2 Levensgeschiedenis
FBF cercariae zijn minuscuul, zijn morfologisch moeilijk te identificeren, en hebben doorgaans een extreem lage prevalentie van infectie onder ongewervelde tussengastheerpopulaties (Cribb et al., 2011). Misschien als gevolg van deze eigenschappen is de tussengastheer onbekend voor alle FBF-soorten op enkele na: verschillende soorten van het zoetwatergenus Sanguinicola (zie Bullard en Overstreet, 2008) en de mariene soorten Aporocotyle simplex (zie Køie, 1982; Køie en Petersen, 1988, experimentele infecties; geen moleculaire merkers toegepast), Paracardicoloides yamagutii (zie Nolan en Cribb, 2004a; zie volgende tekst), C. forsteri (zie Cribb et al, 2011; zie volgende tekst), en Cardicola opisthorchis (zie Sugihara et al., 2014; zie volgende tekst). ITS2 rDNA sequenties zijn gebruikt om morfologisch onbepaalde larvale FBF specimens, d.w.z. cercariae, sporocysten, en rediae, verzameld bij ongewervelde gastheren, te matchen met morfologisch onderscheidende volwassen specimens van sympatrische visgastheren. Moleculaire merkers zijn snel en goedkoop en maken een snelle opsporing van infecties mogelijk; identificatie van het infectieuze agens, door fylogenetische gevolgtrekking of door sequentiehomologie met een reeds gesequenteerd taxon; en identificatie van tussengastheren, waardoor levensstadia van potentieel pathogene FBF’s met elkaar in verband worden gebracht. Het bepalen van de identiteit van tussengastheren en eindgastheren is zeker een kritische eerste stap in het begrijpen van de levenscyclus van FBF’s. Naast diagnostische benaderingen moet er echter nog veel geleerd worden over specifieke details van de gastheer-parasiet relatie tussen FBFs en hun polychaete, gastropode en tweekleppige tussengastheren. Hun evolutionaire geschiedenis kan immers evenzeer, of zelfs nog meer, beïnvloed worden door deze tussengastheren als door hun eindgastheren. Als dusdanig stellen wij dat moleculaire studies de klassieke experimentele studies, die directe microscopische waarnemingen doen van larvale en volwassen FBFs in gastheerweefsels na blootstelling van naïeve ongewervelde en definitieve visgastheren (Køie, 1982), niet volledig mogen verdringen.
Veel van de informatie over de levenscycli van FBFs is afkomstig van programma’s voor de gezondheid van aquatische dieren, gekoppeld aan commerciële aquacultuur: 17 van de 109 (16%) beschikbare FBF-sequenties in de GenBank zijn afkomstig van infecties in de mariene aquacultuur (tabel 1.1). FBF’s vormen een van de weinige trematodengroepen waarvan de leden schade kunnen toebrengen aan de eindgastheer als volwassen dieren die bloedvaten afsluiten en verstikking veroorzaken, als eitjes die kieuwepithelia en vertakkingsvaten beschadigen of verstoppen, en als miracidia die uitkomen uit eitjes die ingebed zijn in kieuwepithelium en zich uit de vis boren (Bullard en Overstreet, 2002, 2008). Hun levenscycli zijn dan ook van belang voor commerciële aquacultuurbedrijven omdat FBF’s vissen kunnen doden of verzwakken en economische verliezen kunnen veroorzaken in zoetwatervijvers, raceways en offshore mariene kooien. Sequenties afkomstig van niet-volwassen FBFs die gastropoden, tweekleppigen en polychaeten infecteren, die de asexuele voortplantingsstadia van FBFs herbergen – sporocysten, rediae en cercariae – zijn veel minder talrijk (4 van 109) (tabel 1.1) dan die van volwassen specimens die visgastheren infecteren.
In de eerste gepubliceerde studie naar de levenscyclus van FBF, bepaald door de toepassing van een moleculaire methode, documenteerden Nolan en Cribb (2004a) twee cercariamorfotypen (“type A” en “type B”) die 80 van 11.314 (0,7%) specimens van de hydrobiide gastropode Posticobia brazieri infecteerden in de getijde-kreken van Queensland, Australië. ITS2 rDNA-sequenties van cercaria type A kwamen overeen (100% overeenkomst) met volwassen specimens van P. yamagutii die werden verzameld uit het bloed (de dorsale aorta, het atrium, het ventrikel, de kieuwen, de nieren en de bloedvaten van de darm en de zwemblaas) van gespikkelde langvinaaltjes Anguilla reinhardtii. In een andere studie hebben Cribb et al. (2011), als reactie op de bezorgdheid over ziekten die in verband worden gebracht met infecties van C. forsteri die gekweekte zuidelijke blauwvintonijn T. maccoyii voor de kust van Zuid-Australië infecteren, 9351 individuen van 11 tweekleppige, 2 gastropode en 24 polychaete families gescreend op FBF-infecties. ITS2 rDNA-sequentiegegevens afkomstig van cercaria die Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) infecteerden, kwamen 100% overeen met volwassen specimens van C. forsteri uit het hart van nabijgelegen zuidelijke blauwvintonijn in een netkooi in Port Lincoln, Australië. Zij hebben ook het 28S rDNA fragment (721 bp in D1-D2 regio) gesequeneerd van cercaria van C. forsteri die L. modestus hebben geïnfecteerd. In navolging van de aanpak van Cribb et al. (2011) richtten Sugihara et al. (2014) zich op polychaeten bij het onderzoeken van 744 ongewervelde dieren op FBF-infecties in een kweekplaats van de Pacifische blauwvintonijn Thunnus orientalis, voor de kust van Zuid-Japan. Sporocysten en cercaria van FBF’s werden gevonden in vijf individuen van een terebellide polychaete (Terebella) verzameld uit de schelp van dode zeepokken die van het substraat en van touwen en drijflichamen onder de zeekooi werden gehaald. ITS2- en 28S-sequenties van sporocysten waren identiek (100%) aan die van volwassen exemplaren van C. opisthorchis uit het hart van gekweekte Pacifische blauwvintonijn.
Shirakashi et al. (2012) onderzochten gelijktijdige infecties van Cardicola orientalis en C. opisthorchis in Pacifische blauwvintonijn. Zij gebruikten ITS2 rDNA-sequentiegegevens om de halvemaanvormige eitjes van C. opisthorchis in de afferente filament slagader te onderscheiden van de eivormige eitjes van C. orientalis die de kieuwlamellen infecteren. Zij stelden dat soortspecifieke PCR-primers toegepast op kieuwweefselmonsters de histopathologie kunnen aanvullen en infecties kunnen helpen diagnosticeren voordat de eitjes en adulten talrijk genoeg waren om gemakkelijk met lichtmicroscopie te kunnen worden waargenomen. Yong et al. (2013) gebruikten volledige ITS2 rDNA-sequentiegegevens om de eieren van FBF die zich in de kieuwen van vijf soorten vlindervissen (Perciformes: Chaetodontidae) uit het Groot Barrièrerif hadden genesteld, te identificeren als één enkele soort Cardicola chaetodontis (één enkel basenpaar verschil in twee monsters). FBF-eitjes worden niet zelden waargenomen in het kieuwepitheel en de arteriolen van de vertakkingen van vissen tijdens routinematige necropsies van vissen (SAB, persoonlijke waarnemingen), maar in veel gevallen worden de overeenkomstige volwassen exemplaren die het bloed van de individuele vissen infecteren niet teruggevonden. Moleculaire technieken die op doeltreffende wijze DNA extraheren en amplificeren uit de minuscule eitjes van FBF (de eitjes van C. chaetodontis zijn bijvoorbeeld 40-60 μm lang) beloven de aanwezigheid aan het licht te brengen van niet met name genoemde soorten FBF en tot dusver niet gedocumenteerde gastheren, als de resulterende sequenties in een fylogenetische context worden geplaatst met sequenties van met name genoemde soorten. Hetzelfde kan worden gezegd van sequenties afgeleid van cercariae (zie volgende tekst). Met behulp van kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) hebben Norte Do Santos et al. (2012) de eitjes van C. forsteri geïdentificeerd die zich hebben verzameld in de kieuwen van gekweekte zuidelijke blauwvintonijn. Kirchhoff et al. (2012) pasten deze methode toe om eieren van C. forsteri te diagnosticeren die T. maccoyii infecteren. Polinski et al. (2013) gingen een stap verder door een gevoelige en nauwkeurige real-time PCR-techniek te ontwikkelen die ook kan worden gebruikt voor de identificatie van C. forsteri, C. orientalis, en C. opisthorchis in niet-dodelijke monsters. Bij geen van beide geteste methoden, d.w.z. SYBR-gebaseerde qPCR en een gemeenschappelijke reporter TaqMan assay, werd kruissoort- of gastheergenomische amplificatie gedetecteerd; hun gecombineerde toepassing verbeterde echter de betrouwbaarheid om de soorten te onderscheiden. Deze methoden hebben gelijktijdige infecties van C. forsteri en C. orientalis in T. maccoyii bevestigd, wat ook wijst op de hogere prevalentie en verspreiding van C. orientalis in de gastheer.
Recentelijk werd het nut van beide ontwikkelde technieken ondersteund om de pathologische gevolgen van FBF-infecties te beoordelen. Polinski et al. (2014) combineerden qPCR met gastheer-gen immuun transcriptie om de hoeveelheden DNA te kwantificeren van weefsels geïnfecteerd door C. opisthorchis en C. orientalis. Zij kwantificeerden ook de temporele gastheer immuunrespons op deze infecties in gekooide Pacific blauwvintonijn. Eerdere gegevens documenteerden volwassenen en eieren van C. orientalis in de kieuwen (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), terwijl volwassenen en eieren van C. opisthorchis respectievelijk het hart en afferente vertakkingsslagaders infecteerden (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). De resultaten van Polinski et al. (2014) toonden echter een correlatie aan van IgM-transcriptie met de hoge hoeveelheden “enkel C. orientalis”-infecties in het kieuwweefsel, maar niet met het DNA van C. opisthorchis, wat suggereert dat een dergelijke immuunrespons in dit orgaan eerder door de aanwezigheid van adulten dan van eitjes zou kunnen worden uitgelokt. Bovendien werden hoge DNA-niveaus van C. orientalis in het hart toegeschreven aan de aanwezigheid van juveniele flukes. Hoewel dergelijke methoden de levensstadia van de FBF niet kunnen identificeren en evenmin kunnen aangeven of de zuigwormen levend of dood zijn, maakt deze kwantitatieve benadering gissingen mogelijk over infectie-intensiteit en infectiestatus, wat op zich een veelbelovend instrument is voor toekomstige epidemiologische studies met wilde of gekweekte vissen.
Brant et al. (2006) gebruikten fylogenetische gevolgtrekking (28S, 18S, en COI) bij de behandeling van verschillende niet-geïdentificeerde vermeende FBF cercariae geïsoleerd uit gastropoden (Planorbidae en Thiaridae) in Oeganda, Kenia, en Australië. Zij hebben de cercariae morfologisch gekarakteriseerd met fotomicrofoto’s en op basis van de aan- of afwezigheid van oogvlekken, vinplooien op de cercariastaart en het lichaam, en de staartvorm. Hoewel een consistente en fylogenetisch coherente, op morfologie gebaseerde definitie (diagnose) van FBF cercariae ontbreekt, zijn deze cercariae typisch kenmerkend: minuscuul, gevorkte staart, zonder ventrale zuignap, met een kenmerkend penetrerend orgaan dat waarschijnlijk bestaat uit een gespecialiseerde anterieure zuignap (Truong en Bullard, 2013), een vinplooi op het cercarialichaam, en een al dan niet aanwezige vinplooi op de staartvoorkaken (Cribb et al., 2011). Eén van deze cercariën (W5004) was morfologisch bijzonder bizar, namelijk beschreven als afaryngeate en furcocercous maar met “extravagante laterale staartvliezen en een puntige lichaamsvorm”, en geen van deze cercariën had alle typische kenmerken van FBF cercariën (zie voorgaande tekst). De gecombineerde 18S- en 28S-analyse van deze cercariae bracht ze echter samen met andere FBF-sequenties (wij veronderstellen dat “Sanguinicolid sp.” die van “Sanguinicola cf. inermis” (AY222180) is). Om die reden en omdat ze morfologisch bizar waren in vergelijking met bekende FBF cercariën, stelden deze auteurs dat er een veel grotere morfologische diversiteit van FBF cercariën bestaat dan tot nu toe in de literatuur is onderkend. De taxonomische identiteit en de fylogenetische betekenis van deze sequenties worden verder in de tekst besproken.