Vesikasvi Azolla biopolttoaineiden tuotannon universaalina raaka-aineena

Synteettisen jäteveden käsittely Azolla filiculoides -kasvilla

Bioremediaatiokokeilua varten valmistettiin seleenipitoinen synteettinen jätevesi (SeSW) sekoittamalla korkea fosfaattipitoisuus (PO4-P), 1.3 g/l, kohtalainen määrä ammoniakkia (NH4-N), 55 mg/l, ja alhainen nitraattipitoisuus (NO3-N), 15 mg/l (lisätiedosto 4: taulukko S3). Tämä koostumus simuloi tyypillisten tekstiilivärjäys-, viimeistely- ja pyykinpesuaineiden tuotantoteollisuuden jätevesien ominaisuuksia. Jätevettä täydennettiin 0,8 mg/l SeO2:lla. Tässä kokeessa käytimme A. filiculoidesin 5 päivän SeSW-käsittelyä. Joidenkin jätevesillä kasvavien vesikasvien kasvuvauhti kasvaa yleensä eksponentiaalisesti 4-5 ensimmäisen päivän aikana havaitun viiveen jälkeen, jolloin biomassa ei muutu merkittävästi . Tämä ajanjakso liittyy kuitenkin jäteveden tärkeimpien ravinteiden voimakkaaseen imeytymiseen, mikä johtaa vesikasvien voimakkaaseen eksponentiaaliseen kasvuun viiveen jälkeen . A. filiculoidesin ravinteiden poistaminen SeSW:stä viiden ensimmäisen käsittelypäivän aikana ei johtanut tilastollisesti merkitseviin muutoksiin (P ≤ 0,05) biomassan tuotannossa (0,3 ± 0,1 g dw). Se johti kuitenkin jopa 25,4 prosentin NH4-N:n, 69,5 prosentin NO3-N:n ja 24,3 prosentin PO4-P:n imeytymiseen 100-prosenttisesta SeSW:stä (taulukko 1; kuva 1). Laimennettu (50 %) SeSW oli vähemmän stressaavaa A. filiculoidesille, mikä näkyi korkeampina ravinteiden ottomäärinä: 33,4 % NH4-N:n, 93 % NO3-N:n ja 39,8 % PO4-P:n osalta. A. filiculoidesin ravinteiden imeytymisasteet on raportoitu aiemmin useiden tutkimusryhmien toimesta .

SeSW:n käsittely A. filiculoides -kasvintuhoojalla johti Se:n 40 %:n imeytymiseen 100-prosenttisesta SeSW:stä ja 76 %:n imeytymiseen 50-prosenttisesta SeSW:stä imeytymisnopeuden ollessa 47,6 µg Se/L-vrk:n ja 39,9 µg Se/L-vrk:n osalta (kuva 2; taulukko 2). Tämä korreloi A. filiculoidesin 158,8 µg Se/g dw-päivä 100-prosenttisesta SeSW:stä ja 133,5 µg Se/g dw-päivä 50-prosenttisesta SeSW:stä peräisin olevan Se:n kertymisasteen kanssa (taulukko 2). Tämä imeytymistehokkuus on 85 prosenttia 50-prosenttisen SeSW:n ja 83 prosenttia 100-prosenttisen SeSW:n teoreettisesta enimmäisimeytymisarvosta. Suunnilleen samanlainen Se:n imeytymisnopeus havaittiin toisella Azollan edustajalla, Azolla caroliniana, joka imeytyi jopa 1 mg Se/g dw 2,5 mg/L Se-liuoksesta kahden viikon käsittelyn aikana. Tämä on korkeampi kuin muilla vesikasveilla, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) ja Eichhornia (300 mg Se/g dw) .

SeSW-laimennoksille altistetun P. australiensis -lajin eloonjäämisnopeus on esitetty lisätiedostossa 5: Kuva S2. Selviytyminen oli nolla (0 %), kun ne altistettiin 96 tunnin ajan 100-prosenttiselle käsittelemättömälle (kontrolli) SeSW:lle. Eläviä katkarapuja ei havaittu myöskään 80-prosenttisessa tai 50-prosenttisessa SeSW:ssä. A. filiculoides -käsittelyn jälkeen SeSW:n myrkyllisyys väheni 2,6-kertaiseksi ja LC50-arvo nousi 11,22 prosentista 29,80 prosenttiin. filiculoides-näytteestä, mukaan lukien haihtuvien aineiden, kosteuden, kiinteän hiilen ja tuhkan (eli näytteiden epäorgaanisten komponenttien) kokonaispitoisuus, on esitetty yhteenvetona Additional file 6: Table S4. 950 °C:ssa kerättyjen haihtuvien aineiden kokonaismäärä on 88 prosenttia kokonaistuotteesta. Kokonaistuotteessa oli 11 % kosteutta, 7,3 % tuhkaa ja 4,4 % kiinteää hiiltä. Proksimaattianalyysi osoitti, että keskeiset alkuaineet sisälsivät 46,2 % C:tä, 7,4 % H:ta, 3,0 % N:ää, 43,2 % O:ta ja 0,2 % S:ää (laskettu erotuksen mukaan).

Azolla filiculoides -näytteen termogravimetriset analyysit

A. filiculoides -näytteen TGA-DTG-analyysi tehtiin lämpötila-alueella 23-900 °C lämmitysnopeudella 10 °C/min typpi-ilmakehässä, ja analyysi esitetään kuvassa 3. TGA- ja DTG-käyrät paljastivat A. filiculoidesin kolme hajoamisvaihetta pyrolyysiprosessissa; Agrawal ja Chakraborty raportoivat samankaltaisia tuloksia. Biomassa menetti painoaan kolmessa vaiheessa, joista ensimmäinen tapahtui 154-160 °C:n lämpötilassa, toinen 180-580 °C:n lämpötilassa ja kolmas noin 580-900 °C:n lämpötilassa. Ensimmäinen vyöhyke edustaa biomassanäytteen kuivumisen aiheuttamaa lievää painonmenetystä (7 %). Suurin osa pyrolyysin aiheuttamasta painohäviöstä (51 %) tapahtui toisella vyöhykkeellä, jossa suurin osa haihtuvista aineista vapautuu; voimakas piikki osoittaa proteiinien, hiilihydraattien ja lipidien hajoamista. Kolmannella vyöhykkeellä tapahtuu hiilipitoisen tuotteen hajoaminen, joten painohäviö johtuu pääasiassa kaasutuksesta, jossa erittäin haihtumattomat hiiliyhdisteet höyrystyvät muodostaen CO:ta ja CO2:ta korkeiden lämpötilojen vuoksi .

Azolla filiculoidesin hydroterminen nesteytys

A. filiculoidesin hydroterminen nesteytys suoritettiin tislattua vettä liuottimena käyttäen lämpötiloissa 260, 280 ja 300 °C viipymäaikojen ollessa 15 min. Reaktio-olosuhteet valittiin aiempien tutkimustemme ja kirjallisuuden perusteella, jotta ymmärrettäisiin lämpötilan vaikutus A. filiculoidesin bioöljytuotteen saantoon alikriittisessä vedessä . HTL-käsitellyn A. filiculoides -näytteen tuotejakauma on esitetty kuvassa 4. Bioöljyn kokonaistuotos oli 15,83 % 260 °C:ssa, 21,50 % 260 °C:ssa, 21,50 % 280 °C:ssa ja 16,0 % 300 °C:ssa, joten suurin saanto saatiin 280 °C:ssa. Kokonaisbioöljy koostui eetterifraktiosta (Bio-oil1), joka saatiin nestemäisen osan uuttamisesta, ja asetonifraktiosta (Bio-oil2), joka saatiin kiinteän osan uuttamisesta (”Menetelmät”). Bioöljy2:n viskositeetti oli korkea, ja sen havaittiin olevan tervamaista nestettä. Kiinteän jäännöksen saanto laski jatkuvasti 66,83 prosentista 33,83 prosenttiin, kun lämpötila nousi 260 °C:sta 300 °C:een. Kaasujen saanto väheni siirryttäessä 260 °C:sta 280 °C:een. Kun lämpötila oli yli 280 °C, kaasujen saanto kasvoi 7,1 prosenttiin. A. filiculoides -biomassan HTL:ssä kahden päätuotteen, biokaasun ja biohiilen, jakauma oli samankaltainen kuin pyrolyysin jälkeen saaduissa tiedoissa: HTL:ssä biokaasun osuus oli keskimäärin 6,05 % ja pyrolyysissä 12 % ja biohiilen osuus noin 50 %. HTL tuotti enemmän bioöljyä, jopa 21,5 prosenttia (14 prosenttia pyrolyysissä). Samanlaisia tuloksia saatiin, kun verrattiin mikrolevien pyrolyysistä ja HTL:stä saatujen bioöljyjen saantoja .

Materiaalitaseen tietojen lisäksi tutkittiin hydrotermisen nesteytyksen jälkeen eri lämpötiloissa saadun orgaanisen hiilen kokonaismäärän (Total Organic Carbon, TOC) perusteella tapahtuvaa konversiota, ja tulokset on esitetty lisätiedostossa 7: taulukko S5. Syötteessä oli 46,9 % orgaanista hiiltä, mikä tarkoittaa 2,8 g orgaanista hiiltä hydrotermiseen nesteytykseen käytetyssä 6 g:n näytteessä. Orgaanisen hiilen konversio kasvoi 13,93 prosentista 48,93 prosenttiin lämpötilan noustessa 260 °C:sta 300 °C:een. Tulokset osoittivat, että alhaisemmassa lämpötilassa biomassan hajoaminen oli epätäydellistä ja jäljelle jäi suuri määrä reagoimatonta biomassaa, joka saattaa estää bioöljyn muodostumisen. Lämpötilan nostaminen pystyi nopeuttamaan raaka-aineen hajoamista ja edistämään bioöljyn muodostumista; lämpötilan jatkuva nostaminen, kokeissamme yli 280 °C:n, hajotti kuitenkin aiemmin muodostuneen bioöljyn/intermediaattien hajoamisen kaasuiksi ja vesiliukoisiksi tuotteiksi, mikä johti bioöljyn saannon vähenemiseen. Kiinteän jäännöksen (biohiilen) vähenevä saanto viittasi siihen, että biomassan kokonaiskonversio lisääntyi, kun lämpötilaa nostettiin 260 °C:sta 300 °C:een.

Fourier-muunnos-infrapunaspektroskopia bioöljystä

FT-IR-spektrit A. filiculoides-syötteen ja HTL:stä 260, 280 ja 300 °C:n lämpötiloissa saadun bioöljyn1 spektrianalyysit on esitetty kuvissa 5A ja B. Laaja kaista noin 3200-3405 cm-1:n kohdalla johtuu O-H- tai N-H-venytysvärähtelystä, joka aiheutuu vedestä tai bioöljyssä esiintyvistä O-H-ryhmistä tai N-H-ryhmistä (kuva 5B). Raaka-aineen leveä absorbanssi näkyi noin 3314 cm-1:n kohdalla, mikä viittasi korkeaan hiilihydraatti- ja proteiinipitoisuuteen (kuva 5A).

Bioöljyjen absorbanssi oli heikompi 3200-3405 cm-1:n kohdalla, mikä viittaa siihen, että sekä hiilihydraatit että valkuaisaineet hajosivat HTL-prosessissa (kuva 5B). Kaistat 2854-2950 cm-1 olivat kaikilla bioöljyillä voimakkaampia, mikä johtui C-H-venytysvärähtelystä, mikä viittaa alkyyli-C-H-ryhmien läsnäoloon. Bioöljyjen C=O-venytysvärähtely noin 1645-1720 cm-1 osoittaa ketoneja, aldehydejä, estereitä tai happoja. Taivutusvärähtelykaistat noin 1580-1650 cm-1 osoittavat amiinien N-H-ryhmiä. Kaistat alueella 1430-1480 cm-1 johtuivat bioöljyissä esiintyvistä α-CH2-taivutusvärähtelyistä. Bioöljyissä esiintyvät C-N-venytyskaistat alueella 1266-1342 cm-1 johtuvat aromaattisista amiiniryhmistä. Myös jotkin muut absorptiopiikit, jotka esiintyvät 780-850 cm-1:n kohdalla, johtuvat aromaattisten aineiden C-H-taivutusvärähtelyistä tasosta ulospäin. Kaista 1040 cm-1 esiintyi vain A. filiculoides -syötteen absorptioprofiilissa, ja se voi olla C-O, joka liittyy nesteytyksen jälkeen dehydratoituneisiin hydroksyyliryhmiin. Kaiken kaikkiaan HTL:stä eri lämpötiloissa saatujen bioöljy1-näytteiden spektreissä näkyy samoja piikkejä, mikä viittaa samojen funktionaalisten ryhmien läsnäoloon, ja ne olivat NMR-spektreissä saadut erilaiset piikit.

Bioöljyn NMR-analyysi

NMR-analyysi bioöljy1-näytteistä suoritettiin, jotta ymmärrettäisiin protonien kemiallisten ympäristöjen suhteet. NMR-spektrit antoivat FTIR-spektrejä täydentävää tietoa funktionaalisista ryhmistä sekä mahdollisuuden kvantifioida ja vertailla spektrien välisiä integraatioalueita. FT-IR:n tavoin 1H-NMR-spektrit osoittivat, että alifaattisten funktionaalisten ryhmien osuus oli suuri kaikissa bioöljyissä, ja kuvassa 6 esitetään yhteenveto eri funktionaalisten ryhmien luokkiin kuuluvista integroiduista piikkialueista. Spektrin korkein alue, 0,5-1,5 ppm, edustaa alifaattisia protoneja, jotka ovat kiinnittyneet hiiliatomiin vähintään kahden sidoksen päässä C=C- tai heteroatomista (O tai N). Seuraava kokonaisvaltainen alue 1,5-3,0 ppm edustaa alifaattisten hiiliatomien protoneja, jotka voivat olla sidoksissa C=C-kaksoissidokseen. Kaikissa bioöljyissä oli enemmän protoneja spektrialueella 0,5-3,0 ppm. Niissä oli enemmän (63,15-71,76 %) protoneja alueella 0,5-1,5 kuin alueella 1,5-3,0 (18,73-28,8 %), mikä johtuu mahdollisesti siitä, että tällä alueella resonoi suuri määrä typpi- ja happiyhdisteitä, joiden on osoitettu resonoivan ja jotka voivat olla peräisin raaka-aineen korkeasta proteiinipitoisuudesta.

1H-NMR-spektrin seuraava osa 3,0-4,5 ppm:n kohdalla edustaa metoksyyliprotoneita tai kahta aromaattista rengasta yhdistävää metyleeniryhmää; tällä alueella havaittiin hyvin alhaisia protoniprosentteja. Kaikissa bioöljyissä metoksi-/hiilihydraattifunktioiden osuus oli pieni (4,5-6,0 ppm). Tällä alueella bioöljyjen suurimmat protoniprosenttiarvot olivat 4,33 ja 4,32 prosenttia 260 ja 280 °C:n lämpötiloissa tapahtuvassa nesteytyksessä, ja selvästi alhaisempi arvo 0,94 prosenttia 300 °C:n lämpötilassa tapahtuvassa nesteytyksessä. Spektrin alue välillä 6,0-8,5 ppm vastaa aromaattista aluetta. Suurin protonipitoisuus tällä alueella, noin 7,2 %, saatiin 300 °C:ssa valmistetulle bioöljylle. Aromaattista/heteroaromaattista funktionaalisuutta havaittiin kaikissa bioöljyissä (6,0-8,5 ppm), mikä vastaa FT-IR-spektroskopian tuloksia. Alhaalla olevat spektrialueet (8,5-10 ppm) ovat peräisin aldehydeistä. Aldehydifunktio (9,5-10,0 ppm) puuttui kaikista bioöljyistä huolimatta FT-IR-spektrissä havaituista C=O-funktionaalisista ryhmistä (1645-1720 cm-1). Tällaisten FT-IR-kaistojen esiintyminen voi johtua myös muista karbonyyliä sisältävistä ryhmistä, kuten protonoiduista karboksyylihapoista, karboksyylihappoestereistä, amideista ja ketoneista.

Bioöljyn GC-MS-analyysi

GC-MS:ää käytettiin nestemäisen tuotteen koostumuksen tarkempaan selvittämiseen ja vahvistamaan FT-IR- ja NMR-analyyseistä saadut tulokset. GC-MS osoitti selvästi, että nesteytyslämpötila vaikutti bioöljyn komponentteihin1. Yhdisteiden pääpiikit tunnistettiin NIST:n massaspektritietokannan avulla. HTL-kokeiden tuloksena saatiin bioöljyjä, jotka syntyivät ligniinin, proteiinien, flavonoidien ja lipidien sekä erilaisten hiilihydraattiperäisten yhdisteiden hajoamisesta. Bioöljyjen komponentteina tunnistettiin mono- ja polysyklisiä aromaattisia yhdisteitä, ketoneja, aldehydejä, estereitä, alkoholeja, amideja ja muita typpeä sisältäviä yhdisteitä (mukaan lukien amidit ja N-heterosykliset yhdisteet) sekä hiilivetyjä. Puolikvantitatiivinen analyysi tehtiin laskemalla kromatografisten piikkien pinta-alan suhteellinen prosenttiosuus, ja tulokset esitetään taulukossa 3. Tärkeimmät yhdisteet, jotka havaittiin hydrotermisessä nesteytyksessä A. filiculoides olivat metyylipyratsiini, 2-metyyli-2-syklopenteni-1-oni, fenoli, 2-metoksifenoli, 3-pyridinoli, katekoli, l-proliini, N-butoksikarbonyyli-butyyliesteri, bis(2-etyyliheksyyli)ftalaatti ja beetasitosteroli. Kun hydrotermisen nesteytyksen lämpötila vaihteli 260-300 °C:n välillä, muodostui erilaisia yhdisteitä ja niiden osuudet vaihtelivat. Fenolisten yhdisteiden, kuten fenolin (6,1-18,8 pinta-alaprosenttia) ja katekolin (10,0-15,7 pinta-alaprosenttia), pinta-alaprosentti kasvoi lämpötilan noustessa 260 °C:sta 280 °C:een, mutta laski sitten 300 °C:n lämpötilassa 11,1 pinta-alaprosenttiin fenolin osalta ja 11,8 pinta-alaprosenttiin katekolin osalta. A. filiculoides -kasvin bioöljyn fenolit olivat todennäköisesti peräisin biomassan ligniini- tai hiilihydraattiosasta. Typpiyhdisteitä muodostuu proteiinien dekarboksylaatio-, deaminointi-, dehydraatio-, depolymerisaatio- ja hajoamisreaktioissa . Suurin 3-pyrindiolin pinta-alaprosentti (13,3 %) havaittiin alhaisimmassa lämpötilassa 260 °C, ja se laski 11,9 %:iin 280 °C:ssa ja 10,1 %:iin 300 °C:ssa. Lisäksi suurin pinta-ala noin (13,6, 12,4 ja 8,7 pinta-%) havaittiin 260, 280 ja 300 °C:ssa. Koska nestemäisen tuotteen koostumus on niin monimutkainen, lisäparannus, kuten denitrogenointi ja hapenpoisto, olisi tarpeen, jotta bioöljy soveltuisi moottoripolttoaineeksi.

HTL:stä saadusta bioöljystä saatujen molekyylien koostumusta verrattiin pyrolyysillä tuotetusta bioöljystä tunnistettuun molekyylien spektriin . Toisin kuin HTL, pyrolyysi on kuivan orgaanisen aineksen, jonka kosteuspitoisuus on alle 10 %, termokemiallinen hajoaminen ilman happea, ilmanpaineessa ja korkeammissa lämpötiloissa (350-550 °C) . Molemmat termokemialliset tekniikat osoittivat suurta potentiaalia koko Azolla-biomassan muuntamisessa bioöljyiksi, joiden energiatiheys on suurempi kuin alkuperäisen biomassan raaka-aineen. Molemmista termokemiallisista reaktioista saadut bioöljyt ovat koostumukseltaan hyvin monimutkaisia, mikä johtuu biomassan monomeerien depolymerisaatiosta ja hajoamisesta pilkkomalla, dehydraatiolla, dekarboksylaatiolla ja deaminaatiolla . Proteiiniperäisiä yhdisteitä edustivat fenolit, alkyylifenolit, pyrrolidinoni, indoli ja nitriili Azollassa esiintyvien aminohappojen tyrosiinin ja fenyylialaniinin hajoamisen tuloksena. Lipidiperäisiin tuotteisiin kuului useita pitkäketjuisia tyydyttyneitä alkaaneja ja rasvahappoja, joiden koko vaihteli C12:sta C21:een: dodekaani, tridekaani, tetradekaani, pentadekaani, heksadekaani, heptadekaani, oktadekaani, nonadekaani, eikosaani ja heneikosaani. Samanlainen pitkäketjuisten lipidiperäisten alkaanien pyrolyysibionestetuotteiden seos löytyi levistä . Suurin ero oli se, että A. filiculoidesin pyrolyysissä esiintyi fytolin, 3,7,11,15-tetrametyyli-2-heksadekeni-1-olin, asyklisen diterpeenialkoholin, kertymistä, sillä klorofyllin hajoamistuote oli runsain pyrolyysituote.

Biojäännöstuotteiden analyysi

Kuvassa 7 on esitetty Azolla-rehun ja biojäännöstuotteiden FT-IR-spektrit. Laajat kaistat kohdissa 3200-3405 cm-1 osoitetaan vetysidonnaisten O-H-ryhmien ja N-H-ryhmien venytysvärähtelyille, ja ne viittaavat polysakkaridien, hiilihydraattien ja proteiinien esiintymiseen Azolla-rehussa. Alkuperäisessä Azolla-rehussa on voimakkaita O-H- ja N-H-ryhmiä vastaavia venytysvärähtelypiikkejä, mutta niiden läpäisykyky vähenee biojäännöksessä. Huippu 1030 cm-1 hävisi biojäännöksessä. N-H-taivutusvärähtelyä vastaava piikki noin 1600-1620 cm-1 esiintyi Azollan rehussa ja Azollan biojäännöksessä. Jäämien spektreissä piikit välillä 2800-2930 cm-1 muuttuivat paljon heikommiksi kuin Azolla-raakaruokinnassa. Yhden piikin esiintyminen 1590 cm-1:n kohdalla, joka johtuu C=C-venytyksestä, viittaa aromaattisen biohiilen muodostumiseen .

A.filiculoides-syötteen ja biojäännösjäännöksen röntgendiffraktiospektrit (XRD) eri lämpötiloissa osoittivat, että jauheiden röntgendiffraktiogrammissa ei ollut merkittäviä eroja (lisätiedosto 8: kuva S3). Eri lämpötiloissa saadut biomassasyötteet ja -jäännökset olivat tyypillisesti amorfisia, mikä osoittaa, että jäännöksen hiilen rakenne on satunnaisesti ristisilloittuneita, voimakkaasti konjugoituneita aromaattisia levyjä. Azollan ja biojäännöksen pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvissa (SEM) näkyi morfologisia muutoksia (lisätiedosto 9: kuva S4). Kolmen Azollan biohiilen hydrotermisellä nesteytyksellä saadun biojäännöksen kuvat osoittivat, että jäännös oli luonteeltaan sienimäistä, eikä siinä ollut järjestäytynyttä huokoista rakennetta.

Vetytuotanto happokäsitellystä Azolla-biomassasta Enterobacter cloacae DT-1:n avulla

Lämpö-H2SO4-esikäsittelyssä A. filiculoides -biomassa hydrolysoitiin erilaisiksi liukoisiksi pelkistyneiksi sokereiksi, jotka koostuivat pääasiassa glukoosista (1,18 g/l), ksyloosista (1,39 g/l) ja arabinoosista (0,063 g/l). Happokäsiteltyä esihydrolysaattia käytettiin raaka-aineena Enterobacter cloacae (E. cloacae) -bakteerin (Enterobacter cloacae) vetytuotannossa eräajona alentuneessa osapaineessa pH2. pH2 vaikuttaa merkittävästi anaerobisten bakteerien fermentatiivisen vedyntuotannon vetysaantotehokkuuteen, koska vedyntuotantoreitit ovat herkkiä vedyn konsentraatiolle, mikä johtaa lopputuotteen estymiseen. On raportoitu, että korkea vedyn osapaine johtaa siihen, että asetaatin, butyraatin ja H2:n sijasta tuotetaan enemmän pelkistyneitä tuotteita, kuten etanolia ja laktaattia. Panosfermentori järjestettiin siten, että fermentorin päätilaan kohdistui painetta, jonka ansiosta biokaasu pääsi poistumaan päätilasta heti sen syntymisen jälkeen, jolloin kokonaisosapaine ja siten panosfermentorin vedyn osapaine pienenivät.

Fermentointi E. cloacae DT-1:llä johti 53 mmol/l vedyn tuotantoon (taulukko 4). Fermentatiivisen vedyntuotannon aikana fermentointiliemen lopullinen pH laski 7,5:stä 5,42:een, mikä voi johtua lyhytketjuisten orgaanisten rasvahappojen tuotannosta . Haihtuvien rasvahappojen kokonaistuotanto oli 1150 mg/l, joka koostui suurelta osin etikkahaposta (986 mg/l) ja voihaposta (161 mg/l), ja B/A-suhde oli 0,165. DT-1-kanta noudatti siis sekahapporeittiä ja hyödynsi tehokkaasti happokäsitellyn esihydrolysaatin C5-sokereita (ksyloosi, arabinoosi ja glukoosi). Vedyntuottotehokkuus oli 2,43 mol H2/mol pelkistävää sokeria. Koska pimeäkäymisreitin suurin teoreettinen vedyntuottotehokkuus on 4 mol H2/mol glukoosia, happokäsitellystä biomassan esihydrolysaatista saatiin noin 60 prosenttia suurimmasta mahdollisesta vedyntuotosta. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti vedyntuotannosta A. filiculoides -biomassan sokereista.

Vetytuotanto entsymaattisesti käsitellystä Azolla-biomassasta E. cloacae DT-1:n avulla

Happokäsitellyn A. filiculoides -biomassan entsymaattisesta hydrolyysistä vapautui glukoosia ja ksyloosia pitoisuuksina 1,49 ja 0,181 g/l. Entsymaattisesti hydrolysoiduista biomassan sokereista saatiin noin 34,8 mmol/l tilavuusvetytuotantoa (alennetussa pH2:ssa). Käymisliemen lopullinen pH laski 5:een vedyntuotannon aikana, minkä lisäksi tuotettiin etikkahappoa (990 mg/l) ja voihappoa (164 mg/l). VFA:n kokonaispitoisuus oli 1156 mg/l ja B/A-suhde 0,165 (taulukko 4). Nämä tulokset osoittavat, että käytettiin sekahappokäymisreittiä. Vedyntuottotehokkuus oli 2,04 mol H2/mol pelkistävää sokeria, joten se oli alhaisempi kuin happokäsitellystä esihydrolysaatista saatu hyötysuhde. Kaiken kaikkiaan DT-1-kannan vetysaantotehokkuus Azolla filiculoides -biomassasta oli 2,2 ± 2 mol/mol pelkistävää sokeria. Azollasta saatavan vedyn tuotannon hyötysuhde on samankaltainen kuin maanpäällisistä lignoselluloosapohjaisista raaka-aineista saatu hyötysuhde, joka kattaa vaihteluvälin 044-2,76 mol H2/mol sokereita (Lisätiedosto 1: Taulukko S1, Lisätiedosto 10: Taulukko S6).

Biomassan hiili-typpi-suhde (carbon-to-nitrogen, C/N-suhde) on tärkeä tehokkaan anaerobisen mädätyksen kannalta, koska mikro-organismit tarvitsevat optimaaliseen vedyntuotantoon huomattavasti enemmän C:tä kuin N:ää (C:n suhde C:N:hen 25:1). Tästä syystä mikrolevien käyttö vedyntuotantoon on rajallista, koska ne sisältävät runsaasti proteiineja ja niiden C/N-suhde on alhainen (keskimäärin 4). Yhteiskäyminen makrolevien (kuten Laminaria digitata) kanssa, jotka sisältävät runsaasti hiilihydraatteja ja joiden C/N-suhde on korkea, parantaa vedyntuotantoa. A. filiculoides sisältää 41 % kokonaishiilihydraatteja ja 20 % proteiineja, minkä seurauksena biomassan proksimaalinen analyysi osoitti C/N-suhteen olevan 15 (lisätiedosto 6: taulukko S4), mikä on lähellä tehokasta raaka-ainetta biovetytuotantoon.

Etanolin tuotanto Azolla filiculoidesista ja A. pinnatasta

A. filiculoides- ja A. pinnata -biomassojen kemiallinen analyysi on esitetty lisätiedostossa 3: taulukko S2. A. filiculoidesissa oli runsaasti biomolekyylejä, joita voidaan käyttää raaka-aineena bioetanolin tuotannossa: tärkkelystä (6,05 %), selluloosaa (21,8 %) ja hemiselluloosaa (13,5 %). Sen ligniinipitoisuus on 10,3 prosenttia, mikä on enemmän kuin sorsalemmikissä ja muissa vesikasveissa mutta vähemmän kuin tärkeimmissä lignoselluloosapohjaisissa bioenergiakasveissa (lisätiedosto 1: taulukko S1). A. pinnatan kemiallinen analyysi osoitti, että bioetanolia tuottavien molekyylien – tärkkelyksen (4,7 %), selluloosan (12,8 %) ja hemiselluloosan (10,1 %) – pitoisuudet olivat alhaisemmat ja ligniinipitoisuus korkeampi (jopa 13,2 %).

A. filiculoidesin ja A. pinnatan tärkkelyskomponentti hydrolysoitiin entsymaattisesti α-amylaasilla ja α-amyloglukosidaasilla ja selluloosa/hemiselluloosa-komponentti hydrolysoitiin sellulaasilla ja sellobiaasilla. Vapautuneen glukoosin määrät on esitetty taulukossa 5. Odotetusti A. filiculoides -biomassaa hydrolysoimalla neljän entsyymin yhdistelmä tuotti suuremman määrän glukoosia kuin A. pinnata -biomassaa hydrolysoimalla (jopa 65,9 ja 29,5 g/l). Tämä glukoosin tuotto oli paljon suurempi kuin sen jälkeen, kun A. filiculoides -biomassaa oli käsitelty perunadekstroosiliemessä kasvaneen elävän Aspergillus niger -bakteerin suspensiolla (2,5 g/l glukoosia), kuten Pandey et al. osoittivat .

Redusoitujen sokereiden fermentoinnin jälkeen Saccharomyces cerevisiae -bakteerilla etanolin saanto, YE/G (etanoli/glukoosi, g/g), kuvastaa näytteistä vapautuneen glukoosin määrää; A. filiculoidesin saanto oli 0,56 g/g ja A. pinnatan 0,28 g/g. Saanto 0,56 g/g on vertailukelpoinen ankkalehtihydrolysaattien ja joidenkin energiakasvien fermentoinnista raportoitujen saantojen kanssa (lisätiedosto 1: taulukko S1). Mielenkiintoista on, että käymisen täydentäminen lisäravinteilla ei lisännyt etanolin saantoa merkittävästi (ei esitetty). Tämä voidaan selittää sillä, että molempien Azolla-lajien biomassassa on hiivan kasvun kannalta keskeisiä ravintoaineita.

A. filiculoides -biomassaan perustuva etanolin tuotto (YE/B) määritettiin 0,09 g/g, mikä on samankaltainen kuin S. cerevisiae ATCC 24859:n tuotto, joka saatiin sorsalemmikkikasvilla L. minor kasvatetusta S. cerevisiae ATCC 24859:stä, joka sisälsi keskimäärin 10 % tärkkelystä. Suurempi etanolin tuotto, 0,19 g/g, havaittiin Lemna aequinoctialis 6000 -kannalla, jolla on nopea kasvuvauhti ja kyky kerätä suuria määriä tärkkelystä (jopa 39 %). Toisen ankkalehden edustajan, Spirodela polyrrhiza, kyky lisätä tärkkelyspitoisuuttaan stressiolosuhteissa jopa 45,7 prosenttiin yhdessä α-amylaasilla, pullulanaasilla ja α-amyloglukosidaasilla tapahtuvan entsymaattisen hydrolyysin kanssa johti siihen, että tärkkelyspitoisuuden YE/B oli 0,28 g/g . Soluseinien kemiallinen koostumus ja vähäisempi tärkkelyksen kertyminen olivat todennäköinen syy A. pinnata -biomassan alhaisempaan etanolisatoon (YE/B = 0,05 g/g). Seuraavana askeleena Azolla-biomassasta saatavan etanolin saannon optimoinnissa on sellaisten erilaisten hiivakantojen käyttö, jotka pystyvät paremmin fermentoimaan vapautuvien sokereiden spektriä ja ovat sietokykyisempiä mahdollisille inhibiittoreille.

Azolla universaalina raaka-aineena biopolttoaineiden tuotantoa varten

Systemaattinen analyysi maakasveista niiden potentiaalin selvittämiseksi, jotta ne voisivat soveltua ihanteellisiksi bioenergiakasveiksi, johti useisiin tärkeisiin valintakriteereihin, joita ovat: (1) kemiallinen koostumus ja suuri osuus biopolttoainetta tuottavia molekyylejä; (2) korkea kasvuvauhti/biomassan tuotanto; (3) korkea satoindeksi/kiertoaika; (4) kyky kasvaa marginaalimailla ja kilpailun puuttuminen peltokasvien kanssa peltoalasta; (5) korkea makeanveden käyttötehokkuus ja alhaiset kasvukustannukset; (6) alhaiset sadonkorjuukustannukset ja (7) arvokkaiden rinnakkaistuotteiden tuotanto. Nämä kriteerit ovat saaneet aikaan intensiivisen etsinnän seuraavan sukupolven energiakasvien kesyttämiseksi.

Azollalajit yhdessä niiden kehittyneen syanobakteerisymbiontin, A. azollae, kanssa ovat herättäneet huomiota, koska ne voivat täyttää kaikki edellä mainitut kriteerit. Ensinnäkin atsollan biomassa sisältää tärkeimpiä energiamolekyylejä, joita ovat selluloosa/hemiselluloosa, tärkkelys ja lipidit, jotka muistuttavat lignoselluloosa-, tärkkelys- ja öljytuotantoisten maaeläinten bioenergiakasvien ja mikrolevien/syanobakteerien yhdistelmiä. Toiseksi, koska ne kaksinkertaistavat biomassansa 5-6 päivän välein ja niiden vuotuinen tuottavuus on korkea, ne ovat yksi nopeimmin kasvavista kasveista, ja ne ovat biomassan tuotantonopeudeltaan toisena mikrolevien jälkeen. Mikrolevien tavoin niiden biomassatuotanto ei ole kausittaista. Kolmanneksi Azollaa voidaan kasvattaa tehokkaasti niiden luonnollisen elinympäristön ulkopuolella käyttämällä jätevesiä niiden pääasiallisena ravinnelähteenä. Jätevesien biopuhdistaminen voi johtaa jopa 2,6 t/ha ja 0,434 t/ha-vuosi kokonaistypen ja -fosforin imeytymiseen. Azolla voi myös kasvaa tehokkaasti typpipulassa olevissa kasvualustoissa ja ottaa ilmakehästä typpeä jopa 0,4 t/ha-vuosi symbioosissa A. azollae -kasvintuhoojan kanssa. Neljänneksi ne on helppo korjata. Azolla-lajeja on käytetty vuosikymmeniä typpipitoisena biolannoitteena sekä karjan- ja kalanrehuna (niiden korkean proteiini- ja hiilihydraattipitoisuuden vuoksi). Koska Azollan viljelyyn ei tarvita synteettisiä typpipohjaisia lannoitteita, sillä on huomattava myönteinen vaikutus typpioksiduulien (N2O) syntymisen vähentämiseen, sillä typpioksiduulien vaikutus ilmakehän lämpenemiseen on lähes 300-kertainen hiilidioksidiin verrattuna.

Termokemialliset teknologiat

Azolla-biomassaa käytettiin raaka-aineena bioöljyn, biohiilen ja biokaasun tuotannossa kahdella termokemiallisella teknologialla, pyrolyysillä ja HTL:llä (tämä työ). Kun otetaan huomioon Azollan korkea vuotuinen tuottavuus, tämä johtaa siihen, että pyrolyysi- ja HTL-pohjaisten bioöljyjen teoreettiseksi tuotannoksi arvioidaan 13,2 ja 20,2 tonnia hehtaarilta vuodessa. Molemmat bioöljyt sisältävät erilaisia petrokemikaaleja, joita voidaan käyttää suoraan biodieselin glyseriinittöminä komponentteina tai jalostaa biopolttoaineiksi joidenkin vakiintuneiden teknologioiden avulla. Molemmilla termokemiallisilla teknologioilla voidaan myös tuottaa biokiintoaineita, kuten biohiiltä ja -tuhkaa (molemmilla jopa 48 t/ha-vuosi), joita voidaan käyttää maaperän laadun parantamiseen lisäämällä sen ravinteiden ja kosteuden pidätyskykyä, tukemalla mikrobiyhteisöjä ja edistämällä juurten toimintaa . Azollan tuhka sisältää alkalielementtejä (Li, Na, K, Mg, Ca) sekä mikroelementtejä, kuten Fe:tä, Mn:tä ja Cu:ta, mikä tekee siitä hyvän ehdokkaan käytettäväksi lannoitteena.

Biodieselin tuotanto

Jätevesillä kasvavasta A. filiculoidesista saatavien raakalipidien vuotuiseksi teoreettiseksi saannoksi voidaan arvioida 1,68 t/ha-vuosi. Tämä määrä voidaan nostaa 8 t/ha-vuoteen, jos kasvi kasvaa luonnollisissa olosuhteissa tuottavuuden ollessa noin 100 t dw/ha-vuosi. Tämä öljyn tuottavuus on huomattavasti korkeampi kuin soijapavun (0,44 t/ha-vuosi), auringonkukan (0,78 t/ha-vuosi), rypsin (1,17 t/ha-vuosi) ja öljypalmun (6,0 t/ha-vuosi) tuottavuus, mutta alhaisempi kuin mikrolevistä saatava teoreettinen tuotto (Nannochloropsis sp. -lajin osalta jopa 73 t/ha-vuosi). Koska Azolla/A. azollae sisältää erilaisia C16:0-, C18:2- ja C18:3-rasvahappoja, niiden muuntaminen metyyliestereiksi tarkoittaa, että saatu biodiesel täyttää polttoainetiheyttä, setaanilukua ja jodilukua koskevat ratkaisevan tärkeät vaatimukset, jotka on asetettu biodieselille standardissa EN14214 .

Etanolituotanto

Teoreettinen etanolituotanto A. filiculoidesista on 9,3 t/ha-vuosi (11,7 × 103 L/ha-vuosi, perustuen etanolin ominaistilavuuteen = 0,789 g/mL), mikä on alhaisempi kuin sokeriruo’osta saatavan etanolin tuotanto (25 × 103 L/ha-vuosi), mutta lähellä maissin tähteestä saatavaa etanolia (13.31 × 103 L/ha-vuosi), mutta korkeampi kuin miscanthuksesta (2,3 × 103 L/ha-vuosi), pajusta (0,3 × 103 L/ha-vuosi) ja poppelista (1,3 × 103 L/ha-vuosi) (Lisätiedosto 1: Taulukko S1) (Lisätiedosto 1: Taulukko S1).

Biovetytuotanto

Korkea biomassan tuotantotuotos, korkea biomassatuotos, kemiallinen koostumus (C/N-suhdeluku) ja korkea biovetyn tuotto, joka on peräisin biomassan tuotantotuotoksesta, joka on noin 2,2 × 103 L/ha-vuosi.2 mol/mol substraattia tekevät Azollasta kilpailukykyisen raaka-aineen vedyntuotantoon verrattuna muihin bioenergiakasveihin (lisätiedosto 1: taulukko S1, lisätiedosto 10: taulukko S6).