Convex Arrhenius plot and their interpretation

Abstract

この論文は、酵素触媒反応において、非常にまれな凸のアレニウスプロットを示す実験を選び、Tolmanの活性化エネルギーの解釈が、これらの反応の詳細な説明に対して、モデルに依存しない基本的制約を置いていることに注目するものである。 ここで示された解析は、このような系では、エネルギーの関数としての反応速度係数は、予想以上にゆっくりと増加するだけでなく、実際には減少していることを示している。 つまり、凸のアレニウスプロットを持つ反応の成功したモデルは、ミクロカノニカルな速度係数がエネルギーの減少関数であることと一致しなければならないという制約を与える。 この解析が酵素機構の解釈に対して持つ意味と限界について議論する。

耐熱性および中安定性の様々なデヒドロゲナーゼおよび酸化酵素によって触媒される反応の実験から、化学段階のアレニウスプロットは場合により凸型を示すことが分かっている（20-23）。 本論文では、この観測の意義についてコメントし、この発見を生物化学的だけでなく非生物化学的なキネティックスという広い視野で捉えた解釈を提供するものである。 この論文では、凸のアレニウス型挙動が、化学的ステップの微視的な単分子速度係数に厳しい制約を与えることを指摘している。 特に、凸のアレニウスプロットは高温で予想される速度より低いと解釈できるという明白な解釈を超えて、ある条件下では、化学ステップの微小正則な単分子速度係数はエネルギーの増加とともに実際に減少しなければならないと言える。

一般に、実験データの解釈は2ステップに分けることが望ましい。 まず、熱力学や統計力学の一般原理などの強固な基礎の上に成り立つ一般的な結果を推論する。 次に、より微視的に詳細なモデルを構築していくが、これはあまり確実ではない。

文献の反応における印象的な特徴は、その反応にある。 ここで議論する20-23の反応の顕著な特徴は、そのアレニウスプロットの正の凸性Cであり、1 k(T) は触媒反応速度係数、Tは温度である。 2と書き、3 Eaは活性化の温度依存の現象論的エネルギー、Rは気体定数である。 従って正の凸はEaが温度の上昇とともに減少することを意味する。 酵素動力学に限らず、広い分野の動力学において、非線形アレニウスプロットが観察される場合、そのほとんどは凹型、すなわちCが負である。 この一般的な結果はトルマンによる活性化エネルギーの解釈で説明され、(25-27)4と書くことができる。 つまり、トルマンの式4は、アレニウスプロットの局所的な傾きの負は、反応する分子の平均エネルギーから、反応しうるすべての物質の平均エネルギーを引いたものに等しいと解釈できることを述べているのである。 熱的に平衡な種の単分子反応の場合。 5 と 6 ここで、Eは全エネルギー、dP/dEは温度Tでの正準アンサンブルで系がエネルギーEを持つ正規化確率密度、k（E）はエネルギーEでの微準アンサンブルの単分子速度係数である。§ k(E)は通常エネルギーの増加関数であるため、温度上昇に伴いEはĒより急速に増加する。 凸のアレニウスプロットは、温度が上昇するにつれてE̿が減少するか、Ēよりも急速に増加しないことを意味し、次の段落では、これは通常、式6の積分を支配するエネルギーの領域にわたって、k（E）がエネルギーの増加とともに減少することを意味すると主張する

一つは、温度が上昇するとE̿が減少し、Ēより急速に増加しないことについてより正確に説明することができます。 7 ここでβは1/RT、ρ（E）は状態密度であり、式4〜6を用いることにより、8 したがってdEa/dTが負であるという記述は、反応エネルギーの分布が反応体エネルギーの分布より狭いという記述と同じであることが容易に示される。 もしdP/dEがĒについて対称であれば、dEa/dTの符号はその符号だけでなく、関数k（E）の形状に依存することになる。 しかし、dP/dEは実際には非常に歪んだ関数である。 典型的な分子では、その形状は、式7中のρ(E)をEn-1とし、nを自由度数とほぼ等しくすることで近似できる(31)。 この形を仮定し、さらにk(E)が式6の積分の重要な範囲でゆっくりと直線的に変化すると仮定すると、式8の右辺がdk/dEに正の比例定数で比例することが示される。 より複雑なk(E)関数では、もはや厳密な比例はないが、dP/dEの正の偏りによって効果の方向が確定する。 dEa/dT と dk/dE の符号の一致は数学の定理ではないが、正常な状態密度と滑らかな k(E) 関数に対して成り立つと考えられる。

この結果はあらゆる微視的解釈に対する制約を与えるとともに、同様に重要なことに、新しい微視的解釈も示唆している。 例えば、反応物の配置空間が2種類のコンフォーメーションに分割され、一方（R型と呼ぶ）は速度係数kR（E）で反応し、他方（N型と呼ぶ）は速度係数ゼロで非反応であると仮定する。 ここでPR(E)はエネルギーEを持つ系がタイプRのコンフォメーションにある条件付き確率である。これはk(E)がEとともに減少する、すなわちPR(E)がEとともにkR(E)の増加より速く減少する機構を提供するものである。 これは、エネルギーが高い系ほど位相空間の広い領域を訪れるため、一つの拘束された領域で過ごす時間が少なくなるために起こる可能性がある。 この解釈は、酵素学において特に重要であると思われる。 近年、酵素触媒作用におけるコンフォメーションサンプリングの役割を理解するための研究がいくつか行われている(17, 18, 22, 32-37)。 Bruice と Benkovic (17) は、最近のレビューで、酵素複合体によってサンプリングされた活性配座は、一般的なコンフォーマー集団よりも高いエネルギーではなく、これらのコンフォーマーの人口が反応速度を決定する可能性があると論じた。 引用した論文にあるような詳細なモデルとは対照的に、本解釈では、熱励起した酵素の揺らぎによって促進されるトンネル現象（11、13、38、39）、コンフォメーション上の適切なサンプルを含む活性化自由エネルギー計算（40）、あるいはコンフォメーションの柔軟性が異なるミクロ状態間の遷移に関する特定のメカニズムなど特定のミクロな分子機構やモデルには言及せず、ごく一般的な根拠に基づいている（41-44）。 しかし、低Tで剛直なタンパク質や、特定の低エネルギー振動状態の集団を必要とする動的な運動など、より具体的な解釈にも対応できることは明らかである。 しかし、ここで述べたことは、そのようなモデルを具体的に支持するものではない。その妥当性は、さらなる実験や詳細なシミュレーションによって検証されるべきものである。 また、今回の議論では、遷移状態理論の破綻に伴う効果については特に言及しなかった。 トンネル効果などの量子効果はk(E)やkR(E)に含めるだけで対応できる。

我々の解析では、上記の好熱性アルコール脱水素酵素ADH-hTの結果（22、32）を、温度を変えたときのE̿とĒの相対変化で解釈することができる。 好熱性酵素は、その生理的ニッチ、すなわち高温で機能するように進化してきたため、室温では活性が低い（場合によっては、生理温度での活性化エンタルピーから予想されるよりもさらに低い）、という仮説が広く提唱されている。 今回の解析は、この考え方と、活性型と非活性型のコンフォーメーションの同定に関わる計算との間に関連性を与えるかもしれない（16, 17）。 例えば、Wrbaら（21）は、融点の異なる酵素について、アレニウスプロットにおける最大曲率の温度の差が融点の差に近いという経験則を報告している。 これは、変性と活性の転移温度で重要となる範囲のPR(E)とkR(E)のEに対する依存性のシフトと関係があると考えられる。 もう一つの例として、最近、「C-H結合切断反応では、熱エネルギーの低周波タンパク質モードへの分配が主要な要因であることは、おそらく驚くべきことではない」と示唆されたことに注目したい。 これらのモードは常温で著しく励起され、C-H伸縮モードとは対照的に、そのゼロ点エネルギーレベルに大部分が閉じ込められると予想される」(22)。 このような考察は E̿と Ēの温度依存性、したがってアレニウスプロットの凹凸に関係する。

ミクロカノニカル速度係数のエネルギー依存性についての一般的結論は、他の研究で時々見られるアレニウスプロットの凹凸にも適用可能である。 これらの議論を適用する場合、凸のアレニウスプロットが内部で平衡化された反応物による真の素反応を表していることを確認するよう注意しなければならない。 例えば、プロトタイプの定常問題10において11と12ではk1、k-1、k2には適用できるがkには一般に適用できない。しかしk-1とk1がk2よりずっと大きければ、kはA→Cの初等速度係数となり、速度を決定する段階の前に平衡をとっても何も結論は変らない。 これはさらに、k2がk1やk-1よりはるかに大きい場合にもあてはまり、kはk1となる。 定常状態のアプローチが適用できる特殊なケースとして、Aが未結合の反応物と酵素、状態Bがミカエリス複合体、状態Cが生成物に相当するものがあります(45)。 この場合、k1（式12）は2次の速度定数となり、Michaelis方程式が導かれることに注意。 13 ここで、反応物（基質）濃度、VmaxはKMよりはるかに高い反応速度で、式10のミカエリス定数、（k2 + k-1）/k1である。 この議論は、反応速度決定段階の変化や有効酵素濃度の変化による有効速度係数や、ガラス形成によるヒステリシスを伴う速度係数には当てはまらない。 この点は、酵素反応において特に強調すべき点である。測定された速度は、実際に全温度範囲にわたって意味のある一貫した速度定数を表しているか？ 例えば、Bacillus stearothermophilus 由来の好熱性アルコール脱水素酵素 (ADH-hT) の凸 Arrhenius プロットの初期の報告では、すべての測定は同じ基質濃度（それは室温で酵素を飽和させていた）で行われ、Vmax が示された (47). その後の報告(22)では、KMは温度とともに増加するため、高温ではKMより十分に大きくならず、測定速度はVmaxより遅く、一見凸のアレニウスプロットを示すことが判明した。 最も単純で現実的な酵素動力学であっても、機構10は生成物放出ステップによって増強されるべきであり、触媒作用への関与と触媒作用の比率を十分に考慮してデータを解析すべきである（48、49）。さもなければ、測定したkcatは固有のk2とは異なる温度依存性を示す可能性がある。 文献 20-24 は、アレニウスプロットが温度の関数として単一の律速素反応ステップに対応することを確認し、実証するために特別な注意が払われた例として選ばれている。 RubachとPlapp（未発表の結果の私信）は、例えば、ウマ肝臓のアルコール脱水素酵素によって触媒される反応を研究するために、ストップドフロー前定常状態技術を使用して、微視的速度定数のKIEを測定しました。 彼らは、水素化物と重水素化物の移動に凸のアレニウスプロットを見出したが、KIEに温度依存性はなく、速度決定ステップの変更が結果に影響を与える可能性はないことを実証した。 さらに、不可逆的に融解したタンパク質や部分的に融解したタンパク質を許容する温度範囲のケースは除外した。 単一の素過程を含む凸のアレニウス挙動を示す酵素の例とは対照的に、凸のアレニウス挙動が観察されているが、素過程が特定されていない、あるいは特定できない薬剤の皮膚透過の例を挙げる（50, 51）。 皮膚からの浸透と比較するために、非晶質固体における拡散の非アレニウス温度依存性という、より明確に定義されたケースが、多段階サイトホッピングモデルによってモデル化されていることにも言及する（52、53）。 Limbach は、エチルメチルエーテルに溶解した 1,3-bis-(4-fluorophenyl)-triazene の塩基触媒による分子内プロトン移動について、凸状の Arrhenius プロットを観測した（未発表の結果について私信を得た）。 反応速度係数は、水素結合の異なる反応物、特に遊離分子と塩基との複合体の平均を表している。 プロトンの移動は錯体中で行われる。 凸のアレニウス曲率は、分子が高温でプロトン移動の障壁が大きい非複合体に変化することから生じる（文献55およびH. H. Limbach, personal communication）。 このように、速度係数は単一の素過程を表すものではないので、Tolman解釈は厳密には当てはまらない。 どちらかの反応形式から別々に得られるアレニウスプロットは、おそらく準線形か凹状になるはずである。 しかし、異なる水素結合形態が単一の反応物のコンフォーマーであると考えれば、Tolman解釈は適用可能であり、本質的に反応しないコンフォーマーを含む広い位相空間領域を探索するため、高エネルギーでよりゆっくりと反応する分子の例証となる。 同様に、Masseyら(23)は、凸型アレニウスプロットの説明として、それぞれが異なる温度領域で支配的な、2つの競合する酵素形態が関与している可能性を示唆している。 このモデルは、今回示したモデル非依存的な結果と一致する可能性のあるモデルの一例である。 非生物学的反応では、特に反応性の高い配位が高エネルギー種になることが多いと予想される。 酵素は最もエネルギーの低い状態（すなわち、常温で最もアクセスしやすい状態）が反応するように特異的に進化したため、温度が上昇しても E̿が低くなるため、生物系では凸のアレニウスプロットがより一般的になる可能性がある。 このようなケースは、前述の皮膚浸透の問題のように、複数の並行経路があるために複雑であるが、それでも詳細な解析が可能である。 広く引用されている説明の一つは、低温液体中の分子はかなりのポテンシャル障壁を越えることによって拡散するが、高温では拡散運動はほとんど自由であるというものである(24, 56)。 このモデルでは、温度が上昇するにつれて、熱エネルギーが障壁の高さに比べて大きくなることを認識している。凸のアレニウスプロットに必要なのは、遷移（この場合、ある局所最小から別の局所最小への拡散ホップ）を起こす分子の平均エネルギーが、すべての分子の平均エネルギーよりもゆっくり上昇することである。 準安定流体やガラスにおける非アルレニウス的挙動については、Tolmanの解釈（58）の観点から活性化エネルギーの温度依存性を明示的に扱わない詳細な理論が数多く存在するが、局所平衡素反応速度係数の観点から凸のアレニウスプロットを矛盾なく説明することは、たとえそれが明示されていないとしても、認識さえされていなくても、何らかの基礎レベルでTolmanの結果と矛盾してはならないのである。

以上、本論文は、アレニウスプロットの凸の観察によって提供されるが、これまで明らかに解釈されていなかった基本的なミクロカノニカルな情報を指摘した。 この解析は広く応用可能であり、遷移を起こす系の平均エネルギーについて、モデルに依存しない明確な予測を行うものである。 この結果は、凸のアレニウスプロットが観測されるすべての分野の反応速度論（酵素、大気化学、クラスター反応など）に関連しているため、この現象を示す具体例として、耐熱性およびメソ安定性のデヒドロゲナーゼおよび酸化酵素触媒の最近の実験を引用しつつ、できるだけ一般的なプレゼンテーションを行いました。 また、拡散の理論との関連も持たせた。 本論文で主張した視点が、反応速度、触媒作用、拡散に関する新しい考え方に刺激を与えることを期待している。

Footnotes

• ↵ E-mail: truhlar{at}umn.edu and amnon-kohen{at}uiowa.edu.

• This paper was submitted directly (Track II) to the PNAS office.This paper was manufactured directly (Track II) the PNAS office.

• ↵§ カノニカルアンサンブルとは、ある温度によって特徴づけられるものであり、マイクロカノニカルアンサンブルとは、カノニカルアンサンブルから切り出した、与えられた全エネルギーですべての系を含むスライスと考えることができることを想起してください。 Ea、E̿、Ē、およびdP/dEはすべてカノニカルアンサンブルに関連しており、したがってTの関数であり、dP/dEはボルツマン加重状態密度に正規化定数をかけたものに等しいことに注意してください（28）。

• ↵¶マイクロカノニカル速度係数は、反応が完全に反応物基底状態のトンネルによって起こる極低温を除いて、オーバーバリア領域とトンネル領域の両方で通常エネルギーとともに増加する（29, 30）。

略称

KIE, Kinetic isotope effect