Soluviljely
Ihmisen alkiomunuaisen 293FT-soluja kasvatettiin DMEM-muusiossa, jota täydennettiin 10 %:lla FBS:llä ja 1 %:lla penisilliinillä/streptomysiinillä (100 iU/ml; 100 μg/ml). Solulinjoja ei todennettu. Solut eivät sisältäneet mykoplasmaa. Soluja inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 % CO2 37 °C:ssa. Stabiileja solulinjoja varten transfektoidut solut valittiin puromysiinin (3 μg/ml) läsnäollessa. Ohimeneviä transfektiotutkimuksia varten HEK293-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille vektorien läsnä ollessa Lipofectamin2000:lla (ThermoFisher). Podosyyttisolulinjat muodostettiin ihmisen virtsasta42 ja APOL1-genotyypitys suoritettiin sen jälkeen, kun oli saatu tietoinen suostumus NIDDK Institutional Review Boardin etukäteen hyväksymien tutkimuspöytäkirjojen (94-DK-0127, 94-DK-0133) mukaisesti. Tapaus A on G0/G0-mies, jolla on FSGS, tapaus B on G0/G0-mies, jolla on HIV:n aiheuttama FSGS, tapaus C on G0/G0-mies, jolla on FSGS (HP55-345O-1), tapaus D on G1/G2-mies, jolla on FSGS, ja tapaus E on G1/G2-mies, jolla on HIV:n aiheuttama FSGS. Soluja kasvatettiin RPMI1640:ssä, jota täydennettiin 10 %:lla FBS:llä, ITS:llä ja 1 %:lla penisilliiniä/streptomysiiniä (100 iU/ml; 100 μg/ml). Soluja inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 % CO2 33 °C:ssa, ja ne erilaistuivat 37 °C:ssa 7-10 päivän ajan. Solulinjoja ei todennettu. Solut olivat vapaita mykoplasmasta. Ennen solulysaattien keräämistä soluja käsiteltiin 103 U/ml IFNα:lla (Abcam) 24-72 tunnin ajan ja 100 mM kalykuliini A:lla (LC Laboratories) 30 minuutin ajan. PKR:n estokokeita varten soluja käsiteltiin 1 μM imidatsolo-oksindoli PKR:n estäjällä C16 (Sigma Aldrich) 1 h43.
Ihmiskudos
Deidentifioidut ihmisen munuaisbiopsiakudokset saatiin tohtori Preeti Chandralta Marylandin yliopistosta. Tutkimus hyväksyttiin etukäteen Marylandin yliopiston ja NIDDK:n, NIH:n institutionaalisissa arviointilautakunnissa.
Plasmiditiedot
APOL1 G0 -ekspressiovektori koostuu CMV-promoottorista johdetusta ihmisen APOL1-cDNA:sta (NM_001136540: 298-1453). APOL1 G1:lle (rs73885319 A→G ja/tai rs60910145 T→G) ja G2:lle (rs71785313 del) tehtiin paikkaohjattu mutageneesi. APOL1-ekspressiovektori, josta puuttui proteiinin ilmentyminen, valmistettiin lisäämällä stop-kodoni ja frameshift-sekvenssi (TAATAGATGA) 138. kodonin jälkeen. Sekundäärirakenteen mutaatiovektorin alkuperäisiä sekvenssejä muutettiin kahdeksalla synonyymisellä muutoksella (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G ja 1242T→C). Vakaan dsRNA G0 -vektorin alkuperäisiä sekvenssejä on muutettu viidellä mutaatiolla 3′ UTR:ssä (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC GGC CAG AGG GGC CAG GGC GGC GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). APOL1-alleeleja (NM_001136540.1, 1031-1453) ympäröivää RNA:ta varten käytettiin taustavektorina pRNAT-CMV3.2/Puroa (GeneScript). Vektorikarttojen kaaviot ovat lisäkuvassa 1.
Immunoblottaus
Solut lysoitiin RIPA-puskurissa, joka sisälsi proteaasi-inhibiittori/fosfataasi-inhibiittorikoktailin. Lysaatit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja proteiinit tehtiin western blotting -menetelmällä ja blokattiin 30 minuuttia Odyssey-blokkauspuskurissa (LI-COR). Blotteja inkuboitiin ensisijaisilla vasta-aineilla APOL1:tä (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-eIF2α:ta (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α:ta (Cell Signaling Technology #5324), β-aktiinia (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI:tä (Upstate #07-728), fosfo- PKR:ää (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), fosfo-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), fosfo-GCN (Abcam ab75836) ja GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) ja p62 (Cell signaling #5114). Blotit inkuboitiin väriaineella leimatulla anti-kani-vasta-aineella (LI-COR). Kaikki blotit kuvattiin Odyssey-infrapunaskannerilla (LI-COR). Raakageelikuvat on esitetty lisäkuvassa 13.
Reverse transkriptaasi-PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR
Solut tai munuaisten kokonaismäärä kerättiin TRIzol-reagenssilla ja RNA:n kokonaismäärä eristettiin. Kokonais-RNA käsiteltiin DNaasilla ennen cDNA:n synteesiä oligo(dT):llä. Yksi 5 μg:n aliquot RNA:ta käytettiin cDNA-synteesiin Superscript II:n käänteisellä transkriptaasilla. Näytteet analysoitiin PCR:llä (RT) tai kvantitatiivisella RT-PCR:llä (qRT-PCR) käyttäen Power SYBR Green PCR master mixiä (ThermoFisher). Kunkin näytteen suhteellinen ilmentyminen laskettiin suhteena (attamoles-spesifinen geeni per β-aktiini). Aloitinparit on lueteltu lisätaulukossa 1.
Proteiinisynteesin määritys
Transfektoituja HEK293-soluja tai ihmisen podosyyttisolulinjoja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä, ja niitä käsiteltiin 103 U/ml IFNα:lla (Abcam) kvantifiointia varten tai kammiolaskimella visualisointia varten. Synteesimääritys (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, luettelon nro. C10289, Invitrogen) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ytimen vastavärjäys suoritettiin Hoechstilla. HEK293-soluja, joita ei ollut käsitelty vektorilla, jota oli käsitelty 1 μM puromysiinillä (InvivoGen, San Diego, CA), käytettiin negatiivisena kontrollina tässä määrityksessä, ja tausta asetettiin 0 %:n signaalin intensiteetiksi. APOL1 G0 -vektorilla varustetut HEK293-solut asetettiin 100 %:n signaalin intensiteetiksi.
Solujen elinkelpoisuus
Solujen elinkelpoisuusmääritykset tehtiin ATP-määrityksillä. Metabolisesti aktiivisten solujen tuottaman ATP:n kvantifioimiseksi käytimme valmistajan ohjeiden mukaista CellTiter-Glo-luminesenssisolujen elinkelpoisuusmääritystä (Promega). Soluja kasvatettiin steriileissä 96-kuoppalevyissä 103 U/ml IFNα:ta (Abcam) läsnä ollessa 72 tunnin ajan, minkä jälkeen solujen lyysaamiseksi lisättiin 100 μl CellTiter-Glo-reagenssia. Kun soluja oli inkuboitu 10 minuuttia huoneenlämmössä, luminesenssi havaittiin luminometrillä, jonka integrointiaika oli 1 s kuoppaa kohti. Solujen luminesenssisignaalit normalisoitiin solujen lukumäärällä.
Solujen proliferaationopeusmääritys
Soluja kylvettiin 5,0 × 103 solua 150 µl:aa elatusainetta kohti 96-kuoppalevyn kuoppiin ja PKR:n inhibiittoria C16 lisättiin ilmoitetulla pitoisuudella. Solujen lukumäärä mitattiin 0, 24, 48, 50 µL:n jälkeen Cell Counting Kit-8:lla (Sigma-Aldrich).
Hapenkulutusnopeudet viljellyissä ihmisen podosyyteissä
Solujen hapenkulutusnopeuksien (OCR) arvioimiseksi käytettiin XF24 solunulkoisen virran analysaattoria (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) yhtiön ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna viljellyt ihmisen podosyytit kylvettiin Seahorse Bioscience -yhtiöltä ostettuihin XF24-kuoppalevyihin tiheydellä 2,0 × 104 solua kuoppaa kohti (pinta-ala 0,33 cm2) 100 μl:n kasvatusmediassa, ja niitä inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin IFNα:lla (1 × 103 U/ml) PKR-inhibiittori C16:n (100 nM) kanssa tai ilman PKR-inhibiittoria C16 (100 nM) 72 tunnin ajan, minkä jälkeen soluja käsiteltiin 24 tuntia XF24-kuoppalevyillä. Ennen OCR-mittauksia soluja sisältävä kokeellinen XF24-levy pestiin bikarbonaatittomalla DMEM-määritysalustalla (Seahorse Bioscience), joka sisälsi 25 mM glukoosia ja 1 mM natriumpyruvaattia, ja soluja esi-inkuboitiin 1 h 37 °C:ssa ilman hiilidioksidin syöttöä 625 μl:n määritysalustassa. Ennen OCR-mittauksia XF24 kalibroitiin kalibrointikasetin avulla yhtiön ohjeiden mukaisesti. Kalibroinnin jälkeen suoritettiin OCR-perusmittaukset testilevyllä 4 minuutin ajan.
RNA-immunoprecipitaatio (RNA-IP)
Stabiileja HEK293-soluja, joissa oli APOL1-G0-, G1- tai G2-variantti, käsiteltiin pilkkukäsittelyllä seuraavasti: (a) 103 U/ml IFNα 24-72 h ja 100 μM palmitiinihappoa (Sigma) 2 h, tai (b) 100 mM 103 U/ml IFNα 24-72 h ja kalykuliini A 30 min. Palmitiinihappo sitoutuu suoraan PKR:ään ja estää dsRNA:n sitoutumisen PKR44:ään, ja siksi palmitiinihappoa käytettiin negatiivisena kontrollina. Soluja säteilytettiin UV-valolla 200 mJ/cm2. Kymmenen prosenttia kustakin solulysaatista säästettiin RT-qPCR:n syöttönäytteeksi. Immunoprecipitaatio suoritettiin käyttämällä RNA-sitovan proteiinin immunoprecipitaatiokittiä (EMD Millipore), joka perustui aiempaan raporttiin PKR45:n käytöstä. RNA-IP:hen käytettiin fosfo-PKR-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) tai kontrolloivaa kanin IgG:tä. RNA uutettiin TRIzolilla, minkä jälkeen se käsiteltiin DNaasilla ja saostettiin etanolilla. cDNA:t tuotettiin käyttämällä satunnaisia heksaamerialukkeita ja SuperScript Reverse transcriptase II:ta. Näytteet analysoitiin PCR:llä (RT) tai qRT-PCR:llä käyttäen Power SYBR Green PCR master mixiä (ThermoFisher). Rikastuminen laskettiin suhdelukuna (IP-näyte tulonäytettä kohti). Aloitinparit on lueteltu lisätaulukossa 1. SYBR-signaalia ei havaittu negatiivisissa kontrolleissa, mock-käsitellyissä soluissa fosfo-PKR-vasta-aineen IP:llä ja interferoni-α + kalykuliini A:lla käsitellyissä soluissa, joissa oli kontrollina kanin IgG IP
PKR-proteiinin ilmentyminen ja puhdistus
Rekombinantti PKR puhdistettiin aiemmin raportoidulla tavalla46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) transformoitiin BL21(DE3) Rosetta-soluihin (Novagen). Soluja kasvatettiin LB-väliaineessa 37 °C:ssa, kunnes A600 nm ~ 0,7, ja proteiinin ilmentyminen indusoitiin 1 mM IPTG:llä 3 tunnin ajan ~20 °C:ssa. PKR:n puhdistusta varten solut resuspendoitiin puskuriin A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanoli, 10 % glyseroli), jota täydennettiin proteaasi-inhibiittorikoktaililla (Sigma). Solut lysoitiin inkuboimalla 5 mg lysotsyymiä millilitrassa 30 minuutin ajan ja sen jälkeen sonikoimalla 3 minuutin ajan. Lysaattia sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 20 000 g:ssa. Supernatantti levitettiin hepariinisefaroosipylvääseen (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ), joka oli tasapainotettu puskurissa A, ja PKR eluoitiin käyttäen NaCl-gradienttia. Huippufraktiot laimennettiin kaksi kertaa puskurilla A ja levitettiin poly(I:C)-agaroosikolonnille (Amersham), joka oli tasapainotettu puskurissa A. PKR eluoitiin 1,1 M NaCl:lla, konsentroitiin ~10 mg:aan millilitrassa ja varastoitiin -80 °C:ssa.
PKR:n aktivaatiomääritys
PKR:n aktivaatiomääritykset suoritettiin aiemmin raportoidulla tavalla47. PKR defosforyloitiin λ-proteiinifosfataasilla 1 tunnin ajan 30 °C:ssa ja inhiboitiin sitten 2 mM natriumortovanadaatilla. PKR:ää (4 μM) inkuboitiin pitkän RNA:n (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng/ml)/lyhyen RNA:n (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng/ml)/poly(I:C) 20 μg/ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT ja 100 μM ATP (Ambion). Reaktioseoksia inkuboitiin 30 °C:ssa ilmoitetut ajat ja sammutettiin 1 × SDS-latauspuskurilla. Fosforyloituneet PKR:t havaittiin fosfo-PKR-vasta-aineella (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
RNA:n valmistaminen geelimigraatiokokeita ja SHAPE
Trunkioidut APOL1-RNA:t, joissa oli erilaisia 3′-rakennekasetteja, valmistettiin in vitro -transkriptiolla MegaShortScript-kitillä (ThermoFisher) valmistajan suositusten mukaisesti. Transkriptiomallit tuotettiin kahdessa semi-nested PCR-reaktiossa plasmideista, jotka sisälsivät APOL1-alleeleja (G0, G1, G2) tai niiden mutanttivariantteja (mG0, mG1, mG2). Ensimmäisessä reaktiossa käytettiin eteen- ja taaksepäin suuntautuvia alukkeita 5′ T7-promoottorin ja 45 nt:n 3′ SC:n lisäämiseksi typistettyihin APOL1-sekvensseihin (lisätaulukko 1). Jälkimmäinen elementti on lisätty, jotta SHAPE:lle saadaan käänteisen transkription hybridisaatiokohta. Osa kustakin reaktiosta monistettiin uudelleen käyttäen alkuperäistä eteenpäin suuntautuvaa aluketta ja lyhyempää käänteistä aluketta, jotta lopulliset transkriptiomallit olisivat homogeenisempia. Transkriptioreaktioita käsiteltiin Turbo DNase I:llä 5 minuutin ajan 37 °C:ssa, inkuboitiin 85 °C:ssa 2 minuutin ajan ja fraktioitiin denaturoivalla geelillä (5 % polyakryyliamidia-19:1, 1 × TBE, 7 M urea) vakiolämpötilassa (45 °C, 30 W max). Halutut RNA-tuotteet havaittiin UV-varjostuksella, poistettiin geeliltä, elektrolyytoitiin 200 V:n jännitteellä 2 tunnin ajan 4 °C:ssa, saostettiin etanolilla ja säilytettiin -20 °C:ssa 10 mM Tris, pH 7,0:ssa ennen käyttöä. RNA:n kantaliuokset kvantifioitiin spektrofotometrialla.
Gelimigraatiomääritys
Jokainen typistetty APOL1 RNA laimennettiin 1 μM:ksi 20 μl:aan RNA:n renaturointipuskuria (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5 % glyseroli (w per v)), denaturoitiin kuumentamalla 85 °C:een 2 minuutin ajan ja renaturoitiin jäähdyttämällä hitaasti (0,1 °C per s) 25 °C:een. Tämän jälkeen lisättiin MgCl2:ta loppupitoisuuteen 0, 1 tai 3 mM ja seoksia inkuboitiin vielä 30 minuuttia 37 °C:ssa Mg-riippuvaisten ja/tai muiden tertiääristen RNA-vuorovaikutusten muodostumisen edistämiseksi. RNA-konformerit stabiloitiin pikajäähdyttämällä 4 °C:een, minkä jälkeen ne fraktioitiin 5-prosenttisella ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä (5-prosenttinen akryyliamidi, 19:1) 16-18 tunnin ajan 4 °C:ssa. Sekä geeli- että juoksutuspuskuri sisälsivät 1 × TBE:tä ja 1 mM MgCl2:ta, ja geelit esijuoksutettiin ~1 h ennen lataamista. Geelit altistettiin SybrGreen-väriaineelle (ThermoFisher) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja RNA-konformerien migraatioasennot havaittiin Typhoon Trio+ variable mode imager -laitteella (GE Healthcare).
SHAPE ja RNA:n sekundäärirakennemallien tuottaminen
SHAPE-kokeen menetelmät on kuvattu aiemmin48,49. Lyhyesti sanottuna typistettyä APOL1 RNA:ta SC:llä RNA:ta taitettiin kuten geelimigraatiokokeessa, paitsi että seoksen tilavuus oli 150 μL, lopullinen MgCl2-konsentraatio oli 1 mM ja glyseroli jätettiin pois. RNA-liuokset jaettiin kontrolli- (1M7-) ja koe- (1M7+) alivoiteisiin (72 μL kumpikin), ja niihin lisättiin vastaavasti 8 μL DMSO:ta tai 8 μL 30 mM 1M7:ää DMSO:ssa. Modifikaatioreaktioita inkuboitiin 37 °C:ssa 5 minuutin ajan, jäähdytettiin 4 °C:seen, saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 10 μl:aan nukleaasivapaata vettä. Käsitellyt RNA:t käänteistranskriboitiin eri tavoin leimatuista alukkeista, jotka olivat komplementaarisia 3′-rakennekasetin kanssa (1M7- aluke, Cy5.5; 1M7+ aluke, Cy5), ja hydrolysoitiin emäskäsittelyllä. Näin saadut cDNA-kirjastot saostettiin etanolilla ja liuotettiin uudelleen Sample Loading Solution -liuokseen (Genome Lab), minkä jälkeen ne yhdistettiin ddA- ja ddG-sekvensointitikkaiden kanssa, jotka oli merkitty WellRED D2:lla (Beckman Coulter) ja IRDye 800RS:llä (LI-COR). Yhdistetyt näytteet fraktioitiin kapillaarielektroforeesilla (CE) Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzerillä. Kunkin RNA:n reaktiivisuusprofiilit luotiin CE-elektroferogrammeista SHAPEfinder-ohjelmistolla50 , minkä jälkeen ne syötettiin RNAstructure-ohjelmiston versioon 5.751,52 yhdessä RNA:n sekvenssien kanssa sekundäärirakennemallien luomiseksi. Oletusarvoista slope- (1,8 kcal/mol) ja intercept- (-0,6 kcal/mol) parametria käytettiin reaktiivisuusarvojen muuntamiseen pseudoenergiarajoituksiksi, jotka muokkaavat RNA:n taittoalgoritmia. RNAstructure tuottaa automaattisesti useita rakennemalleja, jotka vastaavat parhaiten SHAPE:sta johdettuja reaktiivisuusprofiileja, ja asettaa ne paremmuusjärjestykseen Gibbsin vapaan energian perusteella. Näin tuotetut alhaisimman energian rakennemallit on esitetty kuvissa 3a, b ja täydentävässä kuvassa 4.
In vitro knock down
Toteutimme knock down -kokeet käyttäen ehdollisesti immortalisoituja ihmissolulinjoja, jotka oli perustettu ihmisen virtsasta42. Transfektoimme nämä solut joko Stealth RNAi Negative Control Med GC:llä (ThermoFisher) tai ennalta suunnitellulla stealth siRNA:lla APOL1:tä vastaan (HSS112492, ThermoFisher) käyttäen Lipofectamine RNAiMAXia (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo transfektoitiin yhdessä ja sitä käytettiin transfektiokontrollina. Knock down -tehokkuudet olivat 52,4-75,4 % (RNA-tasot) tai 31,1 % (proteiinitasot).
Hiiret
Käytimme ihmisen APOL1-geenin lokuksen siirtogeenisiä hiiriä (BAC-APOL1-hiiret), jotka on tuotettu käyttämällä bakteerin keinotekoista kromosomia, joka sisältää APLOL-G0- tai APOL1-G1- tai APOL1-G2- lokuksen. Ihmisen BAC-kloonista (ENST00000397278, joka vastaa NM_003661:tä) eristettiin ja subkloonattiin ~47 kb:n kokoinen ihmisen DNA, joka käsittää ainoastaan APOL1-geenin ja sen 5′- ja 3′-alueet (mukaan lukien APOL2:n eksonit 1 ja 2 ja MYH9-geenin osan eksonit 39-41 sisältävä 3′-alue). Yksittäiset G0-, G1- ja G2-BAC-subkloonit injektoitiin 129SvJ/B6N F1-alkioihin, ja perustajat risteytettiin myöhemmin 129SvJ:hen. Alaklooni sekvensoitiin sen varmistamiseksi, että se oli NCBI:n ja Ensemblin referenssigenomisekvenssi. Ainoat erot olivat polymorfismeja intronisilla alueilla. Ehdollisissa transgeenisissä hiirikokeissa käytimme podosyyttispesifisiä APOL1:n typistettyä RNA:ta sisältäviä FVB-taustaisia transgeenisiä hiiriä. Tuotimme nämä hiiret ehdollisella siirtogeenisellä järjestelmällä, jossa käytettiin nefriinin (NPHS1) promoottorin ohjaamaa typistettyä RNA-sekvenssiä (NM_001136540, 1031-1453). Tuotimme kaksi kantaa: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA:lla, jossa on rs73885319 A ja rs60910145 G, ja NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA:lla, jossa on rs73885319 G ja rs60910145 G.
Glomerulien eristäminen
BAC/APOL1-hiirille (iältään 8-12 viikon ikäisiä hiiriä) annettiin IFNγ-valmistetta (106 U painokiloa kohti IP) päivittäin 3 päivän ajan ennen kudosnäytteenottoa. Glomerulusten eristysprotokolla on raportoitu yksityiskohtaisesti53. Lyhyesti sanottuna hiiret nukutettiin vatsansisäisellä Avertin-injektiolla (2,2,2,2-tribromietyyli- ja tertiäärinen amyylialkoholi; 17 μl/g) ja perfusoitiin 8 × 107 Dynabeads-helmellä (M450 tosylactivated: Dynal #140.04), jotka oli laimennettu 20 ml:aan fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta sydämen läpi. Munuaiset pilkottiin kollagenaasi A:lla ja DNaasi I:llä 37 °C:ssa 10 minuutin ajan. Kollagenaasilla pilkottu kudos puristettiin varovasti 100 μm:n solusiivilän läpi ja pestiin HBSS:llä. Näytteet pestiin ja resuspendoitiin magneettialustan avulla. Glomerulukset kerättiin ja inkuboitiin RPMI1640:ssä, jota täydennettiin 10 %:lla FBS:llä, ITS:llä, 1 %:lla penisilliiniä/streptomysiiniä (100 iU/ml; 100 μg/ml) ja 100 mM kalykuliini A:lla (LC Laboratories) 30 minuutin ajan, ja niitä käytettiin Western blot -analyysiin.
Immunohistokemia (hiirinäytteet)
BAC/APOL1-hiirille (8-12 viikon ikäisiä) annettiin IFNγ:tä (106 U/ruumiinpainokiloa kohti IP) päivittäin 3 päivän ajan. Hiiret perfusoitiin 100 mM kalykuliini A:ta sisältävällä PBS:llä ennen kudosnäytteenottoa. Sen jälkeen munuaiset leikattiin pieniksi paloiksi ja inkuboitiin RPMI1640:ssä, jota täydennettiin 10 %:lla FBS:llä, ITS:llä ja 100 mM kalykuliini A:lla 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen kudokset kiinnitettiin välittömästi 10-prosenttisella puskuroidulla formaliinilla. BAC/APOL1-hiirille (8-12 viikon ikäisiä) annettiin IFNγ:tä (106 U painokiloa kohti IP) päivittäin 3 päivän ajan. NPHS1-APOL1-ΔRNA-hiirille annettiin IFNγ:tä (106 U painokiloa kohti IP) päivittäin 3 päivän ajan ennen kudosnäytteenottoa. Käytimme parafiiniin kiinnitettyjä 4-5 μm:n kudosleikkeitä. Leikkeet deparafinoitiin/rehydratoitiin, antigeenin talteenotto suoritettiin kuumentamalla sitraattipuskuroidussa väliaineessa 5 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Kudokset estettiin 1 % BSA:lla ja 0,1 % saponiinilla. Leikkeitä inkuboitiin primaarivasta-aineilla, joihin kuuluivat seuraavat: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) ja podokalyksiini (R&D Systems AF1556). Immunofluoresenssia varten käytimme Alexa Fluor sekundäärivasta-aineita (ThermoFisher) ja visualisoimme konfokaalimikroskopialla. ABC-värjäykseen käytettiin biotiinikonjugoitua sekundääristä vasta-ainetta ja Avidin-HRP:tä (Vector). Visualisointiin käytettiin DAB-kittiä (Vector). Hiirikokeissa hiiriä (8-12 viikon ikäisiä) hoidettiin IFNγ:llä (106 U painokiloa kohti IP), joka injektoitiin 3 päivää ennen kudosnäytteenottoa. Signaalin kvantifiointia varten podosyyttien fosfo-PKR-signaali havaittiin hiirikokeissa WT1:n vastavärjäyksellä.
Immunohistokemia (ihmisnäytteet)
Tämä tutkimus hyväksyttiin etukäteen Marylandin yliopiston ja NIDDK:n, NIH:n IRB:ssä. Tapausten perusominaisuudet on lueteltu täydentävässä kuvassa 5b. Värjäys suoritettiin käyttäen 5 μm paksuisia formaliinilla kiinnitettyjä, parafiiniin upotettuja kudosleikkeitä. Deparafinoinnin jälkeen lämpöindusoitu antigeenin talteenotto suoritettiin 20 minuutin ajan pH 6,0:n puskurissa käyttäen painekeitintä (Pascal, Agilent Technologies Dako). Leikkeitä inkuboitiin primaarivasta-aineilla, joihin kuuluivat seuraavat: fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) ja WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Käytettiin Alexa Fluor -toisiovasta-aineita (ThermoFisher) ja visualisoitiin konfokaalimikroskopialla.
Immunohistokemia ja elävien solujen kuvantaminen
Soluja inkuboitiin 200 nM Mito Tracker Greenillä (Invitrogen) ja 200 nM TMRE:llä (Invitrogen) 20 minuutin ajan ennen signaalin havaitsemista 20 μM:n FCCP-käsittelyn jälkeen ja visualisoitiin konfokaalimikroskopialla.
Signaalin kvantifiointi mikroskooppikuvista
Ihmiskudoksen osalta laskimme glomerulukset, joissa ei ollut globaalia skleroosia (6 ei-riskigenotyyppitapausta: 5, 6, 7, 10, 5 ja 9 glomerulia kustakin tapauksesta; 6 riskigenotyyppitapausta: 13, 6, 4, 5, 10 ja 5 glomerulia). Hiiren ja ihmisen kudosten osalta laserin teho säädettiin siten, että maksimisignaali ei kyllästynyt. Kuvankäsittely ja kolokalisaatioanalyysit tehtiin Zen-ohjelmistolla (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa)54 . Painotettu kolokalisaatiokerroin ja keskimääräinen intensiteetti WT-1-positiivisissa soluissa laskettiin aiemmin raportoidulla tavalla54. Keskimääräistä intensiteettiä varten vakioimme podosyyttisignaalin intensiteetin käyttämällä WT1-negatiivisten glomerulussisäisten solujen signaaleja kunkin glomeruluksen osalta. Arvot olivat suhteellisia pistemääriä, kun APOL1-G0:n signaalin intensiteetti oli 100 %. Kvantifioinnit suoritettiin sokkoutetusti.
In situ -hybridisaatio
Kromogeenien in situ -detektointi suoritettiin hiiren formaliiniin kiinnitetyistä parafiiniin sulautetuista (FFPE) lohkoista otetuista kudosleikkeistä RNAscope in situ -hybridisaatiolla (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Lyhyesti sanottuna 5 μm:n FFPE-kudosleikkeet de-parafinoitiin, keitettiin esikäsittelyreagenssilla 15 minuutin ajan ja sitten proteaasimädätettiin 40 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen hybridisoitiin 2 tuntia 40 °C:ssa koettimella-Hs-APOL1-01 (luettelo # 439871, Advanced Cell Diagnostics). Lisäksi Probe-Mm-PPIB (luettelo # 313911) ja Probe-DapB (luettelo # 310043) käytettiin positiivisena ja negatiivisena kontrollina. Spesifisten koettimien sitoutumiskohtien havaitseminen visualisoitiin RNAScope 2.0 HD -reagenssisarjalla (ruskea) (Catalog # 310035).
Hiiren proteinuria-malli
Kaikki kokeet suoritettiin National Institutes of Healthin laboratorioeläinten hoito- ja käyttöoppaan (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) mukaisesti, ja ne hyväksyttiin etukäteen NIDDK:n eläinten hoitoa ja käyttöä käsittelevässä komiteassa (eläintutkimusehdotus (K097-KDB-14)). Käytimme sekä uros- että naarashiiriä, jotka olivat 8-15 viikon ikäisiä. Kunkin kokeen hiiret vastasivat toisiaan sukupuolen, iän ja ruumiinpainon suhteen. Satunnaistaminen suoritettiin ruumiinpainon suhteen. Kokeiden otoskoko määritettiin ilman virallisia teholaskelmia. Poissulkukriteereinä olivat yli 20 %:n painonpudotus koejakson aikana. Proteinurian indusoimiseksi hiirille (8-12 viikon ikäisille) ruiskutettiin bFGF:ää ja puromysiiniaminonukleosidia aiemmin kuvatulla tavalla30. NPHS1-APOL1-deltaRNA-hiirikannassa puromysiiniaminonukleosidi (Sigma-Aldrich) injektoitiin ihon alle päivänä 0 (200 mg painokiloa kohti) ja bFGF (Kaken Pharmaceutical) injektoitiin laskimoon päivinä 0 ja 2 (5 μg eläintä kohti). PKR:n estäjäkokeissa PKR:n estäjää C16 (10 μg per kg IP) päivittäin päivästä 0 päivään 1055. BAC-APOL1-hiirikannalle injektoitiin interferoni γ:tä (Prospec) päivänä -1 ja päivänä 1 (106 U/ruumiinpainokilo), puromysiiniaminonukleosidia ihon alle päivänä 0 (300 mg/ruumiinpainokilo) ja bFGF:ää (Kaken Pharmaceutical) suonensisäisesti päivinä 0 ja 2 (5 μg/eläin). PKR:n estäjäkokeissa käytettiin PKR:n estäjää C16 (10 μg per kg IP) päivittäin päivästä 0 päivään 1055.
Virtsan albumiinin ja kreatiniinin mittaaminen
Määritimme virtsan albumiinipitoisuudet ELISA-menetelmällä käyttäen hiiren mikroalbuminuria-ELISA-kittiä (Exocell). Mittasimme virtsan kreatiniinipitoisuuden kreatiniinimäärityssarjalla (Exocell). Kaikki mittaukset tehtiin kahtena kappaleena. Määritimme albuminurian virtsan albumiinin ja kreatiniinin suhteena. Kaikki toimenpiteet suoritettiin valmistajien pöytäkirjojen mukaisesti. Tutkijat eivät olleet sokkoutettuja ryhmäjakoa kohtaan, mutta olivat sokkoutettuja tuloksia arvioitaessa.
Statistinen analyysi
Tiedot vähintään kolmesta yksittäisestä kokeesta analysoitiin ja esitettiin pistekuviona ja keskiarvona. Tilastolliset analyysimenetelmät kirjoitettiin kuhunkin kuvan legendaan. Emme säätäneet moninkertaisia vertailuja. Arvoja P < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.