2 Life History
FBF cercariae ovat pieniä, niitä on vaikea tunnistaa morfologisesti, ja niiden infektioiden esiintyvyys selkärangattomien väli-isäntäpopulaatioiden keskuudessa on tyypillisesti erittäin alhainen (Cribb et al., 2011). Ehkä näiden ominaisuuksien vuoksi väli-isäntä(t) on tuntematon(t) kaikilla muilla paitsi muutamilla FBF-lajeilla: useilla makean veden Sanguinicola-suvun lajeilla (ks. Bullard ja Overstreet, 2008) ja merilajeilla Aporocotyle simplex (ks. Køie, 1982; Køie ja Petersen, 1988, kokeelliset tartunnat; molekyylimarkkereita ei ole sovellettu), Paracardicoloides yamagutii (ks. Nolan ja Cribb, 2004a; ks. seuraava teksti), C. forsteri (ks. Cribb et al., 2011; ks. seuraava teksti) ja Cardicola opisthorchis (ks. Sugihara ym., 2014; ks. seuraava teksti). ITS2 rDNA-sekvenssejä on käytetty selkärangattomista isännistä kerättyjen, morfologisesti määrittelemättömien FBF:n toukkanäytteiden, ts. cercariae-, sporocysta- ja rediae-näytteiden, ja sympatristen kalojen isännistä kerättyjen, morfologisesti erottuvien aikuisnäytteiden yhteensovittamiseen. Nopeasti ja edullisesti molekyylimarkkerit mahdollistavat infektioiden nopean havaitsemisen, tartunnanaiheuttajan tunnistamisen fylogeneettisen päättelyn tai sekvenssihomologian perusteella jo sekvensoituun taksoniin nähden sekä väli-isäntien tunnistamisen, mikä yhdistää potentiaalisesti patogeenisten FBF:ien elämänvaiheet. Väli-isäntien ja lopullisten isäntien tunnistaminen on varmasti kriittinen ensimmäinen askel FBF:ien elinkaaren ymmärtämisessä. Diagnostisten lähestymistapojen lisäksi on kuitenkin vielä paljon opittava FBF:ien ja niiden monisukaskaisten, kotiloiden ja simpukoiden väli-isäntien välisen isäntä-parasiittisuhteen erityisistä yksityiskohdista. Loppujen lopuksi nämä väli-isännät saattavat hyvinkin vaikuttaa niiden kehityshistoriaan yhtä paljon tai jopa enemmän kuin niiden lopulliset isännät. Näin ollen väitämme, että molekyylitutkimusten ei pitäisi täysin syrjäyttää klassisia kokeellisia tutkimuksia, joissa tehdään suoria mikroskooppihavaintoja toukkien ja aikuisten FBF:ien esiintymisestä isäntäkudoksissa naiivien selkärangattomien ja lopullisten kalojen isäntäkudosten altistamisen jälkeen (Køie, 1982).
Valtaosa FBF:ien elinkiertoa koskevista tiedoista on peräisin kaupalliseen vesiviljelyyn liittyvistä vesieläinten terveysohjelmista: GenBankissa saatavilla olevista 109 FBF-sekvenssistä 17 (16 %) on peräisin merivesiviljelyn infektioista (taulukko 1.1). FBF:t ovat yksi harvoista vapinatodiryhmistä, joiden jäsenet voivat vahingoittaa kalan lopullista isäntää aikuisina, jotka tukkivat verisuonia ja aiheuttavat tukehtumisen, munina, jotka vaurioittavat tai tukkivat kidusten epiteeliä ja haarakalojen verisuonia, ja miracidioina, jotka kuoriutuvat kidusten epiteeliin upotetuista munista ja poraantuvat ulos kalasta (Bullard ja Overstreet, 2002, 2008). Sellaisenaan niiden elinkierto on huolenaihe kaupallisille vesiviljelytoiminnoille, koska FBF:t voivat tappaa tai heikentää kaloja ja aiheuttaa taloudellisia tappioita makean veden lammikoissa, kilpa-altaissa ja avomerellä sijaitsevissa merihäkeissä.
Ensimmäisessä julkaistussa FBF:n elinkiertotutkimuksessa, joka määritettiin molekyylimenetelmää soveltamalla, Nolan ja Cribb (2004a) dokumentoivat kaksi cercaria-morfotyyppiä (”A-tyyppi” ja ”B-tyyppi”), jotka tartuttivat 80:tä 11 314:stä (0,7 %) hydrobiidisen gastropodin Posticobia brazieri -yksilöstä Queenslandin (Australia) vuorovesipuroissa. Tyypin A cercaria-tyypin ITS2 rDNA-sekvenssit täsmäsivät (100-prosenttinen yhdenmukaisuus) aikuisten P. yamagutii -yksilöiden kanssa, jotka kerättiin Anguilla reinhardtii -lajin täplikkään pitkäsiipisten ankeriaiden verestä (selkäaortta, eteinen, kammio, kidukset, munuaiset, suoliston verisuonet ja uimarakko). Toisessa tutkimuksessa Cribb et al. (2011), joka vastasi Etelä-Australian edustalla viljeltyä eteläistä tonnikalaa T. maccoyii infektoivien C. forsteri -tartuntojen aiheuttamiin sairauksiin liittyviin huoliin, seuloivat 9351 yksilöä 11:stä simpukka-, 2:sta simpukkaperheestä ja 24:stä monisukasjalkaisperheestä FBF:n infektioiden varalta. Longicarpus modestus -lajin (Polychaeta: Terebellidae) tartunnan saaneista serkarioista saadut ITS2 rDNA-sekvenssitiedot täsmäsivät 100-prosenttisella yksimielisyydellä C. forsteri -lajin aikuisten yksilöiden kanssa, jotka olivat peräisin lähellä sijaitsevan eteläisen tonnikalan sydämestä Port Lincolnissa, Australiassa sijaitsevassa verkkokarsinassa. He myös sekvensoivat 28S rDNA-fragmentin (721 bp D1-D2-alueella) C. forsterin cercarioista, jotka tartuttivat L. modestuksen. Cribbin ym. (2011) lähestymistapaa seuraten Sugihara ym. (2014) keskittyivät monisukasmatoihin tutkiessaan 744 selkärangatonta FBF-infektioiden varalta Tyynenmeren tonnikalan Thunnus orientalis -lajin viljelypaikalla Etelä-Japanin edustalla. FBF:n sporokystia ja cercariaa löytyi viidestä terebellid-puolisukasjalkaisen monisukasjalkaisen (Terebella) yksilöstä, jotka kerättiin kuoren sisältä kuolleista simpukoista, jotka oli otettu pohjamaasta ja merihäkin alapuolella olevista köysistä ja kellukkeista. Sporokystien ITS2- ja 28S-sekvenssit olivat identtiset (100 %) viljellyn Tyynenmeren tonnikalan sydämestä saatujen aikuisten C. opisthorchiksen sekvenssien kanssa.
Shirakashi ym. (2012) tutkivat Cardicola orientalis- ja C. opisthorchis -bakteerien samanaikaisia infektioita Tyynenmeren tonnikalassa. He käyttivät ITS2 rDNA-sekvenssitietoja erottaakseen toisistaan C. opisthorchiksen puolikuun muotoiset munat afferentissa filamenttivaltimossa ja C. orientaliksen soikeat munat, jotka infektoivat kidusten lamelleja. He totesivat, että kiduskudosnäytteisiin sovelletut lajikohtaiset PCR-alkuaineet voisivat täydentää histopatologiaa ja auttaa diagnosoimaan infektiot ennen kuin munia ja aikuisia on tarpeeksi paljon, jotta ne voidaan helposti havaita valomikroskopialla. Yong ym. (2013) käyttivät täydellisiä ITS2 rDNA-sekvenssitietoja, joiden avulla he tunnistivat viiden perhoskalalajin (Perciformes: Chaetodontidae) kiduksiin jääneet FBF-munat Isolta valliriutalta peräisin olevasta perhoskalasta yhdeksi ainoaksi lajiksi Cardicola chaetodontis (yhden emäsparin ero kahdessa näytteessä). FBF:n munia ei ole harvoin havaittu kalojen kidusten epiteelissä ja haara-arterioleissa rutiininomaisissa kalojen ruumiinavauksissa (SAB, henkilökohtaiset havainnot), mutta monissa tapauksissa vastaavia aikuisia yksilöitä, jotka tartuttavat yksittäisen kalan veren, ei saada talteen. Molekyylitekniikat, joilla voidaan tehokkaasti uuttaa ja monistaa DNA:ta FBF:n mätimunista, jotka ovat pienikokoisia, esimerkiksi C. chaetodontis -lajin mätimunat ovat kokonaispituudeltaan 40-60 μm, lupaavat paljastaa nimeämättömiä FBF-lajeja ja toistaiseksi dokumentoimattomia isäntiä, jos saadut sekvenssit asetetaan fylogeneettiseen yhteyteen nimettyjen lajien sekvenssien kanssa. Samaa voidaan sanoa cercariaeista saaduista sekvensseistä (ks. seuraava teksti). Käyttämällä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota (qPCR) Norte Do Santos et al. (2012) tunnistivat C. forsterin munat, jotka olivat kerääntyneet karjatun eteläisen tonnikalan kiduksiin. Vastaavasti Kirchhoff et al. (2012) sovelsivat tätä menetelmää T. maccoyii -lajia infektoivien C. forsteri -munien diagnosointiin. Polinski et al. (2013) veivät lähestymistavan askeleen pidemmälle kehittämällä herkän ja tarkan reaaliaikaisen PCR-tekniikan, jota voidaan käyttää myös C. forsterin, C. orientaliksen ja C. opisthorchiksen tunnistamiseen ei-kuolleista näytteistä. Kummassakaan testatussa menetelmässä, eli SYBR-pohjaisessa qPCR:ssä ja yhteisessä reportteri-TaqMan-määrityksessä, ei havaittu ristikkäistä laji- tai isäntägenomista monistumista; niiden yhdistetty käyttö paransi kuitenkin luotettavuutta lajien erottamisessa. Nämä menetelmät ovat vahvistaneet C. forsterin ja C. orientaliksen samanaikaiset infektiot T. maccoyii -lajissa, mikä osoitti myös C. orientaliksen suuremman esiintyvyyden ja levinneisyyden isännässä.
Nyttemmin molempien kehitettyjen tekniikoiden käyttökelpoisuutta tuettiin FBF-infektioiden patologisten seurausten arvioinnissa. Polinski ym. (2014) yhdistivät qPCR:n ja isäntägeenin immuunitranskription määrittämään C. opisthorchiksen ja C. orientaliksen infektoimien kudosten DNA-määriä. He myös kvantifioivat isännän ajallisen immuunivasteen näille infektioille häkissä olevissa Tyynenmeren tonnikaloissa. Aiemmat tiedot dokumentoivat C. orientalis -lajin aikuisia ja munia kiduksissa (Ogawa ym., 2010; Shirakashi ym., 2012), kun taas C. opisthorchis -lajin aikuiset ja munat tartuttivat sydäntä ja afferentteja haaravaltimoita (Ogawa ym., 2011; Shirakashi ym., 2012). Polinskin ym. (2014) tulokset osoittivat kuitenkin IgM-transkription korreloivan suuriin määriin ”vain C. orientalis” -infektioita kiduskudoksissa, mutta ei C. opisthorchiksen DNA:n kanssa, mikä viittaa siihen, että tällainen immuunivaste tässä elimessä saattaisi käynnistyä pikemminkin aikuisten kuin munien läsnäolosta. Lisäksi korkeat C. orientalis -viruksen DNA-pitoisuudet sydämessä johtuivat nuorten toukkien läsnäolosta. Vaikka tällaisilla menetelmillä ei voida tunnistaa FBF:n elämänvaiheita tai sitä, ovatko toukat eläviä vai kuolleita, tämä kvantitatiivinen lähestymistapa mahdollistaa infektion voimakkuutta ja tartuntatilannetta koskevat arvelut, mikä itsessään on lupaava väline tulevissa epidemiologisissa tutkimuksissa, joissa käytetään luonnonvaraisia tai viljeltyjä kaloja.
Brant ym. (2006) käyttivät fylogeneettistä päättelyä (28S, 18S ja COI) käsitellessään useita Ugandassa, Keniassa ja Australiassa esiintyneistä gastropodeista (Planorbidae ja Thiaridae) eristettyjä tunnistamattomia oletettuja FBF-serkarioita. He luonnehtivat kercarioita morfologisesti valomikroskooppikuvien avulla ja silmäpisteiden esiintymisen tai puuttumisen, kercarian hännän ja rungon evätaitosten sekä hännän muodon perusteella. Vaikka johdonmukainen ja fylogeneettisesti yhtenäinen, morfologiaan perustuva määritelmä (diagnoosi) FBF-serkarioille puuttuu, nämä serkariat ovat tyypillisesti tunnusomaisia: ne ovat pienikokoisia, haarahäntäisiä, niillä ei ole vatsanpuoleista imukappaletta, niillä on tunnusomainen tunkeutumiselin, joka todennäköisesti koostuu erikoistuneesta etupuoleisesta imukappaleesta (Truong ja Bullard, 2013), serkariarion vartalossa on eväpoimu ja hännän karvapeitteessä on eväpoimu, tai se voi esiintyä kokonaan tai osittain puuttua siitä kokonaan (Cribb et al., 2011). Yksi näistä serkarioista (W5004) oli morfologisesti erityisen outo, eli se kuvattiin apharyngeaattiseksi ja furkokeriaattiseksi, mutta sillä oli ”ylimääräiset lateraaliset pyrstökalvot ja teräväkärkinen vartalon muoto”, eikä yhdelläkään näistä serkarioista ollut kaikkia FBF-serkarioille tyypillisiä piirteitä (ks. edellinen teksti). Näiden serkarioiden yhdistetty 18S- ja 28S-analyysi kuitenkin klusteroi ne muiden FBF-sekvenssien kanssa (oletamme, että ”Sanguinicolid sp.” on ”Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Tästä syystä ja koska ne olivat morfologisesti outoja suhteessa tunnettuihin FBF-serkarioihin, nämä kirjoittajat esittivät, että FBF-serkarioiden morfologinen monimuotoisuus on paljon suurempi kuin kirjallisuudessa on tähän mennessä tunnustettu. Näiden sekvenssien taksonomista identiteettiä ja fylogeneettistä merkitystä käsitellään tarkemmin myöhemmin tekstissä.