrestrisk lignocelluloseholdigt råmateriale, som dækker intervallet 044-2,76 mol H2/mol sukker (Yderligere fil 1: Tabel S1, Yderligere fil 10: Tabel S6).

Forholdet mellem kulstof og kvælstof (C/N) i biomassen er vigtigt for en effektiv anaerob nedbrydning, da mikroorganismer kræver betydeligt mere C end N (C:N på 25:1) for optimal brintproduktion. Af denne grund er anvendelsen af mikroalger til brintproduktion begrænset, fordi de er rige på proteiner og har et lavt C/N-forhold (gennemsnitligt 4) . Samfermentering med makroalger (f.eks. Laminaria digitata), som er rige på kulhydrater med et højt (C/N)-forhold, forbedrer brintproduktionen . A. filiculoides indeholder 41 % kulhydrater i alt og 20 % proteiner, og som følge heraf viste en proximal analyse af biomassen et C/N på 15 (Additional file 6: Tabel S4), hvilket er tæt på at være et effektivt råmateriale til produktion af bio-brint.

Ethanolproduktion fra Azolla filiculoides og A. pinnata

Kemisk analyse af A. filiculoides og A. pinnata biomasser er vist i Additional file 3: Tabel S2. A. filiculoides viste en høj koncentration af biomolekyler, der kan anvendes som råmateriale til produktion af bioethanol: stivelse (6,05 %), cellulose (21,8 %) og hemicellulose (13,5 %). Den indeholder 10,3 % lignin, hvilket er højere end i andemad og andre vandplanter, men lavere end i de vigtigste lignocelluloseholdige bioenergiafgrøder (Additional file 1: Tabel S1). Den kemiske analyse af A. pinnata viste en lavere koncentration af bioethanolproducerende molekyler: stivelse (4,7 %), cellulose (12,8 %) og hemicellulose (10,1 %) og et højere indhold af lignin (op til 13,2 %).

Stivelseskomponenten i A. filiculoides og A. pinnata blev enzymatisk hydrolyseret af α-amylase og α-amyloglucosidase, og cellulose-/hemicellulosekomponenterne blev hydrolyseret af cellulase og cellobiase. Mængderne af frigivet glukose er vist i tabel 5. Som forventet producerede kombinationen af fire enzymer, der hydrolyserede A. filiculoides-biomasse, en større mængde glukose end for A. pinnata (op til henholdsvis 65,9 og 29,5 g/L). Dette glukoseudbytte var meget højere end efter behandling af A. filiculoides-biomassen med en suspension af levende Aspergillus niger dyrket på kartoffeldextrose-bouillon (2,5 g/L glukose), som vist af Pandey et al. .

Efter fermentering af reduceret sukker med Saccharomyces cerevisiae afspejlede ethanoludbyttet, YE/G (ethanol/glukose, g/g) mængden af frigivet glukose i prøverne, med et udbytte på 0,56 g/g for A. filiculoides og 0,28 g/g for A. pinnata. Udbyttet på 0,56 g/g er sammenligneligt med det udbytte, der er rapporteret fra fermentering af hydrolysater af andentang og visse energiafgrøder (Additional file 1: Tabel S1). Det er interessant, at supplering af fermenteringen med yderligere næringsstoffer ikke viste nogen signifikant forøgelse af ethanoludbyttet (ikke vist). Dette kan forklares ved tilstedeværelsen af de vigtigste næringsstoffer til gærvækst i biomassen af begge Azolla-arter.

Ethanoludbyttet baseret på A. filiculoides biomasse (YE/B) blev bestemt til 0,09 g/g, hvilket svarer til udbyttet fra S. cerevisiae ATCC 24859 dyrket på andemad L. minor, som i gennemsnit indeholdt 10 % stivelse . Et højere ethanoludbytte, 0,19 g/g, blev observeret for Lemna aequinoctialis stamme 6000, som har en hurtig væksthastighed og evnen til at akkumulere høje niveauer af stivelse (op til 39 %) . Potentialet hos en anden repræsentant for andemad, Spirodela polyrrhiza, til at øge sit stivelsesniveau under stressbetingelser med op til 45,7 % sammen med enzymatisk hydrolyse med α-amylase, pullulanase og α-amyloglucosidase førte til et YE/B på 0,28 g/g . Den kemiske sammensætning af cellevæggene og den lavere stivelsesakkumulering var den sandsynlige årsag til det lavere ethanoludbytte fra A. pinnata-biomasse (YE/B = 0,05 g/g). Udnyttelse af forskellige gærstammer, som bedre kan fermentere spektret af frigjorte sukkerarter og er mere tolerante over for de potentielle inhibitorer, vil være det næste skridt i optimeringen af ethanoludbyttet fra Azolla biomasse.

Azolla som universelt råmateriale til biobrændstofproduktion

En systematisk analyse af landplanter for deres potentiale til at være ideelle bioenergiafgrøder førte til en række vigtige udvælgelseskriterier, som omfatter: (1) kemisk sammensætning og høj andel af biobrændstofproducerende molekyler, (2) høj vækstrate/biomasseproduktion, (3) højt høstindeks/rotationsperiode, (4) evne til at vokse på marginale arealer og manglende konkurrence med landbrugsafgrøder om agerjord, (5) høj ferskvandsforbrugseffektivitet og lave vækstomkostninger, (6) lave høstomkostninger og (7) produktion af samprodukter af høj værdi. Disse kriterier har udløst en intensiv søgen efter domesticering af den næste generation af energiafgrøder.

Azolla-arter har sammen med deres evolutionære cyanobakterielle symbiont, A. azollae, tiltrukket sig opmærksomhed på grund af deres potentiale til at opfylde alle de ovennævnte kriterier. For det første indeholder Azolla’s biomasse hovedtyper af energimolekyler, som omfatter cellulose/hemicellulose, stivelse og lipider, der ligner kombinationer af lignocellulose-, stivelses- og olieproducerende terrestriske bioenergiafgrøder og mikroalger/cyanobakterier. For det andet er de en af de hurtigst voksende planter, idet de fordobler deres biomasse hver 5-6 dag og har en høj årlig produktivitet, hvilket gør dem til en af de hurtigst voksende planter, idet de kommer på andenpladsen efter mikroalger med hensyn til biomasseproduktionshastighed. I lighed med mikroalger er deres biomasseproduktion ikke sæsonbestemt. For det tredje kan Azolla dyrkes effektivt uden for deres naturlige levested ved hjælp af spildevand som deres vigtigste næringsstofkilde. Bioremediering af spildevand kan føre til absorption af op til 2,6 og 0,434 t/ha år af henholdsvis N og P i alt . Azolla kan også vokse effektivt i N-udtømte medier og assimilere op til 0,4 t N/ha-år kvælstof fra atmosfæren gennem symbiose med A. azollae. For det fjerde er de lette at høste. Og endelig har azolla-arter i årtier været anvendt som kvælstofbiogødning og foder til husdyr og fisk (på grund af deres høje protein- og kulhydratindhold). Det manglende behov for at anvende syntetisk kvælstofbaseret gødning til dyrkning af Azolla har en væsentlig positiv indvirkning på reduktionen af dannelsen af lattergas (N2O), hvis indvirkning på opvarmningen af atmosfæren er næsten 300 gange større end kuldioxid .

Thermokemiske teknologier

Azollabiomasse blev anvendt som råmateriale til produktion af bioolie, biokul og biogas ved hjælp af to termokemiske teknologier, pyrolyse og HTL (dette arbejde). I betragtning af Azolla’s høje årlige produktivitet fører dette til en teoretisk produktion af pyrolyse- og HTL-baserede bioolier på op til henholdsvis 13,2 og 20,2 t/ha-år. Begge bioolier indeholder en række petrokemiske stoffer, som kan anvendes direkte som glycerinfrie komponenter i biodiesel eller kan opgraderes til biobrændstoffer ved hjælp af nogle veletablerede teknologier . Begge termokemiske teknologier kan også producere bioopløsninger som f.eks. biokul og aske (op til 48 t/ha-år for begge teknologier), som kan anvendes til at forbedre jordkvaliteten ved at øge jordens nærings- og fugtighedsopbevaringskapacitet, støtte mikrobielle samfund og fremme rodaktiviteten . Aske fra Azolla indeholder alkalielementer (Li, Na, K, Mg, Ca) samt mikroelementer som Fe, Mn og Cu, hvilket gør det til en god kandidat til brug som gødning .

Biodieselproduktion

Vokser man på spildevand, kan det årlige teoretiske udbytte af rå lipider fra A. filiculoides anslås til 1,68 t/ha-året. Denne mængde kan øges til 8 t/ha-år, hvis planten vil vokse under naturlige forhold med en produktivitet på omkring 100 t dw/ha-år. Denne olieproduktivitet er betydeligt højere end fra sojabønner (0,44 t/ha-år), solsikke (0,78 t/ha-år), raps (1,17 t/ha-år) og oliepalme (6,0 t/ha-år), men lavere end det teoretiske udbytte fra mikroalger (op til 73 t/ha-år for Nannochloropsis sp.) . Da Azolla/A. azollae indeholder en række C16:0-, C18:2- og C18:3-fedtsyrer, betyder deres omdannelse til methylestere, at den resulterende biodiesel opfylder de afgørende krav til brændstoftæthed, cetantal og jodværdi for biodiesel, som er fastsat i EN14214-standarden .

Ethanolproduktion

Den teoretiske ethanolproduktion fra A. filiculoides er 9,3 t/ha-år (11,7 × 103 L/ha/år, baseret på ethanolens specifikke volumen = 0,789 g/mL), hvilket er lavere end ethanolproduktionen fra sukkerrør (25 × 103 L/ha-år), tæt på den fra majsstubbe (13.31 × 103 L/ha-år), men højere end fra miscanthus (2,3 × 103 L/ha-år), pil (0,3 × 103 L/ha-år) og poppel (1,3 × 103 L/ha-år) (Additional file 1: Table S1).

Bio-brintproduktion

Det høje biomasseproduktionsudbytte, den kemiske sammensætning (C/N-forhold) og det høje bio-brintudbytte på 2.2 mol/mol substrat gør Azolla til et konkurrencedygtigt råmateriale til brintproduktion sammenlignet med andre bioenergiafgrøder (Yderligere fil 1: Tabel S1, Yderligere fil 10: Tabel S6).