Planta acvatică Azolla ca materie primă universală pentru producția de biocombustibil

Tratarea apelor uzate sintetice cu Azolla filiculoides

Pentru experimentul de bioremediere, apa uzată sintetică bogată în seleniu (SeSW) a fost preparată prin amestecarea unei concentrații mari de fosfați (PO4-P), 1.3 g/L cu o cantitate moderată de amoniac (NH4-N), 55 mg/L și o concentrație scăzută de nitrați (NO3-N), 15 mg/L (Fișier suplimentar 4: Tabelul S3). Această compoziție simulează caracteristicile efluenților din industriile tipice de vopsire a textilelor, de finisare și de producere a detergenților de rufe . Apele reziduale au fost suplimentate cu 0,8 mg/L de SeO2. În acest experiment, am utilizat un tratament de 5 zile al SeSW de către A. filiculoides. Ratele de creștere ale unora dintre plantele acvatice care cresc pe apele reziduale cresc în mod normal exponențial după o fază de decalaj observată în primele 4-5 zile, când biomasa nu se modifică semnificativ . Cu toate acestea, această perioadă este asociată cu absorbția intensă a nutrienților cheie din apele reziduale, ceea ce duce la o creștere exponențială puternică a plantelor acvatice după faza de decalaj . Îndepărtarea nutrienților din SeSW în primele 5 zile de tratament de către A. filiculoides nu a condus la schimbări semnificative din punct de vedere statistic (P ≤ 0,05) în producția de biomasă (0,3 ± 0,1 g dw). Cu toate acestea, a dus la o absorbție de până la 25,4 % de NH4-N, 69,5 % de NO3-N și 24,3 % de PO4-P din 100 % SeSW (tabelul 1; figura 1). Apa de mare diluată (50 %) a fost mai puțin stresantă pentru A. filiculoides, ceea ce se reflectă în ratele mai mari de absorbție a nutrienților: 33,4, 93 și 39,8 % pentru NH4-N, NO3-N și, respectiv, PO4-P. Ratele de absorbție a nutrienților de către A. filiculoides au fost raportate anterior de mai multe grupuri de cercetare .

Tratarea SeSW cu A. filiculoides a dus la o absorbție de Se de 40 % din 100 % SeSW și de 76 % din 50 % SeSW, cu rate de absorbție de 47,6 µg Se/L-zi și, respectiv, 39,9 µg Se/L-zi (Fig. 2; Tabelul 2). Acest lucru a fost corelat cu rate de acumulare de 158,8 µg de Se/g dw-day în A. filiculoides din 100 % SeSW și 133,5 µg de Se/g dw-day din 50 % SeSW (tabelul 2). Această eficiență de absorbție reprezintă 85 % și 83 % din valoarea maximă teoretică de absorbție pentru 50 % SeSW și, respectiv, 100 % SeSW. O rată de absorbție a Se aproximativ similară a fost demonstrată de o altă reprezentantă a Azolla, Azolla caroliniana, care a absorbit până la 1 mg Se/g dw din 2,5 mg/L de soluție de Se în 2 săptămâni de tratament. Această valoare este mai mare decât în cazul altor plante acvatice, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) și Eichhornia (300 mg Se/g dw) .

Rata de supraviețuire a P. australiensis expusă la diluții de SeSW este prezentată în Fișierul suplimentar 5: Figura S2. S-a înregistrat o supraviețuire zero (0 %) atunci când au fost expuse timp de 96 h la 100 % SeSW netratat (control). De asemenea, nu s-au observat creveți vii nici în 80 % sau 50 % SeSW. După tratamentul cu A. filiculoides, toxicitatea SeSW a fost redusă de 2,6 ori, iar LC50 a crescut de la 11,22 % la 29,80 %. Acest lucru a indicat că, atunci când 100 % SeSW a fost tratat cu A. filiculoides, toxicitatea sa a fost redusă semnificativ după numai 5 zile de tratament.

Producția de biocombustibil din Azolla

Analizele finale și proximale ale Azolla filiculoides

Rezultatele analizelor finale și proximale ale A. filiculoides

Aceste analize finale și proximale ale A. filiculoides, inclusiv conținutul total de substanțe volatile, umiditate, carbon fix și cenușă (adică componentele anorganice ale probelor), sunt rezumate în fișierul suplimentar 6: tabelul S4. Volatilele totale colectate la 950 °C reprezintă 88 % din produsul total. Produsul total a avut 11 % umiditate, 7,3 % cenușă și 4,4 % carbon fix. Analiza de proximitate a arătat că elementele cheie cuprind 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O și 0,2 % S (calculat prin diferență).

Analizele termogravimetrice ale Azolla filiculoides

Analiza TGA-DTG a probei de A. filiculoides a fost efectuată la un interval de temperatură de 23-900 °C cu o viteză de încălzire de 10 °C/min sub o atmosferă de azot și este prezentată în Fig. 3. Curbele TGA și DTG au evidențiat cele trei etape de descompunere a A. filiculoides în procesul de piroliză; rezultate similare au fost raportate de Agrawal și Chakraborty . Biomasa a suferit trei faze de pierdere a greutății, una între 154 și 160 °C, a doua la 180 și 580 °C și a treia la aproximativ 580 și 900 °C. Prima zonă reprezintă o ușoară pierdere de greutate (7 %) cauzată de deshidratarea eșantionului de biomasă. Cea mai mare parte a pierderii de greutate (51 %) datorată pirolizei a avut loc în cea de-a doua zonă, unde sunt eliberate cele mai multe substanțe volatile; vârful puternic denotă descompunerea proteinelor, carbohidraților și lipidelor . În a treia zonă are loc descompunerea produsului carbonat și, astfel, pierderea de greutate se datorează în principal gazeificării, unde compușii carbonați foarte puțin volatili se vaporizează formând CO și CO2 datorită temperaturilor ridicate .

Lichidarea hidrotermală a Azolla filiculoides

Lichidarea hidrotermală a A. filiculoides a fost realizată folosind apă distilată ca solvent la 260, 280 și 300 °C cu timpi de rezidență de 15 min. Condițiile de reacție au fost selectate pe baza studiilor noastre anterioare și a literaturii de specialitate pentru a înțelege efectul temperaturii asupra randamentului produsului bio-ulei din A. filiculoides în apă subcritică . Distribuția produsului din proba de A. filiculoides tratată cu HTL este prezentată în figura 4. Producția totală de bio-ulei a fost de 15,83, 21,50 și 16,0 % la 260, 280 și, respectiv, 300 °C; astfel, producția maximă a fost obținută la 280 °C. Bio-uleiul total a fost compus din fracțiunea eterică (Bio-oil1) obținută din extracția porțiunii lichide și fracțiunea de acetonă (Bio-oil2) obținută din extracția fracțiunii solide (secțiunea „Metode”). Bio-oil2 a avut o vâscozitate ridicată și a fost văzut ca fiind un lichid gudronat. Randamentul reziduurilor solide a scăzut continuu de la 66,83 % la 33,83 % odată cu creșterea temperaturii de la 260 la 300 °C. Randamentul gazelor a scăzut la trecerea de la 260 la 280 °C. Când temperatura a fost mai mare de 280 °C, randamentul gazelor a crescut la 7,1 %. HTL din biomasa de A. filiculoides a arătat o distribuție similară a celor doi produși principali, biogaz și bio-char, cu datele obținute după piroliză, cu o medie de biogaz de 6,05 și 12 % pentru HTL și, respectiv, piroliză, și bio-char de aproximativ 50 % pentru ambele. HTL a generat un nivel mai ridicat de bio-ulei, de până la 21,5 % (14 % pentru piroliză). S-au obținut rezultate similare atunci când au fost comparate cu randamentele de bio-ulei obținute atât din piroliza cât și din HTL a microalgelor .

În plus față de datele bilanțului material, a fost investigată conversia pe baza carbonului organic total (TOC) obținut după lichefierea hidrotermală la diferite temperaturi, iar rezultatele sunt prezentate în fișierul suplimentar 7: Tabelul S5. A existat 46,9 % carbon organic în hrana pentru animale, ceea ce se traduce prin 2,8 g de carbon organic în cele 6 g de eșantion utilizat pentru lichefierea hidrotermală. Conversia privind carbonul organic a crescut de la 13,93 % la 48,93 % odată cu creșterea temperaturii de la 260 la 300 °C. Rezultatele au indicat că, la o temperatură mai scăzută, descompunerea biomasei a fost incompletă și a lăsat o cantitate mare de biomasă care nu a reacționat, ceea ce poate împiedica formarea bioulei. Creșterea temperaturii a fost capabilă să accelereze descompunerea materiei prime și a favorizat formarea de bio-ulei; cu toate acestea, o creștere suplimentară a temperaturii, mai mare de 280 °C în experimentele noastre, ar descompune bio-ulei/intermediarii formați anterior în gaze și produse solubile în apă și, prin urmare, a dus la o scădere a randamentului bio-ulei. Reducerea randamentului de reducere a reziduului solid (bio-char) a sugerat o creștere a conversiei globale a biomasei atunci când temperatura a fost ridicată de la 260 la 300 °C.

Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier a bio-ulei

Spectrele FT-IR ale bio-ulei de A. filiculoides feed și a bio-ulei1 obținut prin HTL la 260, 280 și 300 °C sunt prezentate în figurile 5A și B. Banda largă de la aproximativ 3200-3405 cm-1 este atribuită vibrației de întindere O-H sau N-H cauzată de apă sau de grupările O-H sau N-H prezente în bio-ulei (Fig. 5B). O absorbție largă a fost afișată în jurul valorii de 3314 cm-1 pentru materia primă, ceea ce indică un conținut ridicat de carbohidrați și proteine (Fig. 5A).

Bio-uleiurile au prezentat o absorbție mai slabă la 3200-3405 cm-1, sugerând că atât carbohidrații, cât și proteinele au fost descompuse în procesul HTL (Fig. 5B). Benzile de la 2854 la 2950 cm-1 au fost mai puternice pentru toate bio-uleiurile din cauza vibrațiilor de întindere C-H, indicând prezența grupărilor alchil C-H. Vibrația de întindere C=O în jurul valorii de 1645-1720 cm-1 în bio-uleiuri indică prezența cetonelor, aldehidelor, esterilor sau acizilor . Benzile de vibrații de încovoiere la aproximativ 1580-1650 cm-1 indică prezența grupărilor N-H ale aminei. Benzile din regiunea cuprinsă între 1430 și 1480 cm-1 au fost atribuite vibrațiilor de încovoiere α-CH2 prezente în bio-uleiuri. Prezența benzilor de întindere C-N în jurul valorii de 1266-1342 cm-1 în bio-uleiuri se datorează grupărilor aromatice ale aminei. De asemenea, alte câteva vârfuri de absorbție care apar la 780-850 cm-1 sunt atribuite vibrațiilor de încovoiere C-H în afara planului de la substanțele aromatice. Banda de la 1040 cm-1 a apărut numai în profilul de absorbție al hranei din A. filiculoides și ar putea fi C-O legată de grupările hidroxil care au fost deshidratate după lichefiere. În general, spectrele probelor de bio-ulei1 din HTL la diferite temperaturi prezintă aceleași vârfuri, indicând prezența acelorași grupe funcționale, și au fost diferitele vârfuri obținute în spectrele RMN.

Analiza RMN a bio-ulei

Analiza RMN a probelor de bio-ulei1 a fost întreprinsă pentru a înțelege raporturile mediilor chimice ale protonilor. Spectrele RMN au oferit informații complementare privind grupurile funcționale față de spectrele FTIR și capacitatea de a cuantifica și compara ariile de integrare între spectre. La fel ca în cazul FT-IR, spectrele RMN 1H au arătat un procent ridicat de grupuri funcționale alifatice pentru toate bio-uleiurile, iar în figura 6 este prezentat un rezumat al regiunilor ariilor de vârf integrate atribuite diferitelor clase de grupuri funcționale. Cea mai ridicată regiune de câmp a spectrelor, de la 0,5 la 1,5 ppm, reprezintă protoni alifatici atașați la atomii de carbon aflați la cel puțin două legături distanță de un C=C sau de un heteroatom (O sau N). Următoarea regiune integrală, de la 1,5 la 3,0 ppm, reprezintă protoni pe atomi de carbon alifatici care pot fi legați de o legătură dublă C=C. Toate bio-uleiurile au avut un procent mai mare de protoni în regiunea spectrală de la 0,5 la 3,0 ppm. Acestea au avut un procent mai mare (63,15-71,76 %) de protoni în regiunea de la 0,5 la 1,5 decât în regiunea de la 1,5 la 3,0 (18,73-28,8 %), ceea ce se datorează probabil numărului mare de compuși azotați și oxigenați care s-au dovedit a rezona în această zonă și care pot fi derivați din conținutul ridicat de proteine al materiei prime.

Următoarea porțiune a spectrului 1H RMN la 3,0-4,5 ppm reprezintă protoni metoxilici sau o grupare metilenică ce unește două inele aromatice; în această regiune au fost observate procente de protoni foarte scăzute. Toate bio-uleiurile au prezentat un procent scăzut de funcționalitate metoxi/carbohidrat (4,5-6,0 ppm). În această regiune, valorile maxime ale procentajului de protoni ale bio-uleiurilor au fost de 4,33 și 4,32 % pentru lichefierea la 260 și 280 °C, valoarea net inferioară de 0,94 % pentru lichefierea la 300 °C. Regiunea din spectru cuprinsă între 6,0 și 8,5 ppm corespunde regiunii aromatice. Conținutul maxim de protoni de aproximativ 7,2 % în această regiune a fost obținut pentru bio-uleiul obținut la 300 °C. Funcționalitatea aromatică/heteroaromatică a fost observată în toate bio-uleiurile (6,0-8,5 ppm), în concordanță cu rezultatele spectroscopiei FT-IR. Regiunile spectrale din josul câmpului (8,5-10 ppm) provin de la aldehide. Funcționalitatea aldehidelor (9,5-10,0 ppm) a fost absentă din toate bio-uleiurile, în ciuda grupurilor funcționale C=O (1645-1720 cm-1) observate prin FT-IR. Apariția unor astfel de benzi FT-IR se poate datora, de asemenea, altor grupări purtătoare de carbonil, cum ar fi acizii carboxilici protonați, esterii acizilor carboxilici, amidele și cetonele.

Analiza CG-MS a bio-ulei

CGC-MS a fost utilizată pentru a înțelege mai bine compoziția produsului lichid și pentru a confirma rezultatele analizelor FT-IR și RMN. GC-MS a arătat în mod clar că temperatura de lichefiere a afectat componentele bio-uleiurilor1. Identificarea principalelor vârfuri ale compușilor a fost realizată cu ajutorul bazei de date de spectre de masă NIST. Experimentele HTL au dus la obținerea de bio-uleiuri care provin din descompunerea ligninei, a proteinelor, a flavonoidelor și a lipidelor, împreună cu o serie de compuși derivați din carbohidrați. Componenții bioulei au fost identificați ca fiind compuși aromatici monociclici și policiclici, cetone, aldehide, esteri, alcooli, amide și alți compuși cu conținut de azot (inclusiv amide și compuși N-heterociclici) și hidrocarburi. S-a efectuat o analiză semicantitativă prin calcularea procentului relativ al ariei vârfurilor cromatografice, rezultatele fiind prezentate în tabelul 3. Principalii compuși observați în urma lichefierii hidrotermale a A. filiculoides au fost metilpirazina, 2-metil-2-ciclopenten-1-ona, fenol, 2-metoxi-fenol, 3-piridinol, catecol, l-prolină, ester N-butoxi-carbonil-butil, ftalat de bis(2-etilhexil) și beta-sitosterol. Pe măsură ce temperatura de lichefiere hidrotermală a variat de la 260 la 300 °C, au fost produși diferiți compuși, precum și diferite proporții de compuși. Procentul de suprafață al compușilor fenolici, cum ar fi fenolul (6,1-18,8 % din suprafață) și catecolul (10,0-15,7 % din suprafață) a crescut odată cu creșterea temperaturii de la 260 la 280 °C, dar apoi a scăzut la 11,1 % din suprafață pentru fenol și 11,8 % din suprafață pentru catecol la 300 °C. Fenolii din bio-ulei din A. filiculoides au fost probabil produși din lignina sau din partea de carbohidrați a biomasei. Compușii azotați se formează prin reacții de decarboxilare, dezaminare, deshidratare, depolimerizare și descompunere a proteinelor . Cea mai mare suprafață procentuală de 3-pirindiol (13,3 %) a fost observată la cea mai scăzută temperatură de 260 °C și a scăzut la 11,9 și 10,1 % pentru 280 și, respectiv, 300 °C. În plus, cea mai mare suprafață aproximativ (13,6, 12,4 și 8,7 %) a fost observată la 260, 280 și 300 °C. Deoarece compoziția produsului lichid este atât de complexă, ar fi necesară o îmbunătățire suplimentară, cum ar fi denitrogenarea și dezoxigenarea, pentru a face bio-ulei adecvat pentru combustibilii pentru motoare.

Compoziția moleculelor obținute în bio-uleiul din HTL a fost comparată cu spectrul de molecule identificate în bio-ulei produs prin piroliză . Spre deosebire de HTL, piroliza este descompunerea termochimică a materiei organice uscate cu un conținut de umiditate sub 10 % fracție masică în absența oxigenului, la presiune atmosferică și la temperaturi mai ridicate (350-550 °C) . Ambele tehnologii termochimice au arătat un mare potențial pentru transformarea întregii biomase Azolla în bio-uleiuri care au densități energetice mai mari decât biomasa de bază inițială. Bio-uleiurile rezultate din ambele reacții termochimice au o compoziție foarte complexă, ca urmare a depolimerizării și descompunerii monomerilor biomasei prin scindare, deshidratare, decarboxilare și dezaminare . Compușii derivați din proteine au fost reprezentați de fenoli, alchilfenoli, pirrolidinonă, indol și nitril ca rezultat al descompunerii aminoacizilor tirozină și fenilalanină care se găsesc în Azolla . Produsele derivate din lipide au inclus o gamă de alcani saturați cu lanț lung și acizi grași saturați cu dimensiuni cuprinse între C12 și C21: dodecan, tridecan, tetradecan, pentadecan, hexadecan, heptadecan, octadecan, nonadecan, eicosan și heneicosan. Un amestec similar de produse biolichide de piroliză a alcanilor derivați din lipide cu lanț lung a fost găsit în alge . Principala diferență a fost că piroliza de A. filiculoides a arătat o acumulare de fitol, 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol, alcool diterpenic aciclic, deoarece produsul de degradare a clorofilei a fost cel mai abundent produs de piroliză.

Analiza produselor bioreziduale

Figura 7 prezintă spectrele FT-IR ale hranei Azolla și ale bioreziduurilor. Benzile largi de la 3200-3405 cm-1 sunt atribuite vibrațiilor de întindere ale grupărilor O-H cu legături de hidrogen și ale grupărilor N-H și indică prezența polizaharidelor, carbohidraților și proteinelor prezente în hrana Azolla. Furajele inițiale de Azolla au vârfuri puternice de vibrații de întindere corespunzătoare grupărilor O-H și N-H, dar această transmisie scade în bioreziduu. Picul de la 1030 cm-1 a dispărut în bioreziduu. Vârful din jurul valorii de 1600-1620 cm-1, care corespunde vibrației de încovoiere N-H, a fost prezent în hrana Azolla și în bioreziduul Azolla. Vârfurile dintre 2800 și 2930 cm-1 din spectrele reziduurilor au devenit mult mai slabe decât cele din hrana brută Azolla. Prezența unui singur vârf la 1590 cm-1, atribuit întinderii C=C, indică formarea biocarului aromatic .

Spectrele de difracție a pulberilor cu raze X (XRD) ale furajelor și bio-reziduurilor de A.filiculoides la diferite temperaturi nu au arătat diferențe semnificative în difractograma cu raze X a pulberilor (Fișier suplimentar 8: Figura S3). Hrana și reziduurile de biomasă obținute la diferite temperaturi au prezentat o natură amorfă tipică, ceea ce indică faptul că structura carbonului din reziduuri este formată din foițe aromatice puternic conjugate, reticulate în mod aleatoriu. Modificările morfologice au fost evidente în imaginile de microscopie electronică de scanare (SEM) ale Azolla și ale bioreziduului (Fișier suplimentar 9: Figura S4). Imaginile bioreziduului obținut prin lichefierea hidrotermală a celor trei bio-carbohidrați de Azolla au arătat că reziduul era de natură spongioasă și că nu exista o structură poroasă ordonată.

Producția de hidrogen din biomasa de Azolla tratată cu acid de către Enterobacter cloacae DT-1

După pretratarea termică-H2SO4, biomasa de A. filiculoides a fost hidrolizată în diferite zaharuri reduse solubile constând în principal din glucoză (1,18 g/L), xiloză (1,39 g/L) și arabinoză (0,063 g/L). Pre-hidrolizatul tratat cu acid a fost utilizat ca materie primă pentru producerea de hidrogen de către Enterobacter cloacae (E. cloacae) în mod discontinuu la o presiune parțială redusă de pH2. pH2 afectează în mod semnificativ eficiența randamentului hidrogenului în producția fermentativă de hidrogen de către bacteriile anaerobe, deoarece căile de producere a hidrogenului sunt sensibile la concentrația de hidrogen, ceea ce duce la inhibarea produsului final. S-a raportat că o presiune parțială ridicată a hidrogenului duce la producerea mai multor produse reduse, cum ar fi etanol și lactat, în loc de acetat, butirat și H2. Fermentatorul discontinuu a fost aranjat pentru a exercita o presiune asupra spațiului de cap al fermentatorului, ceea ce a permis biogazului să iasă din spațiul de cap imediat după ce a fost generat, reducând astfel presiunea parțială totală și, prin urmare, presiunea parțială a hidrogenului din fermentatorul discontinuu.

Fermentarea cu E. cloacae DT-1 a condus la producerea a 53 mmol/L de hidrogen (tabelul 4). În timpul producției fermentative de hidrogen, pH-ul final al bulionului de fermentare a scăzut de la 7,5 la 5,42, ceea ce poate fi atribuit producției de acizi grași organici cu lanț scurt . Producția totală de acizi grași volatili a fost de 1150 mg/L, compusă în mare parte din acid acetic (986 mg/L) și acid butiric (161 mg/L), cu un raport B/A de 0,165. Prin urmare, tulpina DT-1 a urmat calea acidă mixtă și a utilizat în mod eficient zaharurile C5 (xiloză, arabinoză și glucoză) din prehidrolizatul tratat cu acid. Eficiența randamentului hidrogenului a fost de 2,43 moli de H2/mol de zahăr reducător. Având în vedere că eficiența maximă teoretică a randamentului teoretic al hidrogenului pe calea fermentației întunecate este de 4 moli de H2/mol de glucoză, aproximativ 60 % din randamentul maxim posibil de hidrogen a fost obținut din prehidrolizatul de biomasă tratat cu acid. După cunoștințele noastre, acesta este primul raport privind producerea de hidrogen din zaharuri din biomasă de A. filiculoides.

Producția de hidrogen din biomasa Azolla tratată enzimatic de către E. cloacae DT-1

Hidroliza enzimatică a biomasei A. filiculoides tratate cu acid a eliberat glucoză și xiloză la o concentrație de 1,49 și, respectiv, 0,181 g/L. Din zaharurile din biomasa hidrolizată enzimatic s-au obținut aproximativ 34,8 mmol/L de producție volumetrică de hidrogen (la un pH2 scăzut). pH-ul final al bulionului de fermentare a scăzut la 5 în timpul producției de hidrogen, care a fost însoțit de producerea de acid acetic (990 mg/L) și acid butiric (164 mg/L). Concentrația totală de AGV a fost de 1156 mg/L, iar raportul B/A a fost de 0,165 (tabelul 4). Aceste rezultate arată că a fost urmată calea de fermentare acidă mixtă. Eficiența randamentului hidrogenului a fost de 2,04 moli de H2/mol de zahăr reducător; prin urmare, a fost mai mică decât cea obținută din prehidrolizatul tratat cu acid. În general, eficiența randamentului de hidrogen al tulpinii DT-1 din biomasa Azolla filiculoides a fost de 2,2 ± 2 moli/mol de zahăr reducător. Eficiența producției de hidrogen din Azolla este similară cu cea obținută pentru materia primă lignocelulozică terestră, care acoperă intervalul de 044-2,76 mol H2/mol de zaharuri (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1, Fișier suplimentar 10: Tabelul S6).

Raportul carbon-azot (C/N) al biomasei este important pentru o digestie anaerobă eficientă, deoarece microorganismele au nevoie de mult mai mult C decât N (C:N de 25:1) pentru o producție optimă de hidrogen. Din acest motiv, aplicarea microalgelor pentru producerea de hidrogen este limitată, deoarece acestea sunt bogate în proteine și au un raport C/N scăzut (av. de 4) . Cofermentarea cu macroalge (cum ar fi Laminaria digitata), care sunt bogate în carbohidrați cu un raport (C/N) ridicat, îmbunătățește performanța producției de hidrogen . A. filiculoides conține 41 % carbohidrați totali și 20 % proteine, ca urmare analiza proximală a biomasei a arătat un C/N de 15 (Fișier suplimentar 6: Tabelul S4) care este aproape de a fi o materie primă eficientă pentru producția de biohidrogen.

Producția de etanol din Azolla filiculoides și A. pinnata

Analiza chimică a biomasei de A. filiculoides și A. pinnata este prezentată în Fișierul suplimentar 3: Tabelul S2. A. filiculoides a prezentat o concentrație ridicată de biomolecule care pot fi utilizate ca materie primă pentru producerea de bioetanol: amidon (6,05 %), celuloză (21,8 %) și hemiceluloză (13,5 %). Are 10,3 % lignină, care este mai mare decât în cazul duckweed și al altor plante acvatice, dar mai mică decât în cazul principalelor culturi bioenergetice lignocelulozice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Analiza chimică a A. pinnata a arătat o concentrație mai mică de molecule producătoare de bioetanol: amidon (4,7 %), celuloză (12,8 %) și hemiceluloză (10,1 %) și un conținut mai mare de lignină (până la 13,2 %).

Componenta de amidon din A. filiculoides și A. pinnata a fost hidrolizată enzimatic de α-amilază și α-amiloglucozidază, iar componentele de celuloză/hemiceluloză au fost hidrolizate de celuloză și cellobioză. Cantitățile de glucoză eliberate sunt prezentate în tabelul 5. Așa cum era de așteptat, combinația celor patru enzime care hidrolizează biomasa de A. filiculoides a produs o cantitate mai mare de glucoză decât în cazul A. pinnata (până la 65,9 și, respectiv, 29,5 g/L). Această producție de glucoză a fost mult mai mare decât cea obținută după tratarea biomasei de A. filiculoides cu o suspensie de Aspergillus niger viu cultivat pe bulion de dextroză de cartof (2,5 g/L de glucoză), demonstrată de Pandey et al.

După fermentarea zaharurilor reduse cu Saccharomyces cerevisiae, randamentele de etanol, YE/G (etanol/glucoză, g/g) au reflectat cantitatea de glucoză eliberată în probe, cu randamente de 0,56 g/g observate pentru A. filiculoides și 0,28 g/g pentru A. pinnata. Randamentul de 0,56 g/g este comparabil cu cele raportate în urma fermentării hidrolizatului de duckweed și a unor culturi energetice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Este interesant faptul că suplimentarea fermentării cu nutrienți suplimentari nu a arătat o creștere semnificativă a randamentului de etanol (nu este prezentat). Acest lucru poate fi explicat prin prezența nutrienților cheie pentru creșterea drojdiei în biomasa ambelor specii de Azolla.

Câștigul de etanol bazat pe biomasa de A. filiculoides (YE/B) a fost determinat ca fiind de 0,09 g/g, ceea ce este similar cu randamentul obținut de S. cerevisiae ATCC 24859 cultivată pe L. minor, care conținea în medie 10 % amidon . O producție mai mare de etanol, 0,19 g/g, a fost observată în cazul tulpinii Lemna aequinoctialis 6000, care are o rată de creștere rapidă și capacitatea de a acumula niveluri ridicate de amidon (până la 39 %). Potențialul unui alt reprezentant al lucernei de rață, Spirodela polyrrhiza, de a-și crește nivelul de amidon în condiții de stres până la 45,7 %, împreună cu hidroliza enzimatică cu α-amilază, pullulanază și α-amiloglucozidază, a condus la un YE/B de 0,28 g/g . Compoziția chimică a pereților celulari și acumularea mai mică de amidon au fost motivul probabil al randamentului mai scăzut de etanol din biomasa de A. pinnata (YE/B = 0,05 g/g). Utilizarea diferitelor tulpini de drojdie care pot fermenta mai bine spectrul de zaharuri eliberate și care sunt mai tolerante la potențialii inhibitori, va fi următorul pas în optimizarea randamentului de etanol din biomasa de Azolla.

Azolla ca materie primă universală pentru producția de biocombustibil

O analiză sistematică a plantelor terestre pentru potențialul lor de a fi culturi bioenergetice ideale a condus la o serie de criterii de selecție importante care includ: (1) compoziția chimică și proporția ridicată de molecule producătoare de biocombustibil; (2) rate de creștere ridicate/producție de biomasă; (3) indice de recoltare/perioadă de rotație ridicată; (4) capacitatea de a crește pe terenuri marginale și lipsa de concurență cu culturile agricole pentru terenurile arabile; (5) eficiență ridicată a utilizării apei dulci și costuri de creștere reduse; (6) costuri de recoltare reduse; și (7) producția de co-produse cu valoare ridicată . Aceste criterii au declanșat o căutare intensă pentru domesticirea următoarei generații de culturi energetice.

Speciile de azolla împreună cu simbiotul lor cianobacterian evolutiv, A. azollae, au atras atenția datorită potențialului lor de a aborda toate criteriile menționate mai sus. În primul rând, biomasa Azolla conține tipuri majore de molecule energetice care includ celuloză/hemiceluloză, amidon și lipide, care seamănă cu combinații de culturi bioenergetice terestre lignocelulozice, producătoare de amidon și ulei și microalge/cianobacterii. În al doilea rând, prin dublarea biomasei la fiecare 5-6 zile și prin productivitatea anuală ridicată, acestea sunt una dintre plantele cu cea mai rapidă creștere, fiind pe locul al doilea după microalge în ceea ce privește ratele de producție a biomasei. La fel ca în cazul microalgelor, producția lor de biomasă nu este sezonieră. În al treilea rând, Azolla poate fi cultivată în mod eficient în afara habitatului lor natural, folosind apele reziduale ca principală sursă de nutrienți. Bioremedierea apelor reziduale poate duce la absorbția a până la 2,6 și 0,434 t/ha/an de N și, respectiv, P total. De asemenea, Azolla poate crește eficient în medii sărace în N, asimilând până la 0,4 t N/ha-an de azot din atmosferă prin simbioza cu A. azollae. În al patrulea rând, sunt ușor de recoltat. Și, în cele din urmă, speciile de Azolla sunt folosite de zeci de ani ca biofertilizatori de azot și ca hrană pentru animale/pești (datorită nivelului ridicat de proteine și carbohidrați). Lipsa necesității de a utiliza îngrășăminte sintetice pe bază de azot pentru cultivarea Azolla are un impact pozitiv substanțial asupra reducerii generării de protoxid de azot (N2O), al cărui impact asupra încălzirii atmosferei este de aproape 300 de ori mai mare decât cel al dioxidului de carbon .

Tehnologii termochimice

Biomasa de Azolla a fost utilizată ca materie primă pentru producerea de bio-ulei, bio-char și biogaz folosind două tehnologii termochimice, piroliza și HTL (această lucrare). Având în vedere productivitatea anuală ridicată a Azolla, acest lucru conduce la o producție teoretică de bio-ulei pe bază de piroliză și HTL evaluată la până la 13,2 și, respectiv, 20,2 t/ha/an. Ambele bio-uleiuri conțin o serie de substanțe petrochimice care pot fi utilizate direct ca și componente fără glicerină ale biomotorinei sau pot fi transformate în biocombustibili cu ajutorul unor tehnologii bine stabilite . Ambele tehnologii termochimice pot produce, de asemenea, bio-solide, cum ar fi bio-char și cenușă (până la 48 t/ha-an pentru ambele), care pot fi utilizate pentru a îmbunătăți calitatea solului prin creșterea capacității de reținere a nutrienților și a umidității, susținerea comunităților microbiene și promovarea activității rădăcinilor . Cenușa din Azolla conține elemente alcaline (Li, Na, K, Mg, Ca), precum și microelemente precum Fe, Mn și Cu, ceea ce o face un bun candidat pentru utilizarea ca îngrășământ .

Producția de biodiesel

Creșterea pe ape reziduale, randamentul teoretic anual de lipide brute din A. filiculoides poate fi estimat la 1,68 t/ha-an. Această cantitate poate crește la 8 t/ha-an dacă planta va crește în condiții naturale cu o productivitate de aproximativ 100 t dw/ha-an. Această productivitate a uleiului este semnificativ mai mare decât cea obținută din soia (0,44 t/ha-an), floarea-soarelui (0,78 t/ha-an), rapiță (1,17 t/ha-an) și palmier de ulei (6,0 t/ha-an), dar mai mică decât producția teoretică din microalge (până la 73 t/ha-an, pentru Nannochloropsis sp.). Deoarece Azolla/A. azollae conțin o gamă de acizi grași C16:0, C18:2 și C18:3, conversia lor în esteri metilici înseamnă că biomotorina rezultată îndeplinește cerințele esențiale de densitate a combustibilului, indice de cetan și indice de iod pentru biomotorină stabilite de standardul EN14214 .

Producția de etanol

Producția teoretică de etanol din A. filiculoides este de 9,3 t/ha-an (11,7 × 103 L/ha/an, pe baza volumului specific de etanol = 0,789 g/mL), care este mai mică decât producția de etanol din trestie de zahăr (25 × 103 L/ha-an), apropiată de cea din păcură de porumb (13.31 × 103 L/ha-an), dar mai mare decât cea obținută din miscanthus (2,3 × 103 L/ha-an), salcie (0,3 × 103 L/ha-an) și plop (1,3 × 103 L/ha-an) (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1).

Producția de biohidrogen

Reducerea ridicată a producției de biomasă, compoziția chimică (raportul C/N) și randamentul ridicat de biohidrogen din 2.2 mol/mol de substrat fac din Azolla o materie primă competitivă pentru producția de hidrogen în comparație cu alte culturi bioenergetice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1, Fișier suplimentar 10: Tabelul S6).

.