Cellakultúra
A humán embrionális vese 293FT (HEK293) sejteket 10% FBS és 1% penicillin/streptomicin (100 iU/ml; 100 μg/ml) tartalmú DMEM-ben tenyésztették. A sejtvonalakat nem hitelesítették. A sejtek mikoplazmától mentesek voltak. A sejteket 5% szén-dioxiddal nedvesített légkörben, 37 °C-on inkubáltuk. Stabil sejtvonalak esetében a transzfektált sejteket puromicin (3 μg per ml) jelenlétében szelektáltuk. A tranziens transzfekciós vizsgálatokhoz a HEK293 sejteket 6 lyukú lemezekbe vetettük a vektorok jelenlétében Lipofectamin2000 (ThermoFisher) segítségével. A podocita sejtvonalakat humán vizeletből42 hoztuk létre, és az APOL1 genotipizálását a NIDDK Institutional Review Board által előzetesen jóváhagyott kutatási protokollok (94-DK-0127, 94-DK-0133) alapján, tájékozott beleegyezést követően végeztük el. Az A eset G0/G0 férfi FSGS-szel, a B eset G0/G0 férfi HIV-asszociált FSGS-szel, a C eset G0/G0 férfi FSGS-szel (HP55-345O-1), a D eset G1/G2 férfi FSGS-szel, az E eset pedig G1/G2 férfi HIV-asszociált FSGS-szel. A sejteket 10% FBS-szel, ITS-szel és 1% penicillinnel/streptomicinnel (100 iU/ml; 100 μg/ml) kiegészített RPMI1640-ben tenyésztettük. A sejteket 5% CO2-t tartalmazó, párásított atmoszférában, 33 °C-on inkubáltuk, és 37 °C-on 7-10 napig differenciáltuk. A sejtvonalakat nem hitelesítették. A sejtek mikoplazmától mentesek voltak. A sejtlizátumok gyűjtése előtt a sejteket 24-72 órán keresztül 103 U/ml IFNα-val (Abcam) és 30 percig 100 mM calyculin A-val (LC Laboratories) kezeltük. A PKR-gátlási kísérletekhez a sejteket 1 μM imidazolo-oxindol PKR-gátló C16 (Sigma Aldrich) 1 órán keresztül kezeltük43.
Humán szövet
Deidentifikált emberi vese biopsziás szöveteket Dr. Preeti Chandra-tól, a Marylandi Egyetemről kaptuk. A kutatást a Marylandi Egyetem és a NIDDK, NIH intézményi felülvizsgálati bizottságai előzetesen jóváhagyták.
Plazmid információk
Az APOL1 G0 expressziós vektor CMV promóterből származó humán APOL1 cDNS-ből áll (NM_001136540: 298-1453). Az APOL1 G1 (rs73885319 A→G és/vagy rs60910145 T→G) és G2 (rs71785313 del) előállításához hely-irányított mutagenezist végeztünk. Az APOL1 expressziós vektor esetében a fehérje expressziójának hiányát a 138. kodon után stop kodon és frameshift szekvencia (TAATAGATGA) beillesztésével állítottuk elő. A másodlagos szerkezetmutációs vektor esetében az eredeti szekvenciákat nyolc szinonim változással módosítottuk (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G és 1242T→C). A stabil dsRNS G0 vektor esetében az eredeti szekvenciákat 5 mutációval módosítottuk a 3′ UTR-ben (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Az APOL1 allélok (NM_001136540.1, 1031-1453) körüli flanking RNS-hez háttérvektorként a pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) vektort használtuk. A vektortérképek sémái az 1. kiegészítő ábrán találhatók.
Immunoblotting
A sejteket proteáz inhibitor/foszfatáz inhibitor koktélt tartalmazó RIPA pufferben lizáltuk. A lizátumokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, a fehérjéket western blottingnak vetettük alá és 30 percig Odyssey blokkoló pufferben (LI-COR) blokkoltuk. A blotokat az APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), foszfo-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-aktin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), foszfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728) elleni primer antitestekkel inkubáltuk. sc-101784), PKR (abcam ab45427), foszfo-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), foszfo-GCN (Abcam ab75836) és GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) és p62 (Cell signaling #5114). A foltokat festékkel jelölt antinyúl antitesttel (LI-COR) inkubáltuk. Minden blotot Odyssey infravörös szkennerrel (LI-COR) képeztünk le. A nyers gélképek a 13. kiegészítő ábrán láthatók.
Reverse transzkriptáz PCR és kvantitatív valós idejű PCR
A sejteket vagy a teljes vesét TRIzol reagenssel szedtük le és teljes RNS-t izoláltunk. A teljes RNS-t DNázzal kezeltük a cDNS oligo(dT)-vel történő szintézise előtt. Az RNS egy 5 μg-os aliquotját használtuk fel a Superscript II reverz transzkriptázzal végzett cDNS-szintézishez. A mintákat PCR (RT) vagy kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR) segítségével elemeztük Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher) segítségével. A relatív expressziót minden egyes mintában arányként számoltuk ki (attamolspecifikus gén per β-aktin). A primerpárokat az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Proteinszintézis vizsgálat
Transzfektált HEK293 sejteket vagy humán podocita sejtvonalakat 96 lyukú lemezekben tenyésztettünk, és 103 U/ml IFNα-val (Abcam) kezeltük a számszerűsítéshez vagy kamrás diaplasztikával a vizualizációhoz. A szintézis-tesztet (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, katalógusszám. C10289, Invitrogen) a gyártó utasítása szerint végeztük. A nukleáris ellenfestést Hoechst-tel végeztük. Az 1 μM puromicinnel (InvivoGen, San Diego, CA) kezelt vektor nélküli HEK293 sejteket negatív kontrollként használtuk ehhez a vizsgálathoz, a háttér 0%-os jelintenzitással. Az APOL1 G0 vektorral rendelkező HEK293 sejteket 100%-os jelintenzitásra állítottuk be.
Cellák életképessége
A sejtek életképességét ATP-próbák segítségével vizsgáltuk. A metabolikusan aktív sejtek által termelt ATP mennyiségi meghatározásához CellTiter-Glo lumineszcens sejtéletképességi próbát (Promega) használtunk a gyártó utasításai szerint. A sejteket steril 96 lyukú lemezekben 103 U/ml IFNα (Abcam) jelenlétében 72 órán keresztül tenyésztettük, majd 100 μL CellTiter-Glo reagenssel lúgosítottuk a sejteket. Szobahőmérsékleten történő 10 perces inkubációt követően a lumineszcenciát lyukanként 1 s integrációs idővel rendelkező luminométerrel detektáltuk. A sejtek lumineszcenciajeleit a sejtszámmal normalizáltuk.
Cellproliferáció sebességének vizsgálata
A 96 lyukú lemez minden egyes lyukába 5,0 × 103 sejtet vetettünk 150 µl táptalajonként, majd a C16 PKR-inhibitort adtuk hozzá a jelzett koncentrációban. A 0, 24, 48, 50 µL után a sejtek számát a Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich) segítségével mértük.
Az oxigénfogyasztás mértéke tenyésztett humán podocitákban
A sejtek oxigénfogyasztásának (OCR) értékelésére az XF24 extracelluláris fluxusanalizátort (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) használtuk a cég utasításai szerint. Röviden, a tenyésztett humán podocitákat a Seahorse Bioscience-től vásárolt XF24 lyuklemezekbe ültettük, lyukanként 2,0 × 104 sejt sűrűséggel (0,33 cm2 felület) 100 μL táptalajban, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. A következő napon a sejteket 72 órán keresztül IFNα-val (1 × 103 U/ml) kezeltük a C16 PKR-inhibitorral (100 nM) és anélkül (100 nM), majd 24 órás kezelés következett az XF24 lyukú lemezeken. Az OCR mérések előtt a sejteket tartalmazó kísérleti XF24 lemezeket 25 mM glükózt és 1 mM nátrium-piruvátot tartalmazó bikarbonátmentes DMEM assay médiummal (Seahorse Bioscience) mostuk, és a sejteket 1 órán át előinkubáltuk 37 °C-on CO2-ellátás nélkül 625 μL assay médiumban. Az OCR-mérések előtt az XF24 készüléket kalibráltuk egy kalibráló patron segítségével a cég utasításai szerint. A kalibrálás után 4 percig alapszintű OCR-méréseket végeztünk a tesztlemezben.
RNS-immunoprecipitáció (RNS-IP)
Az APOL1-G0, G1 vagy G2 variánst hordozó stabil HEK293 sejteket a következő mock-kezeléssel kezeltük: (a) 103 U per ml IFNα 24-72 órán keresztül és 100 μM palmitinsavval (Sigma) 2 órán keresztül, vagy b) 100 mM 103 U per ml IFNα 24-72 órán keresztül és kalikulin-A-val 30 percig. A palmitinsav közvetlenül kötődik a PKR-hez és gátolja a PKR44-hez való dsRNS-kötődést, ezért a palmitinsavat negatív kontrollként használtuk. A sejteket 200 mJ/cm2 UV-fénnyel sugároztuk be. Minden sejtlizátum tíz százalékát elmentettük, hogy bemeneti mintaként szolgáljon az RT-qPCR-hez. Az immunprecipitációt RNS-kötő fehérje immunprecipitációs kit (EMD Millipore) segítségével végeztük a PKR45-öt használó korábbi jelentés alapján. Az RNS-IP-hez foszfo-PKR antitestet (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) vagy kontroll nyúl IgG-t használtunk. Az RNS-t TRIzollal extraháltuk, majd DNáz-kezelés és etanolos kicsapás következett. cDNS-eket generáltunk random hexamer primerek és SuperScript Reverse transcriptase II segítségével. A mintákat PCR (RT) vagy qRT-PCR segítségével elemeztük Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher) használatával. A feldúsulást arányként számoltuk ki (IP minta per bemeneti minta). A primerpárokat az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A negatív kontrollokban, a mock-kezelt sejtekben foszfo-PKR ellenanyag IP-vel és az interferon-α + calyculin A-val kezelt sejtekben kontroll nyúl IgG IP-vel
PKR fehérje expresszió és tisztítás
A PKR rekombináns PKR-t a korábban közöltek szerint tisztítottuk46. A PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) transzformációt BL21(DE3) Rosetta sejtekben (Novagen) végeztük. A sejteket LB tápfolyadékban 37 °C-on növesztettük, amíg az A600 nm ~ 0,7 nem lett, majd a fehérje expresszióját 1 mM IPTG-vel indukáltuk 3 órán keresztül ~20 °C-on. A PKR tisztításához a sejteket A pufferben (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% glicerin), proteáz inhibitor koktéllal (Sigma) kiegészítve reszuszpendáltuk. A sejteket 5 mg/ml lizozimmal történő 30 perces inkubálással, majd 3 perces szonikálással lizáltuk. A lizátumot 20 percig 20 000 g-n centrifugáltuk. A felülúszót egy A pufferben kiegyenlített heparin Sepharose oszlopra (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) vittük, és a PKR-t NaCl gradiens segítségével eluáltuk. A csúcsfrakciókat kétszeresére hígítottuk A pufferrel, és egy A pufferben egyensúlyba hozott poli(I:C) agaróz oszlopra (Amersham) vittük fel. A PKR-t 1,1 M NaCl-mal eluáltuk, ~10 mg/ml-re koncentráltuk és -80 °C-on tároltuk.
PKR aktivációs vizsgálat
A PKR aktivációs vizsgálatokat a korábban ismertetett módon végeztük47. A PKR-t λ-foszforiláltuk λ-fehérje-foszfatázzal 1 órán keresztül 30 °C-on, majd 2 mM nátrium-ortovanadáttal gátoltuk. A PKR-t (4 μM) hosszú RNS-szel (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng per ml)/rövid RNS-szel (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng per ml)/poli(I:C) 20 μg per ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT és 100 μM ATP (Ambion). A reakcióelegyeket 30 °C-on inkubáltuk a megadott ideig, majd 1× SDS töltőpufferrel oltottuk. A foszforilált PKR-eket foszfo-PKR antitesttel (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) detektáltuk.
RNS előkészítés a gélmigrációs kísérletekhez és a SHAPE
A különböző 3′ szerkezetű kazettákkal rendelkező trunkált APOL1 RNS-eket a MegaShortScript kit (ThermoFisher) segítségével in vitro transzkripcióval készítettük a gyártó ajánlásainak megfelelően. Az APOL1 allélokat (G0, G1, G2) vagy azok mutáns változatait (mG0, mG1, mG2) tartalmazó plazmidokból két szeminesztált PCR-reakcióban hoztunk létre transzkripciós templátokat. Az első reakcióban a csonka APOL1 szekvenciákhoz egy 5′ T7 promótert és egy 45 nt 3′ SC-t adtunk hozzá (1. kiegészítő táblázat). Az utóbbi elemet azért vezettük be, hogy a SHAPE számára egy reverz transzkripciós hibridizációs helyet biztosítsunk. Minden reakció egy részét újraamplikáltuk az eredeti forward primer és egy rövidebb reverz primer felhasználásával, hogy a végső transzkripciós sablonok homogénebbek legyenek. Az átírási reakciókat Turbo DNase I-vel kezeltük 5 percig 37 °C-on, majd 2 percig 85 °C-on inkubáltuk és denaturáló gélen (5% poliakrilamid-19:1, 1× TBE, 7 M karbamid), állandó hőmérsékleten (45 °C, max. 30 W) frakcionáltuk. A kívánt RNS-termékeket UV-árnyékolással detektáltuk, kivágtuk a gélből, 200 V-on 2 órán át 4 °C-on elektrolitáltuk, etanollal kicsaptuk, és felhasználás előtt -20 °C-on 10 mM Trisben, pH 7,0-ban tároltuk. Az RNS törzsoldatokat spektrofotometriával számszerűsítettük.
Gélmigrációs vizsgálat
Minden csonka APOL1 RNS-t 1 μM-ra hígítottunk 20 μL RNS renaturációs pufferben (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerin (w per v)), 2 percig 85 °C-ra történő melegítéssel denaturáltuk, majd lassú hűtéssel (0,1 °C per s) 25 °C-ra renaturáltuk. Ezután MgCl2-t adtunk 0, 1 vagy 3 mM végső koncentrációban, és az elegyeket további 30 percig inkubáltuk 37 °C-on, hogy elősegítsük az Mg-függő és/vagy más tercier RNS kölcsönhatások kialakulását. Az RNS-konformereket 4 °C-ra történő gyorshűtéssel stabilizáltuk, majd 5%-os nem denaturáló poliakrilamid gélen (5% akrilamid, 19:1) 16-18 órán keresztül 4 °C-on frakcionáltuk őket. Mind a gél, mind a futópuffer 1× TBE-t és 1 mM MgCl2-t tartalmazott, és a géleket a betöltés előtt ~1 órán át előfuttattuk. A géleket a gyártó utasításainak megfelelően SybrGreen festékkel (ThermoFisher) exponáltuk, és az RNS-konformerek migrációs pozícióit Typhoon Trio+ variable mode imager (GE Healthcare) segítségével detektáltuk.
SHAPE és RNS-szekunder szerkezeti modellek generálása
SHAPE kísérleti módszereket korábban már leírtuk48,49. Röviden, a csonka APOL1 RNS-t SC RNS-szel hajtogattuk, mint a gélmigrációs vizsgálatban, kivéve, hogy a keverék térfogata 150 μL volt, a végső MgCl2-koncentráció 1 mM volt, és a glicerint kizártuk. Az RNS-oldatokat kontroll (1M7-) és kísérleti (1M7+) aliquotokra osztottuk (egyenként 72 μL), és 8 μL DMSO-t, illetve 8 μL 30 mM 1M7-et adtunk DMSO-ban. A módosítási reakciókat 37 °C-on inkubáltuk 5 percig, majd 4 °C-ra hűtöttük, etanollal kicsaptuk és 10 μL nukleázmentes vízben újra szuszpendáltuk. A kezelt RNS-eket a 3′ szerkezetű kazettához komplementer, különbözőképpen jelölt primerekből (1M7- primer, Cy5,5; 1M7+ primer, Cy5) reverz transzkripciót végeztünk, majd lúgos kezeléssel hidrolizáltuk. Az így kapott cDNS-könyvtárakat etanollal kicsaptuk és újra feloldottuk Sample Loading Solutionban (Genome Lab), majd WellRED D2 (Beckman Coulter) és IRDye 800RS (LI-COR) címkével jelölt ddA és ddG szekvenálási létrákkal összevontuk. Az egyesített mintákat kapilláris elektroforézissel (CE) frakcionáltuk Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer segítségével. Minden egyes RNS esetében a CE-elektroferogramokból SHAPEfinder szoftver50 segítségével reaktivitási profilokat hoztunk létre, majd az RNS-szekvenciákkal együtt az RNAstructure szoftver 5.751,52 verziójába vittük be a másodlagos szerkezeti modellek létrehozásához. Az alapértelmezett meredekség (1,8 kcal/mol) és metszéspont (-0,6 kcal/mol) paramétereket használtuk a reaktivitási értékek pszeudoenergia-kényszerekké való átalakításához, amelyek az RNS-összehajtási algoritmust módosítják. Az RNAstructure automatikusan több olyan szerkezeti modellt generál, amelyek a legjobban megfelelnek a SHAPE által levezetett reaktivitási profiloknak, és a Gibbs-féle szabad energia alapján rangsorolja őket. Az így előállított legalacsonyabb energiájú szerkezeti modelleket a 3a, b. ábra és a 4. kiegészítő ábra szemlélteti.
In vitro knock down
Humán vizeletből létrehozott, feltételesen immortalizált humán sejtvonalakkal42 végeztünk knock down kísérleteket. Ezeket a sejteket vagy Stealth RNAi Negative Control Med GC-vel (ThermoFisher) vagy előre megtervezett APOL1 elleni stealth siRNS-sel (HSS112492, ThermoFisher) transzfektáltuk Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher) segítségével. A BLOCK-iT™ Alexa fluorvörös fluoreszcens oligót együtt transzfektáltuk és transzfekciós kontrollként használtuk. A knock down hatékonysága 52,4-75,4% (RNS-szint) vagy 31,1% (fehérjeszint) volt.
Egerek
A humán APOL1 génlokusz transzgenikus egereket (BAC-APOL1 egerek) használtunk, amelyeket az APLOL-G0, vagy APOL1-G1, vagy APOL1-G2 lokuszt tartalmazó bakteriális mesterséges kromoszómával hoztunk létre. A humán BAC-klónból (ENST00000397278, amely megfelel az NM_003661-nek) izolálták és szubklónozták a ~47 kb humán DNS-t, amely csak az APOL1 gént foglalja magában az 5′ és 3′ flankáló régiókkal (beleértve az APOL2 1. és 2. exonját és a MYH9 gén egy részének 39-41. exonját tartalmazó 3′ régiót). Az egyes G0, G1 és G2 BAC szubklónokat 129SvJ/B6N F1 embriókba injektáltuk, majd az alapozókat 129SvJ-be visszakereszteztük. A szubklónt szekvenáltuk, hogy biztosítsuk, hogy az NCBI és az Ensembl referencia genomszekvenciája. Az egyetlen különbség az intronikus régiókban lévő polimorfizmusok voltak. A feltételes transzgenikus egérkísérletekben FVB hátterű podocita-specifikus APOL1 csonka RNS transzgenikus egereket használtunk. Ezeket az egereket feltételes transzgenikus rendszerrel állítottuk elő, nephrin (NPHS1) promóter által vezérelt csonka RNS-szekvenciát (NM_001136540, 1031-1453) használva. Két törzset hoztunk létre: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNS-t rs73885319 A és rs60910145 G-vel és NPHS1-APOL1-G1-delta-RNS-t rs73885319 G és rs60910145 G-vel.
Glomerulusok izolálása
BAC/APOL1 egereket (8 és 12 hetesek között) a szövetmintavétel előtt 3 napig naponta IFNγ-t (106 U/testsúlykilogramm IP) adtunk. A glomeruláris izolációs protokollról részletesen beszámoltunk53. Röviden, az egereket Avertin (2,2,2,2-tribrometil és tercier amilalkohol; 17 μL/g) intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük, és 8 × 107 Dynabeads (M450 toszilaktivált: Dynal #140.04) 20 ml foszfát-pufferelt sóoldatban hígítva perfundáltuk a szíven keresztül. A veséket kollagenáz A-val és DNáz I-vel emésztettük 37 °C-on 10 percig. A kollagenázzal emésztett szövetet óvatosan átpréseltük egy 100 μm-es sejtszűrőn, és HBSS-szel mostuk. A mintákat mágneses állvány segítségével mostuk és reszuszpendáltuk. A glomerulusokat összegyűjtöttük és 10% FBS-szel, ITS-szel, 1% penicillinnel/streptomicinnel (100 iU/ml; 100 μg/ml) és 100 mM kalikulin A-val (LC Laboratories) kiegészített RPMI1640-ben inkubáltuk 30 percig, majd Western blot analízishez használtuk.
Immunohisztokémia (egérminták)
BAC/APOL1 egereknek (8 és 12 hetesek) naponta IFNγ-t (106 U testtömeg-kilogrammonként IP) adtunk 3 napon keresztül. Az egereket 100 mM calyculin A-t tartalmazó PBS-szel perfundáltuk a szövetmintavétel előtt. Ezután a veséket kis darabokra vágtuk, és 10% FBS-szel, ITS-szel és 100 mM kalikulin A-val kiegészített RPMI1640-ben inkubáltuk 30 percig. Ezután a szöveteket azonnal 10%-os pufferelt formalinban rögzítettük. BAC/APOL1 egereknek (8 és 12 hetesek) naponta IFNγ-t (106 U/testsúlykilogrammonként IP) adtunk 3 napon keresztül. Az NPHS1-APOL1-ΔRNS egereknek a szövetmintavétel előtt 3 napig naponta IFNγ-t (106 U testtömeg-kilogrammonként IP) adtunk. Paraffinban rögzített 4-5 μm-es szövetmetszeteket használtunk. A metszeteket deparaffinizáltuk/rehidratáltuk, az antigén-visszanyerést citrát-pufferelt közegben 5 percig mikrohullámú sütőben történő melegítéssel végeztük. A szöveteket 1%-os BSA-val és 0,1%-os szaponinnal blokkoltuk. A metszeteket a következő primer antitestekkel inkubáltuk: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), foszfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), foszfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) és podocalyxin (R&D Systems AF1556). Az immunfluoreszcenciához Alexa Fluor másodlagos antitesteket (ThermoFisher) használtunk, és konfokális mikroszkópiával vizualizáltunk. Az ABC festéshez biotin konjugált másodlagos ellenanyagot és Avidin-HRP-t (Vector) használtunk. A vizualizációhoz DAB kitet (Vector) használtunk. Az egérkísérletekben az egereket (8 és 12 hetesek között) IFNγ-vel kezeltük (106 U testsúlykilogrammonként IP), amelyet a szövetmintavétel előtt 3 nappal beadtunk. A jelek számszerűsítéséhez a podociták foszfo-PKR jelét egérkísérletekben a WT1 ellenfestésével detektáltuk.
Immunohisztokémia (humán minták)
Ezt a vizsgálatot előzetesen jóváhagyta a Marylandi Egyetem és a NIDDK, NIH IRB-je. Az esetek alapvető jellemzőit a kiegészítő 5b. ábra tartalmazza. A festést 5 μm vastagságú, formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szöveti metszeteken végeztük. A deparaffinizálást követően 20 percig hőindukált antigén-visszanyerést végeztünk pH 6,0 pufferben, nyomásfőző (Pascal, Agilent Technologies Dako) segítségével. A metszeteket primer antitestekkel inkubáltuk, többek között a következőkkel: foszfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) és WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Alexa Fluor másodlagos antitesteket (ThermoFisher) használtunk és konfokális mikroszkópiával vizualizáltunk.
Immunohisztokémia és élő sejtek képalkotása
A sejteket 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) és 200 nM TMRE (Invitrogen) festékkel inkubáltuk 20 percig a jeldetektálás előtt, 20 μM FCCP kezelés után és konfokális mikroszkópiával vizualizáltuk.
A mikroszkópos képek jelkvantitatív meghatározása
A humán szövetek esetében globális szklerózis nélküli glomerulusokat számoltunk (6 nem kockázatos genotípusú eset: 5, 6, 7, 10, 5, illetve 9 glomeruli esetenként; 6 kockázat-genotípusú eset: 13, 6, 4, 5, 10 és 5 glomeruli). Az egér és humán szövetek esetében a lézer teljesítményét úgy állítottuk be, hogy a maximális jel ne telítődjön. A képfeldolgozást és a kolokalizációs elemzéseket a Zen szoftverrel (Carl Zeiss, Oberkochen, Németország)54 végeztük. A súlyozott kolokalizációs együtthatót és a WT-1 pozitív sejtek átlagos intenzitását a korábban közöltek szerint számoltuk54. Az átlagos intenzitáshoz a podocita jelintenzitást a WT1-negatív intra-glomeruláris sejtekből származó jelek felhasználásával standardizáltuk minden egyes glomerulus esetében. Az értékek relatív pontszámok voltak, az APOL1-G0 jelintenzitását 100%-nak tekintve. A számszerűsítéseket vakon végeztük.
In situ hibridizáció
A kromogén in situ kimutatását az egér formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) blokkokból származó szöveti metszeteken végeztük az RNAscope in situ hibridizációval (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Röviden, 5 μm-es FFPE szövetszelvényeket paraffinmentesítettünk, 15 percig előkezelő reagenssel főztük, majd 30 percig 40 °C-on proteázzal emésztettük, majd 2 órán keresztül 40 °C-on hibridizáltuk a Hs-APOL1-01 szondával (Catalog # 439871, Advanced Cell Diagnostics). Ezenkívül Probe-Mm-PPIB (katalógus # 313911) és Probe-DapB (katalógus # 310043) pozitív, illetve negatív kontrollként használtuk. A specifikus szondakötőhelyek kimutatását az RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalog # 310035) segítségével tettük láthatóvá.
Egerek proteinuria modellje
Minden kísérletet a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Nemzeti Egészségügyi Intézetek útmutatója a laboratóriumi állatok gondozásához és felhasználásához) szerint végeztünk, és az NIDDK Animal Care and Use Committee előzetesen jóváhagyta (Animal study proposal (K097-KDB-14)). Hím és nőstény egereket használtunk, 8-15 hetes korban. Az egyes kísérletekben az egerek neme, kora és testtömege megegyezett. A randomizációt a testsúly tekintetében végeztük el. A kísérletek mintanagyságát hivatalos teljesítményszámítások nélkül határoztuk meg. Kizáró kritérium volt a 20%-nál nagyobb súlyvesztés a kísérleti időszak alatt. A proteinuria indukciójához (8 és 12 hetes egereknek) bFGF-et és puromycin-aminonukleozidot adtunk be a korábban leírtak szerint30. Az NPHS1-APOL1-deltaRNA egértörzs esetében a puromicin-aminonukleozidot (Sigma-Aldrich) a 0. napon szubkután injekcióztuk (200 mg/testsúlykilogramm), a bFGF-et (Kaken Pharmaceutical) pedig intravénásan adtuk be a 0. és a 2. napon (5 μg/állat). A PKR-gátló kísérletekhez PKR-gátló C16 (10 μg per kg IP) naponta a 0. naptól az 1055. napig. A BAC-APOL1 egértörzs esetében a -1. és az 1. napon interferon γ-t (Prospec) injektáltunk (106 U per kg testsúly), a 0. napon puromycin-aminonukleozidot szubkután (300 mg per kg testsúly), a 0. és a 2. napon pedig bFGF-et (Kaken Pharmaceutical) intravénásan (5 μg per állat). A PKR-gátló kísérletekhez a 0. naptól az 1055. napig naponta C16 PKR-gátlót (10 μg per kg IP) adtunk.
Húgy albumin és kreatinin mérés
A vizelet albuminszintjét ELISA módszerrel határoztuk meg egy egér mikroalbuminuria ELISA kit (Exocell) segítségével. A vizelet kreatininkoncentrációját kreatinin-kittel (Exocell) mértük. Minden mérést két példányban végeztünk. Az albuminuriát a vizelet albumin és kreatinin arányaként határoztuk meg. Minden eljárást a gyártók protokolljainak megfelelően végeztünk. A vizsgálók nem voltak vakok a csoportbeosztás tekintetében, de vakok voltak az eredmény értékelésénél.
Statisztikai elemzés
A legalább három egyedi kísérlet adatait elemeztük, és pontdiagram és átlagérték formájában mutattuk be. A statisztikai elemzési módszereket az egyes ábrák legendáiban írtuk le. Nem igazítottunk ki többszörös összehasonlításokat. A P < 0,05 értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.