2 Life History
FBF cercariae apró, morfológiailag nehezen azonosítható, és jellemzően rendkívül alacsony a fertőzés előfordulási gyakorisága a gerinctelen köztes gazdapopulációk között (Cribb et al., 2011). Talán ezeknek a tulajdonságoknak köszönhetően a köztes gazda(k) ismeretlen(ek) néhány FBF-faj kivételével: az édesvízi Sanguinicola nemzetség több faja (lásd Bullard és Overstreet, 2008) és a tengeri Aporocotyle simplex (lásd Køie, 1982; Køie és Petersen, 1988, kísérleti fertőzések; nem alkalmaztak molekuláris markereket), Paracardicoloides yamagutii (lásd Nolan és Cribb, 2004a; lásd a következő szöveget), C. forsteri (lásd Cribb et al, 2011; lásd a következő szöveget), és Cardicola opisthorchis (lásd Sugihara et al., 2014; lásd a következő szöveget). Az ITS2 rDNS-szekvenciákat arra használták, hogy a gerinctelen gazdaszervezetekből gyűjtött, morfológiailag meghatározhatatlan lárvális FBF-mintákat, azaz cercáriákat, sporocisztákat és rediákat összevessék a szimpatikus halgazdákból származó, morfológiailag megkülönböztethető felnőtt példányokkal. A molekuláris markerek gyorsan és olcsón lehetővé teszik a fertőzések gyors kimutatását; a fertőző ágens azonosítását filogenetikai következtetés vagy egy már szekvenált taxonnal való szekvencia-homológia alapján; és a köztigazdák azonosítását, így összekapcsolva a potenciálisan patogén FBF-ek életszakaszait. A köztes és végleges gazdák azonosságának meghatározása természetesen az első kritikus lépés az FBF-ek életciklusának megértésében. A diagnosztikai megközelítéseken túlmenően azonban még sok mindent meg kell tudni az FBF-ek és a polichaeták, csigák és kéthéjú kagylók köztes gazdái közötti gazdatest-parazita kapcsolat konkrét részleteiről. Végül is evolúciós történetüket éppúgy, vagy még inkább befolyásolhatják ezek a köztes gazdák, mint végleges gazdáik. Ezért amellett érvelünk, hogy a molekuláris vizsgálatoknak nem szabad teljesen kiszorítaniuk a klasszikus kísérleti vizsgálatokat, amelyek során közvetlen mikroszkópos megfigyeléseket végeznek a lárvák és kifejlett FBF-ek gazdaszövetekben a naiv gerinctelen és végleges gazdahalak expozícióját követően (Køie, 1982).
Az FBF-ek életciklusára vonatkozó információk nagy része a kereskedelmi akvakultúrához kapcsolódó víziállat-egészségügyi programokból származik: A GenBankban rendelkezésre álló 109 FBF-szekvenciából 17 (16%) tengeri akvakultúrában előforduló fertőzésekből származik (1.1. táblázat). Az FBF azon kevés trematódacsoportok egyike, amelyek tagjai károsíthatják a végleges gazdahalat, mivel a kifejlett egyedek elzárják a vérereket és fulladást okoznak, mivel a peték károsítják vagy elzárják a kopoltyúhámot és az ági ereket, és mivel a miracídiumok a kopoltyúhámba ágyazott petékből kikelnek és kifúródnak a halból (Bullard és Overstreet, 2002, 2008). Mint ilyenek, életciklusuk aggodalomra ad okot a kereskedelmi akvakultúra-üzemek számára, mivel az FBF-ek elpusztíthatják vagy legyengíthetik a halakat, és gazdasági veszteségeket okozhatnak az édesvízi tavakban, a tenyésztelepeken és a tengeri tengeri ketrecekben. Az FBF aszexuális szaporodási stádiumainak – sporociszta, rediae és cercariae – otthont adó, nem kifejlett, csigás, kéthéjú és policháta gazdákat fertőző FBF-ekből származó szekvenciák száma jóval kevesebb (109-ből 4) (1.1. táblázat), mint a halgazdákat fertőző kifejlett példányokból származó szekvenciáké.
Az első közzétett, molekuláris módszer alkalmazásával meghatározott FBF-életciklus-vizsgálatban Nolan és Cribb (2004a) két cercaria-morfotípust (“A-típusú” és “B-típusú”) dokumentált, amelyek az ausztráliai Queensland árapályos patakjaiban élő Posticobia brazieri hidrobiida csigafélék 11 314 példányából 80-at (0,7%) fertőzött meg. Az “A” típusú cercáriák ITS2 rDNS-szekvenciái illeszkedtek (100%-os egyezés) a P. yamagutii kifejlett példányaihoz, amelyeket az Anguilla reinhardtii pettyes hosszúszárnyú angolna véréből (háti aorta, pitvar, kamra, kopoltyú, vese, valamint a bél és az úszóhólyag érrendszeréből) gyűjtöttek. Egy másik tanulmányban, a Dél-Ausztrália partjainál tenyésztett déli kékúszójú tonhalat (T. maccoyii) megfertőző C. forsteri fertőzésekkel kapcsolatos betegségekkel kapcsolatos aggodalmakra reagálva Cribb és munkatársai (2011) 11 kéthéjú, 2 csigás és 24 polichaeta család 9351 egyedét vizsgálták FBF-fertőzésekre. A Longicarpus modestus-t (Polychaeta: Terebellidae) megfertőző cerkáriákból származó ITS2 rDNS-szekvenciaadatok 100%-os egyezéssel illeszkedtek a C. forsteri kifejlett példányaihoz, amelyek a közeli Port Lincolnnál, Ausztráliában, egy hálós karámban lévő déli kékúszójú tonhal szívéből kerültek elő. Szekvenálták a L. modestus-t megfertőző C. forsteri cercariákból származó 28S rDNS fragmentumot is (721 bp a D1-D2 régióban). Cribb és munkatársai (2011) megközelítését követve Sugihara és munkatársai (2014) a polichétákra összpontosítottak, miközben 744 gerinctelen állatot vizsgáltak FBF-fertőzések szempontjából a csendes-óceáni kékúszójú tonhal, a Thunnus orientalis tenyészhelyén, Japán déli részén. Az FBF sporocisztáit és cercáriáit egy terebellid polychaete (Terebella) öt egyedében találták meg, amelyeket az aljzatról, valamint a tengeri ketrec alatti kötelekről és úszókról vett elpusztult pajzstetvek héjából gyűjtöttek. A sporocisztákból származó ITS2 és 28S szekvenciák megegyeztek (100%-ban) a C. opisthorchis kifejlett egyedeinek szekvenciáival, amelyek tenyésztett csendes-óceáni kékúszójú tonhal szívéből származnak.
Shirakashi és munkatársai (2012) a Cardicola orientalis és a C. opisthorchis egyidejű fertőzését vizsgálták csendes-óceáni kékúszójú tonhalban. ITS2 rDNS-szekvenciaadatokat használtak arra, hogy megkülönböztessék a C. opisthorchis félhold alakú petéit az afferens fonal artériában a C. orientalis tojásaitól, amelyek a kopoltyúlamellákat fertőzik. Megállapították, hogy a kopoltyúszöveti mintákon alkalmazott fajspecifikus PCR-primerek kiegészíthetik a szövettani vizsgálatot, és segíthetnek a fertőzések diagnosztizálásában, mielőtt az ikrák és a kifejlett egyedek száma elég nagy lenne ahhoz, hogy fénymikroszkópiával könnyen megfigyelhető legyen. Yong és munkatársai (2013) teljes ITS2 rDNS-szekvenciaadatokat használtak fel, hogy a Nagy-korallzátonyból származó öt lepkehalfaj (Perciformes: Chaetodontidae) kopoltyújában elhelyezett FBF petéket egyetlen Cardicola chaetodontis fajként azonosítsák (két mintában egyetlen bázispár különbség). Az FBF petéit nem ritkán megfigyelik a halak kopoltyúhámjában és ági arterioláiban a rutinszerű halnektopsziák során (SAB, személyes megfigyelések), de sok esetben a megfelelő kifejlett példányok, amelyek az egyes halak vérét fertőzik, nem kerülnek elő. Az olyan molekuláris technikák, amelyek hatékonyan kivonják és felerősítik a DNS-t az FBF ikrából, amely apró, például a C. chaetodontis ikrája 40-60 μm teljes hosszúságú, azt ígérik, hogy feltárják a meg nem nevezett FBF-fajok és eddig dokumentálatlan gazdaszervezetek jelenlétét, ha a kapott szekvenciákat filogenetikai kontextusba helyezik a megnevezett fajok szekvenciáival. Ugyanez mondható el a cercáriákból származó szekvenciákról is (lásd a következő szöveget). Norte Do Santos és munkatársai (2012) kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR) segítségével azonosították a C. forsteri petéit, amelyek a tenyésztett déli kékúszójú tonhal kopoltyújában aggregálódtak. Hasonlóképpen Kirchhoff és munkatársai (2012) is ezt a módszert alkalmazták a T. maccoyii-t fertőző C. forsteri petéinek diagnosztizálására. Polinski és munkatársai (2013) egy lépéssel tovább vitték a megközelítést egy érzékeny és pontos valós idejű PCR-technika kifejlesztésével, amely a C. forsteri, a C. orientalis és a C. opisthorchis azonosítására is használható nem halálos mintákban. Egyik vizsgált módszer, azaz a SYBR-alapú qPCR és a közös riporter TaqMan próba esetében sem mutattak ki faj- vagy gazdagenomikai amplifikációt; kombinált alkalmazásuk azonban javította a fajok megkülönböztetésének megbízhatóságát. Ezek a módszerek megerősítették a C. forsteri és a C. orientalis egyidejű fertőzéseit a T. maccoyii-ban, továbbá a C. orientalis nagyobb prevalenciáját és elterjedtségét jelezték a gazdaszervezetben.
A közelmúltban mindkét kifejlesztett technika hasznosságát támogatták az FBF-fertőzések patológiai következményeinek felmérésében. Polinski és munkatársai (2014) a qPCR-t gazdagén immunátírással kombinálták a C. opisthorchis és a C. orientalis által fertőzött szövetekből származó DNS mennyiségének számszerűsítésére. Emellett számszerűsítették az ezekre a fertőzésekre adott időbeli gazdaszervezeti immunválaszt ketrecbe zárt csendes-óceáni kékúszójú tonhalakban. Korábbi adatok a C. orientalis kifejlett egyedeit és petéit a kopoltyúban dokumentálták (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), míg a C. opisthorchis kifejlett egyedei és petéi a szívet, illetve az afferens ági artériákat fertőzték (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Polinski és munkatársai (2014) eredményei azonban kimutatták az IgM átírás korrelációját a nagy mennyiségű “csak C. orientalis” fertőzéssel a kopoltyúszövetekben, de nem a C. opisthorchis DNS-ével, ami arra utal, hogy az ilyen immunválaszt ebben a szervben inkább a kifejlett egyedek, mint az ikrák jelenléte válthatja ki. Ezenkívül a C. orientalis DNS-ének magas szintjét a szívben a fiatalkorú hernyók jelenlétének tulajdonították. Bár az ilyen módszerek nem képesek azonosítani az FBF életszakaszait, illetve azt, hogy a hernyók élnek-e vagy elpusztultak, ez a kvantitatív megközelítés lehetővé teszi a fertőzés intenzitására és a fertőzési státuszra vonatkozó feltételezéseket, ami önmagában is ígéretes eszköz a vadon élő vagy tenyésztett halakkal végzett jövőbeli járványügyi vizsgálatokhoz.
Brant és munkatársai (2006) filogenetikai következtetést (28S, 18S és COI) alkalmaztak több, Ugandában, Kenyában és Ausztráliában élő csigafélékből (Planorbidae és Thiaridae) izolált, azonosítatlan feltételezett FBF cercaria kezelésére. Morfológiailag jellemezték a cercariumokat fotomikroszkópiával és a szemgödrök jelenléte/hiánya, a cercarium farkán és testén lévő uszonyredők és a farok alakja alapján. Bár az FBF-erkáriák következetes és filogenetikailag koherens, morfológiai alapú definíciója (diagnózisa) hiányzik, ezek a cerkáriák jellemzően jellegzetesek: aprók, villás farkúak, ventrális szívófej nélkül, jellegzetes behatoló szervvel, amely valószínűleg egy speciális elülső szívófejből áll (Truong és Bullard, 2013), a cerkária testén lévő uszonyredővel és a farok furkáján lévő vagy hiányzó uszonyredővel (Cribb et al., 2011). Az egyik ilyen cercaria (W5004) morfológiailag különösen bizarr volt, azaz leírása szerint afaryngeus és furcocercus, de “extravagáns oldalsó farokhártyával és hegyes testformával” rendelkezett, és egyik cercaria sem rendelkezett az FBF cercariákra jellemző összes jellemzővel (lásd az előző szöveget). Azonban ezeknek a cercáriáknak a kombinált 18S és 28S elemzése más FBF szekvenciákkal klaszterezte őket (feltételezzük, hogy a “Sanguinicolid sp.” a “Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Emiatt, valamint azért, mert morfológiailag bizarrak voltak az ismert FBF-erkáriákhoz képest, ezek a szerzők azt állították, hogy az FBF-erkáriák morfológiai változatossága sokkal nagyobb, mint amit a szakirodalom eddig felismert. E szekvenciák taxonómiai azonosságát és filogenetikai jelentőségét a szövegben később tárgyaljuk.