Materials
4′-Hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid (HABA), biotin, N-(2-aminoetil)maleimid trifluoroacetát só (amino-maleimid), ecetsav, nátrium-acetát, foszforsav, magnézium-klorid, Tween 20, Tween 80, szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), dimetil-szulfoxid (DMSO), dextrán (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; felhasználás előtt liofilizálva), 4-nitrofenil-kloroformiát (PNC; felhasználás előtt szublimálva), LiCl (felhasználás előtt 110 °C-on szárítva), tiramin (TA), vízmentes piridin, vízmentes N,N-dimetil-formamid (DMF), N,N-diizopropil-etilamin (DIPEA), piperidin, aminosavak, ecetsav-anhidrid, triizopropil-szilán, trifluor-ecetsav (TFA), nátrium-hidroxid (NaOH), N-Boc-1,4-butándiamin (NH2-Boc), nátrium-bikarbonát (NaHCO3), biotin-atto565, biotin-4-fluoreszcein (biotin-FITC), 6-amino-fluoreszcein, torma-peroxidáz (HRP, VI. típus), biotin-HRP, hidrogén-peroxid (H2O2); inhibitorral), magzati szarvasmarha szérum (FBS), kalcein AM, etídium homodimer-1 (EthD-1), tiazolil-kék tetrazolium-kék (MTT) és minden más oldószert, hacsak másképp nem szerepel, a Sigma-Aldrich-tól vásároltunk. A csont alakú mester a LEGO-tól származik. A polidimetil-sziloxánt (PDMS; Sylgard 184) a Dow Corningtól vásároltuk. A foszfáttal pufferelt sóoldatot (PBS) a Lonzától vásároltuk. A rekombináns humán BMP7 (354-BP-010), a 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) és a H2SO4 az R&D Systems-től származott. Az Fmoc-Rink 4-metilbenzhidrilamin (MBHA) gyantát (50 mg skála, helyettesítés 0,52 mmol g-1) és az N,N,N,N′,N′,N′-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)urónium-hexafluorofoszfátot (HBTU) a MultiSynTech-től vásároltuk. A kloroformot és az 1-metil-2-pirrolidinont (NMP) a WR Chemicals-tól vásároltuk. A BMP7 elleni VHH antitestet (Q32c-lab, G7 klón) és a VHH elleni poliklonális nyúl antitestet (K1216) a QVQ-tól vásároltuk. A biotinilált IL-1β antitestet (508301, JK1B2 klón, RRID:AB_315512) a Biolegendtől vásároltuk. A biotinilált IgG-t (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) a Jackson Immunoresearch-től vásároltuk. A nyúl elleni HRP-konjugált másodlagos kecske ellenanyagot (P0448) a Dako-tól vásároltuk. A biotinilált arany nanorészecskéket (20 nm) a Cytodiagnostics-tól vásároltuk. A KGLPLGNSH aminosav szekvenciájú biotinilált peptidet a Pepscan-tól vásároltuk. A szukcinimidil-6-(biotinamido)hexanoátot (biotin-LC-NHS) az ApexBio-tól vásároltuk. Neutravidin, N-hidroxiszukcinimid-desztiobiotin (EZ-Link NHS-desztiobiotin), 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) és 3,3′-diaminobenzidin (DAB) festő készletet a ThermoFisher Scientific-től vásároltunk. Az aminkapcsoláshoz használt előaktivált érzékelőket (G-típusú easy2spot) az Ssens BV-től vásároltuk. A Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), a penicillin és a streptomicin, valamint a tripszin-EDTA a Gibco-tól származott. A riporter lízispuffert (E397A), a luciferáz vizsgálati reagens (E1483) és a QuantiFluor dsDNS rendszert a Promegától vásároltuk. A C2C12-BRE-Luc sejteket prof. Daniel B. Rifkin.
Neutravidin multivalencia analízis
A neutravidin biotin-kötő zsebeinek számának elemzésére a HABA spektrofotometriás analízisét használtuk. Konkrétan, a HABA képes specifikusan kötődni a (neutr)avidinhez a biotinhoz hasonló módon, de alacsonyabb kötési affinitással. A HABA/neutravidin komplexnek 500 nm körüli abszorpciós csúcsa van. A nem kötött HABA abszorpciós csúcsa 350 nm körül van. A HABA biotinnal történő kiszorítása tehát a 350 és 500 nm-en mért abszorbancia mérésével értékelhető. A neutravidin biotin-kötő zsebeinek számának meghatározásához először többlet HABA-val inkubáltuk, hogy teljesen telített HABA/neutravidin komplexek alakuljanak ki. Ezekhez a komplexekhez 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 és 1:6 neutravidin/biotin moláris arányban biotint adtunk. Minden egyes neutravidin/biotin arány esetében mind a HABA/neutravidin komplex, mind a szabad HABA mennyiségét az 500, illetve 350 nm-en mért abszorbancia mérésével határoztuk meg egy ND1000 spektrofotométer (ThermoFisher scientific) segítségével. A 3,2 biotin/neutravidin értéken mért plató jelezte a biotin-kötő zsebek számát, ami megfelelt a gyártó adatlapjának (3,1 biotin/neutravidin).
SPRi mérések
A biotinilált IL-1B-t folyamatos áramlású spotter (Wasatch Microfluidics) segítségével immobilizáltuk G-típusú easy2spot szenzorokra. A gél típusú szenzorokat a megnövelt kötési kapacitásuk és az evaneszcens mező hatékonyabb kihasználása miatt használtuk a sík felületű szenzorokhoz képest. Az immobilizációs reakciót 50 mM ecetsav pufferben végeztük (150 µl per spot) 5, 2,5, 1,25 és 0,625 µg ml-1 antitest-koncentrációval. Kontrollként 5 µg/ml koncentrációban BSA-t foltoztunk. Az immobilizációs puffer (pH 4,6) biztosította a legnagyobb megtartott aktivitású ellenanyag-kapcsolást, ezért minden kísérletben ezt használtuk. A nem specifikus kölcsönhatások csökkentése érdekében a szenzort 1 % (w/v) BSA-val inaktiváltuk 50 mM acetát pufferben (pH 4,6) 7 percig, majd ezt követően 0,2 M etanolaminnal (pH 8,5) további 7 percig. Az SPRi-t egy MX96 rendszerrel és SUIT operációs szoftverrel (IBIS) végeztük. A neutravidint, a D-@BMP7-et, a B-@BMP7-et és a BMP7-et 0,5 % (w/v) BSA-t és 0,075 % (v/v) Tween80-t tartalmazó PBS-ből álló rendszerpufferben oldottuk 250, 100, 100 és 100 nM koncentrációban. A biotint 400 µM koncentrációban oldottuk 0,1% (v/v) DMSO-val kiegészített rendszerpufferben. Az oda-vissza áramlást 10 µl min-1-re állítottuk be egy 12 µl mintát tartalmazó áramlási cellában. A Sprint szoftvert használtuk az adatgyűjtéshez és a referenciákhoz, összesen hat foltból, feltételenként. Az adatokat ezt követően a Matlab R2015a programba exportáltuk a további elemzéshez és a minőségellenőrzéshez egyedi szkriptek segítségével (kérésre rendelkezésre állnak). A szupramolekuláris komplexek disszociációs állandóit a következőképpen határoztuk meg: először a szenzort három vak (azaz rendszerpuffer) injekcióval mostuk, hogy a kölcsönhatási jelek hátterét biztosítsuk. Ezután kaszkád megközelítést alkalmaztunk a komplex komponensei közötti affinitás meghatározására. Ebből a célból a szenzort pufferrel inkubáltuk, majd neutravidin, D-@BMP7 vagy B-@BMP7, BMP7 és végül biotin oldat következett. A kaszkád kölcsönhatások asszociációs ideje 30 perc volt, amelyet 15 perc disszociáció követett. Az egyes injektálások között a szenzort rendszerpufferrel mostuk. A biotinnal való kiszorító kölcsönhatás asszociációs ideje 180 perc volt, és kétszer végeztük el. A kinetikát egy egyszerű 1:1 Langmuir-kölcsönhatással lehetett leírni, amely exponenciális egyenlettel (3) megragadható.
Ebben az egyenletben Rmax a ligandum kötési kapacitása (RU), kon az asszociációs sebesség (M-1 s-1), koff a disszociációs sebesség (s-1), c az analit koncentrációja (M) és t a kölcsönhatás kezdetétől számított idő (s). A Kd disszociációs állandó a koff/kon értékkel van meghatározva. Az affinitási adatok elemzéséhez a Langmuir-féle kölcsönhatás illesztésével Matlab szoftvert használtunk egyedi szkriptekkel. Röviden, a vakokat kivontuk, és a jelet az első kölcsönhatásig nulláztuk. Egy adott kölcsönhatás affinitásának meghatározásához először a koff sebességet határoztuk meg a disszociációs fázisban. Ezt követően a kon sebességet határoztuk meg egy rögzített koff segítségével. A biotinnal való elmozduláshoz a koff sebességet az asszociációs fázisban határoztuk meg.
Dex-TAB szintézis és jellemzés
A dextránt p-nitrofenil-kloroformáttal (PNC) reagáltattuk p-nitrofenil-karbonát konjugátumok előállítására, amelyeket ezután primer amintartalmú vegyületekkel kezeltünk (2. kiegészítő ábra). A dextrán-p-nitrofenil-karbonát konjugátumokat (Dex-PNC) a következőképpen szintetizáltuk. Egy tipikus kísérletben a dextránt (3,0 g, 56,3 mmol OH-csoportok) DMF-ben (200 ml, 2,4 g LiCl-t tartalmazó) 90 °C-on, nitrogén atmoszférában oldottuk fel. A dextrán feloldása után az elegyet 0 °C-ra hűtöttük. Az oldathoz kis adagokban piridint (1,5 mL, 18,6 mmol), majd PNC-t (2,8 g, 13,9 mmol) adtunk, miközben kevertettük és a hőmérsékletet 0 °C-on tartottuk. A reakciót egy órán át hagytuk folyni, majd a terméket hideg etanolban kicsaptuk. A csapadékot leszűrtük és etanollal, majd dietil-éterrel mostuk, majd vákuumkemencében szárítottuk. A dextrán-tiramin-butilamint (Dex-TA-NH2) a következőképpen szintetizáltuk. A Dex-PNC-t először N-Boc-1,4-diaminobutánnal, majd tiraminnal reagáltatták. A védő t-butiloxikarbonil csoportot TFA-val történő reakcióval távolítottuk el. Egy tipikus kísérletben a Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC csoportok) 16 ml DMF-ben oldottuk. N-Boc-1,4-diaminobután (0,09 g, 0,48 mmol) nitrogénáram alatt hozzáadtuk, és a reakciót 15 percig hagytuk folyni. Ezt követően tiramint (0,20 g, 1,46 mmol) adtunk hozzá, és a reakciót egy órán át hagytuk folyni. A terméket hideg etanolban kicsaptuk, a csapadékot leszűrtük, etanollal és dietil-éterrel mostuk, majd vákuumkemencében szárítottuk. A Boc-védett Dex-TA-NH-t (0,85 g, 0,47 mmol) 10 ml ionmentesített vízben oldottuk. Trifluorecetsavat (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) adtunk hozzá nitrogén atmoszféra alatt, és egy éjszakán át kevertettük. A reakcióelegyet 2 M NaOH oldattal semlegesítettük, majd 150 mM NaCl oldattal szemben 48 órán keresztül 150 mM NaCl oldattal és 24 órán keresztül ionmentesített vízzel dialízissel (1000 Da molekulatömeg cut-off) tisztítottuk, majd liofilizálással izoláltuk. A Dex-TA-NH2-t tovább funkcionalizáltuk biotinnal úgy, hogy 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2-t legalább 1 órán keresztül 0,1 M bikarbonát pufferben (pH 8,5) 20-szoros moláris többlet biotin-LC-NHS-szel reagáltattunk (3. kiegészítő ábra). A Dex-TAB-t ezután tisztítottuk és koncentráltuk egy 3 kDa molekulatömeghatárú spinszűrő oszlop segítségével. A Dex-PNC, Dex-TA-NH2 és Dex-TAB sikeres szintézisét 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) segítségével igazoltuk DMSO-d6-ban vagy D2O-ban. A konjugált tiramin- és butilamin-részek számát 100 dextrán anhidroglükózgyűrűre vetítve a dextrán (δ 4,0-5,8 ppm) és a tiramincsoportok (δ 6,66 és δ 6,98 ppm), illetve a dextrán és a butilamincsoportok (δ 1,4-1,5 ppm) integrált jeleinek arányát számoltuk ki. A konjugált biotin-részek számát 100 dextrán anhidroglükózgyűrűre vetítve úgy határoztuk meg, hogy kiszámítottuk a tiramincsoportok (δ 6,66 ppm és δ 6,98 ppm) és a kapcsolt 6-aminokapronsav-spacer (δ 2.13).
Dex-TAB keresztkötés és ortogonális poszt-funkcionalizáció
Dex-TAB hidrogélszerkezeteket állítottunk elő 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 torma-peroxidáz és 0,05% (w/v) H2O2 keverésével. Az ortogonális poszt-funkcionalizáláshoz a Dex-TAB hidrogéleket egymás után 1 µM neutravidinnel inkubáltuk mosópufferben, amely 1% (w/v) BSA-t tartalmazott PBS-ben, mosópufferrel mostuk a nem kötött neutravidin eltávolítása érdekében, 1 µM biotinilált vagy destiobiotinilált molekulával inkubáltuk a mosópufferben, és ismét mosópufferrel mostuk a nem kötött molekulák eltávolítása érdekében. A Dex-TAB/neutravidin/desztiobiotin konstrukciókat ezt követően ki lehetett tenni a kívánt biotinilált molekulákkal, hogy ellenirányú biokémiai gradienst hozzanak létre. A fluoreszcens mikroszkópia (EVOS FL), a fluoreszcens konfokális mikroszkópia (Zeiss LSM 510 és Nikon A1+) és a fluoreszcencia fotobleaching utáni helyreállítás (FRAP; Zeiss LSM 510), a mikrogéleket közvetlenül sztreptavidin-FITC-vel funkcionalizáltuk, vagy a fent leírt neutravidin-funkcionalizálást követően biotin-atto565-tel, biotin-FITC-vel és/vagy destiobiotin-FITC-vel funkcionalizáltuk, amelyet házilag állítottunk elő destiobiotin-NHS és 6-aminofluorescein összekapcsolásával 1 M bikarbonát pufferben (pH 8). A FRAP-görbéket úgy kaptuk meg, hogy az idő függvényében ábrázoltuk a fehérítőfolt fluoreszcens intenzitását mínusz a fehérítés előtti fehérítési sebességgel korrigált átlagos intenzitásra normalizált háttér, ahol a fehérítési sebességet a fehérítőfolt mellett a fehérítés előtti átlagos intenzitásra normalizált minta fluoreszcens intenzitásának normalizálásával határoztuk meg. A destiobiotin/biotin elmozdulás jellemzésére a Dex-TAB hidrogél-konstrukciókat egymás után neutravidinnel funkcionalizáltuk, PBS-szel mostuk, destiobiotin-FITC-vel funkcionalizáltuk, PBS-szel mostuk és biotin-atto565-tel funkcionalizáltuk, miközben fluoreszcens konfokális mikroszkópiával képeket készítettünk. Végül a hidrogéleket többször alaposan átmostuk PBS-szel a nem kötött B-ATTO eltávolítása érdekében, és fluoreszcens konfokális mikroszkópiával képet készítettünk a B-ATTO-val helyettesített D-FITC relatív mennyiségének számszerűsítése céljából. A kísérletet más biotinvegyületekkel is megismételtük, hogy demonstráljuk a megközelítés univerzális voltát. Konkrétan, neutravidin/D-FITC funkcionalizált Dex-TAB hidrogéleket inkubáltunk és folyamatosan monitoroztunk 8 napig 1 µM biotin, biotinilált peptid (azaz B-peptid; KGLPLGNSH aminosav szekvencia), HRP (B-HRP), immunglobulin G (B-IgG) vagy arany nanorészecskék (B-GNP) jelenlétében PBS-ben. A mintákat a D-FITC intenzitásának elemzése előtt legalább egy napig alaposan mostuk PBS-szel a nem kötött részek eltávolítása érdekében. A szupramolekulárisan komplexált B-HRP biológiai funkcióját a gyártó protokollját követő DAB festő készlet segítségével értékeltük. A 3D csont alakú biotinilált hidrogéleket Dex-TAB fröccsöntéssel hoztuk létre egy polidimetil-sziloxán (PDMS) formába, amelyet egy miniatűr csont alakú mester segítségével készítettünk. A hidrogél csontokat homogén módon FITC-vel funkcionalizáltuk 1 µM neutravidin, PBS és 1 µM D-FITC oldatokkal történő éjszakai inkubálással. A PBS-szel történő alapos mosást követően a csont alakú hidrogélek felső részeit 1 µM B-ATTO-val inkubáltuk időzített merítéssel, majd ezt követően PBS-szel mostuk a nem kötött fluoroforok eltávolítása érdekében, és fluoreszcens mikroszkópiával elemeztük. A szupramolekuláris komplexképződés hosszú távú stabilitásának tanulmányozására két, körülbelül 5 × 5 × 5 mm méretű Dex-TAB hidrogélt kizárólag D-FITC-vel és B-FITC-vel jelöltünk, alaposan átmostuk PBS-szel, és a tiramin-részek enzimatikus keresztkötése révén kovalens kötést végeztünk egy közbülső, érintetlen (azaz nem jelölt) Dex-TA segítségével. A kombinált hidrogél-konstrukciókat ezután PBS-ben inkubáltuk, és konfokális fluoreszcens mikroszkópiával 2 héten keresztül folyamatosan képeket készítettünk a destiobiotinilált és biotinilált minták stabilitásának vizsgálatára. Az összes fluoreszcens kép keresztmetszeti intenzitását ImageJ szoftver segítségével határoztuk meg.
Hidrogélhálózat-elemzés
A Dex-TAB hidrogélkonstrukciók multivalens neutravidinnel történő utólagos funkcionalizálásának a hidrogélhálózat tulajdonságaira gyakorolt hatásának elemzésére diffúziós elemzést végeztünk. Ebből a célból érintetlen Dex-TAB hidrogél-konstrukciókat és túlzott mennyiségű neutravidin felhasználásával homogén módon poszt-funkcionalizált konstrukciókat FITC-jelölt dextrannal kombináltunk, RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) és RH = 27 nm (2000 kDa) hidrodinamikai sugárral. A fluoreszcens oldatokban lévő hidrogél-konstrukciókat ezután fluoreszcens konfokális képalkotással (Zeiss LSM 510) elemeztük, és a konstrukciókon belüli és kívüli fluoreszcens intenzitást az ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük. A fluoreszcensen jelölt dextrán molekulák Dex-TAB-be történő relatív permeációját úgy határoztuk meg, hogy az intenzitást a hidrogéneken kívüli fluoreszcens intenzitással normalizáltuk. Ugyanezt a megközelítést alkalmaztuk az 5%-os (w/v) Dex-TAB FITC-jelölt hagyományos IgG antitestek és a VHH relatív permeabilitásának számszerűsítésére és összehasonlítására.
VHH módosítása és jellemzése
Maleimid-konjugált destiobiotint szintetizáltunk amino-maleimid és destiobiotin-NHS 2 órás reakciójával bikarbonát pufferben (pH 8). A destiobiotin-maleimid tisztítása nagynyomású folyadékkromatográfiával történt 2545-ös kvaterner gradiens modulon (Waters) 90%/10% víz/acetonitril (0,1% trifluorecetsav (TFA)) és 100% acetonitril (0,1% TFA) között. Az összegyűjtött terméket tömegspektrometriával jellemeztük; MS(ESI): m/z = 336,96 (számított m/z = 337,18 a C16H24N4O4-re). Az oldószereket rotációs vákuumpárologtatóval elpárologtattuk, majd a destiobiotin-maleimid milliQ vízben újra szuszpendáltuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és egy éjszaka alatt liofilizáltuk. A destiobiotinilált és biotinilált VHH-t a QVQ BV úgy szintetizálta, hogy a VHH nem módosított ciszteinjét maleimid-konjugált destiobiotinnal, illetve maleimid-konjugált biotinnal reagáltatta. ELISA-t alkalmaztunk a nem módosított, illetve a destiobiotinilált (D-@BMP7) és biotinilált (B-@BMP7) VHH BMP7 elleni affinitásának értékelésére. Ebből a célból egy 96 lyukú Maxisorp lemezt egy éjszakán át 4 °C-on 0,5 µg ml-1 humán BMP7-gyel vontunk be PBS-ben. A lemezeket 4%-os sovány tejjel blokkoltuk PBS-ben, majd különböző koncentrációjú (0-5 µM) VHH-t adtunk hozzá 1%-os sovány tejben. A VHH-k kimutatását a VHH elleni poliklonális nyúl antitest és a nyúl elleni HRP-konjugált másodlagos kecske antitest segítségével végeztük. H2O2 hozzáadása TMB-vel együtt azonosította a HRP mennyiségét a színes termékké való átalakulás révén. A reakció leállításához H2SO4-ot adtunk. A spektrofotometriás abszorpciós méréseket 450 nm-en végeztük lemezolvasóval (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). A dózis-válasz görbéket úgy kaptuk meg, hogy a mért adatokra logisztikus függvényt illesztettünk a (4.) egyenlet segítségével.
Cellakultúra
C2C12-BRE-Luc sejteket DMEM-ben lévő, 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml penicillin és 100 µg/ml streptomicin tartalmú táptalajban tenyésztettük. A sejteket 5% CO2 mellett, 37 °C-on tenyésztettük, és a tápfolyadékot hetente kétszer cseréltük. Amikor a sejtkultúra elérte a közel konfluenciát, a sejteket 0,25%-os (w/v) tripszin-EDTA segítségével 37 °C-on leválasztottuk, és ezt követően szubkultúráztuk vagy kísérletekre használtuk. Az enzimatikusan térhálósított 5%-os (w/v) Dex-TAB-ban kapszulázott sejtek életképességét közvetlenül a kapszulázást követően (azaz a 0. napon), valamint négy és hét napos in vitro tenyésztés után elemeztük úgy, hogy a sejteket 30 percig 2 µM kalcein AM-mel (élő) és 4 µM EthD-1-gyel (halott) inkubáltuk PBS-ben, és a jelölt sejteket fluoreszcens mikroszkópiával vizualizáltuk. Az élő/halott elemzést a sejtekkel töltött Dex-TAB hidrogélek neutravidinnel, D-@BMP7-gyel és B-@BMP7-gyel történő utólagos módosítását követően is elvégeztük, az előző, “Dex-TAB keresztkötés és ortogonális utólagos funkcionalizálás” című módszertani szakaszban leírtakkal megegyező utólagos funkcionalizálási protokollt alkalmazva. A sejtek metabolikus aktivitását a sejtek 0,5 g l-1 MTT-vel történő festésével elemeztük a táptalajban, majd ezt követően fénymezős mikroszkópiával vizualizáltuk. A BMP7 indukciós kísérletekhez a sejteket 10 000 sejt cm-2 -ben vetettük el szövettenyésztő műanyagra, és egy éjszakán át tenyésztettük. A sejteket 0,5% (v/v) FBS-t tartalmazó táptalajjal 12 órán keresztül éheztettük. Az éheztetést követően előre gyártott Dex-TAB/neutravidin, Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidin/B-@BMP7 vagy biotinnal kezelt Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7 hidrogél-konstrukciókat adtunk a sejtkultúrához, amelyeket ezt követően 100 ng ml-1 BMP7-nek tettünk ki 10-15 órán keresztül (12. kiegészítő ábra). Ezt követően a sejteket riporter lízispufferrel és egyetlen fagyasztási-olvasztási ciklussal lizáltuk. A luciferáz-expressziót a gyártó protokollját követő luciferáz-teszttel és luminométerrel (Victor X3, Perkin Elmer) határoztuk meg. A luciferáz expressziót a teljes DNS-tartalomra normalizáltuk, amelyet a QuantiFluor dsDNS rendszerrel számszerűsítettünk a gyártó protokollját követve és fluorométerrel (Victor X3).
Adatok megjelenítése és statisztika
A HABA spektrofotometriás abszorpciós méréseit feltételenként hat mintán végeztük, és átlag ± standard eltérésként jelentettük. Az SPRi méréseket feltételenként hat folton végeztük, és átlag ± standard eltérésként (világos színű vonalak) jelentettük. Az egyes foltok SPRi-méréseit a neutravidin-kötési görbék Rmax értékéhez képest normalizáltuk, hogy korrigáljuk a foltok sűrűségében mutatkozó különbségeket (1. kiegészítő ábra). A szupramolekuláris kölcsönhatások kon, koff és Kd értékeit legalább három SPRi kísérletből határoztuk meg, és átlag ± standard eltérésként vagy az egyes adatpontok átfedéseként adtuk meg. A fluoreszcensen jelölt sztreptavidin FRAP-méréseket feltételenként legalább négy hidrogél-konstrukción végeztük, és a fehérítés előtti átlagos intenzitásra normalizált átlag ± standard eltérésként jelentettük. A fluoreszcencia (konfokális) intenzitásméréseket (beleértve az time-lapse kísérleteket is) feltételenként legalább négy hidrogél-konstrukción végeztük, és átlag ± standard eltérésként vagy az egyes adatpontok átfedéseként jelentettük, mindegyiket a legmagasabb átlagos intenzitásra normalizálva. A lineáris regressziós elemzést az OriginPro 2016 szoftver segítségével végeztük el. A D-FITC biotinilált részek általi kiszorítását fluoreszcens mikroszkópiával mértük feltételenként tíz mintán. A különbségek szignifikanciáját egyirányú ANOVA segítségével vizsgáltuk Tukey post-hoc teszttel (az adatok normális eloszlását a Shapiro-Wilk teszt jelezte: p > 0,1). A fluoreszcensen jelölt dextránmolekulák, VHH és IgG permeációját a Dex-TAB-be feltételenként négy hidrogél-konstrukción mértük, és átlag ± standard eltérésként jelentettük. A VHH és IgG permeabilitás közötti különbségek szignifikanciáját Mann-Whitney-teszt segítségével határoztuk meg. Az élő/halott mennyiségi meghatározást feltételenként három, sejtekkel teli hidrogélen végeztük el, és az egyes adatpontok átfedéséből számított átlagként jelentettük. A különbségek szignifikanciáját Kruskal-Wallis ANOVA teszt segítségével határoztuk meg. A dózisválasz-elemzéseket koncentrációnként három minta felhasználásával végeztük el, és az átlag ± standard eltérés és a (4. egyenleten alapuló, felülről illesztett logisztikus függvényként jelentettük.) A dózis-válasz görbék konfidenciaintervallumait a grafikonrajzoló szoftver automatikusan generálta. A C2C12-BRE-Luc sejtek relatív indukcióját feltételenként három in vitro mintán mértük, és átlag ± standard eltérésként jelentettük. A különbségek szignifikanciáját Kruskal-Wallis ANOVA-tesztekkel határoztuk meg.
Sémák
Minden grafikon az OriginPro 2016 szoftverrel készült. Minden sémát a ChemDraw Professional 16.0 szoftverrel és a CorelDRAW X7 szoftverrel készítettünk.
Beszámoló összefoglaló
A kutatás tervezésével kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.