Ossidazione anaerobica dell’ammonio: From Laboratory to Full-Scale Application

Reazioni coinvolte nella realizzazione del processo anammox. Alcune caratteristiche uniche rendono il processo anammox una tecnica promettente e sostenibile, come il basso rendimento della biomassa, nessuna necessità di aerazione e nessuna aggiunta di fonti di carbonio esterne. Mentre il processo anammox appena scoperto apre nuove possibilità per la rimozione dell’azoto dalle acque reflue, l’ostacolo principale per l’attuazione di anammox è il lento tasso di crescita (, tempo di raddoppio () di 11 giorni) dei microrganismi anammox, rendendo questo processo difficile per i trattamenti pratici delle acque reflue. Nel frattempo, i batteri anammox sono stati estremamente difficili da coltivare in coltura pura, anche Candidatus Brocadia anammoxidans è stato purificato solo per omogeneità apparente da centrifugazione Percoll densità. Al fine di soddisfare l’applicazione pratica del processo anammox, i ricercatori si concentrano sull’arricchimento dei batteri anammox a crescita lenta. Molti studi sono stati condotti per arricchire gli organismi anammox, sia con metodi diversi come il biofilm o la granulazione, sia con tutti i tipi di reattori. Questo articolo passa in rassegna lo sviluppo del processo anammox e i relativi studi in laboratorio, in particolare la scoperta e la biochimica dei batteri responsabili dell’ossidazione anaerobica dell’ammonio. Particolare attenzione è stata dedicata alla commercializzazione e all’applicazione su larga scala della tecnica anammox.

2. Scoperta e filogenesi dell’anammox

Già nel 1932, fu riportato che il gas dinitrogeno era generato attraverso un meccanismo sconosciuto durante la fermentazione nei sedimenti del lago Mendota, Wisconsin, USA. Più di 40 anni fa, Richards ha notato che la maggior parte dell’ammonio che dovrebbe essere prodotto durante la remineralizzazione anaerobica della materia organica non era contabilizzato. Poiché non esisteva un percorso biologico noto per questa trasformazione, l’ossidazione biologica anaerobica dell’ammonio ha ricevuto poca attenzione. Tre decenni fa, l’esistenza di due microrganismi chemolitoautotrofi in grado di ossidare l’ammonio a gas dinitrogeno è stata prevista sulla base di calcoli termodinamici. Si pensava che l’ossidazione anaerobica dell’ammonio non sarebbe stata fattibile, supponendo che i predecessori avessero provato e fallito a stabilire una base biologica per quelle reazioni. Negli anni ’90, le fantastiche osservazioni di Arnold Mulder erano solo coerenti con il suggerimento di Richards. Nel loro reattore pilota anossico denitrificante, l’ammonio scompariva a spese dei nitriti con una chiara produzione di azoto. Il reattore utilizzava l’effluente di un reattore pilota metanogeno, che conteneva ammonio, solfuro e altri composti, e il nitrato di un impianto di nitrificazione come influente. Questo processo fu chiamato “anammox”, e la gente si rese conto che aveva una grande importanza nella rimozione dell’ammonio indesiderato. Anche senza una piena comprensione della reazione anammox, Arnold Mulder brevettò immediatamente il processo. La scoperta del processo anammox fu presentata pubblicamente per la prima volta al 5° congresso europeo sulla biotecnologia. A metà degli anni ’90, la scoperta dell’anammox nel reattore a letto fluido è stata pubblicata. È stato raggiunto un tasso massimo di rimozione dell’ammonio di 0,4 kg N/m3/d. Fu dimostrato che per ogni mole di ammonio consumata, erano necessarie 0,6 mol di nitrato, con conseguente formazione di 0,8 mol di gas N2 (nella tabella 1). Nello stesso anno, fu identificata la natura biologica dell’anammox. Esperimenti di etichettatura con 15 in combinazione con 14 hanno mostrato che era il prodotto dominante, costituendo il 98,2% del totale etichettato N2. Questi risultati erano in conflitto con la reazione 1 in cui la percentuale di e nel gas dinitrogeno formato sarebbe 75% e 25%, rispettivamente. Si è capito che, invece del nitrato, il nitrito è stato assunto come agente ossidante dell’ammonio nella reazione anammox (nella tabella 1). Sulla base di uno studio precedente, Strous et al. hanno calcolato la stechiometria del processo anammox attraverso il bilanciamento della massa (nella tabella 1), che è ampiamente accettato da altri gruppi. Più tardi, i batteri anammox sono stati identificati come planctomiceti, e il primo organismo anammox identificato è stato chiamato Candidatus “Brocadia Anammoxidans”. Prima del 2002, l’anammox era considerato un attore minore nel ciclo N all’interno degli ecosistemi naturali. Nel 2002, si è scoperto che l’anammox svolge un ruolo importante nel ciclo biologico dell’azoto, rappresentando il 24-67% della produzione totale di N2 nei sedimenti della piattaforma continentale che sono stati studiati. A livello globale, l’anammox può essere responsabile del 30-50% della produzione di N2 nell’oceano. La scoperta del processo anammox ha modificato il concetto di ciclo biologico dell’azoto come illustrato nella figura 1.

Figura 1

Il ciclo biologico dell’N (basato in parte su Arrigo). DNRA, riduzione dissimilatoria del nitrato ad ammonio.

Il colore rosso specifico dei batteri anammox (Figura 2(a)) è dovuto al gruppo eme c della proteina citocromo c che gioca un ruolo importante nel metabolismo anammox . Le forme irregolari dei batteri anammox sono state visualizzate sia dalla microscopia elettronica a trasmissione che dalle immagini della microscopia elettronica a scansione (Figure 2(b) e 2(c)). Le specie anammox hanno un singolo anammoxosoma legato alla membrana e un riboplasma con particelle simili al ribosoma separate dal parifoplasma da una membrana intracitoplasmatica. Le cellule contengono tre compartimenti distinti legati alla membrana: il parifoplasma, il citoplasma e l’anammoxosoma.

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Figura 2

Il colore rosso specifico dei batteri anammox (a), le forme irregolari tipiche dei batteri anammox visualizzate dalla microscopia elettronica a scansione (b), e le immagini della microscopia elettronica a trasmissione (c).

Ad oggi, sono stati scoperti cinque generi di anammox, con identità di sequenza del gene 16S rRNA delle specie che vanno dall’87 al 99%. È noto che tutti i batteri anammox appartengono allo stesso ordine monofiletico chiamato Brocadiales e sono correlati ai Planctomycetales. Tra questi, quattro generi di anammox “Candidatus” sono stati arricchiti dai fanghi attivi: “Kuenenia”, “Brocadia”, “Anammoxoglobus” e “Jettenia”. Il quinto genere anammox, “Candidatus Scalindua”, è stato spesso rilevato in habitat naturali, soprattutto nei sedimenti marini e nelle zone di minimo ossigeno.

3. Possibili meccanismi di reazione per l’anammox

Per comprendere la possibile via metabolica dell’anammox, nel 1997 sono stati condotti per la prima volta esperimenti di etichettatura con 15N. Questi esperimenti hanno mostrato che l’ammonio è stato biologicamente ossidato con idrossilammina, molto probabilmente derivata dal nitrito, come probabile accettore di elettroni. La conversione dell’idrazina in gas dinitrogeno è postulata come la reazione che genera gli equivalenti elettronici per la riduzione del nitrito in idrossilammina. In generale, sono stati affrontati due possibili meccanismi di reazione. Un complesso enzimatico legato alla membrana converte prima l’ammonio e l’idrossilammina in idrazina, seguito dall’ossidazione dell’idrazina a dinitrogeno gassoso nel periplasma. Allo stesso tempo, il nitrito è ridotto a idrossilammina nel sito citoplasmatico dello stesso complesso enzimatico responsabile dell’ossidazione dell’idrazina con un trasporto interno di elettroni (Figura 3(a)). Un altro possibile meccanismo per il processo di anammox è concluso come segue: l’ammonio e l’idrossilammina sono convertiti in idrazina da un complesso enzimatico legato alla membrana, l’idrazina è ossidata nel periplasma a dinitrogeno gassoso, e gli elettroni generati sono trasferiti attraverso una catena di trasporto di elettroni all’enzima di riduzione dei nitriti nel citoplasma dove il nitrito è ridotto a NH2OH (Figura 3(b)). Se la riduzione del nitrito e l’ossidazione dell’idrazina avvengano in siti diversi dello stesso enzima (Figura 3(a)) o se le reazioni siano catalizzate da diversi sistemi enzimatici collegati attraverso una catena di trasporto degli elettroni (Figura 3(b)) rimane da investigare. La presenza di idrazina come intermedio nel metabolismo microbico dell’azoto è rara. L’idrazina è stata proposta come un intermedio legato all’enzima nella reazione nitrogenasi.

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Figura 3

Possibile percorso biochimico e localizzazione cellulare dei sistemi enzimatici coinvolti nella reazione anammox. Figura modificata, con permesso, da FEMS Microbiology Reviews and Process Biochemistry.

Un possibile ruolo di NO o HNO nell’anammox è stato proposto da Hooper et al. attraverso la condensazione di NO o HNO e ammonio su un enzima legato alla famiglia delle monoossigenasi dell’ammonio. L’idrazina o l’immina formata potrebbe poi essere convertita dall’enzima idrossilammina ossidoreduttasi in gas dinitrogeno, e gli equivalenti riducenti prodotti nella reazione sono necessari per combinare NO o HNO e ammonio o per ridurre il nitrito a NO. L’analisi genomica ambientale della specie Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, attraverso un meccanismo di metabolismo leggermente diverso e complementare, ha postulato che NO sia l’intermedio invece di idrossilammina (Figura 4) . Ma questa ipotesi concordava anche sul fatto che l’idrazina fosse un importante intermedio nel processo. In questo percorso (Figura 4), ci sono due enzimi unici per i batteri anammox: idrazina idrolasi (hh) e idrazina deidrogenasi (hd). La hh produce idrazina dall’ossido nitrico e dall’ammonio, e la hd trasferisce gli elettroni dall’idrazina alla ferredoxina. Sono stati individuati pochi nuovi geni, come alcuni noti geni della biosintesi degli acidi grassi e dell’enzima radicale S-adenosilmetionina, contenenti domini coinvolti nel trasferimento di elettroni e nella catalisi.

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Figura 4

Piste metaboliche ipotetiche e trasporto inverso di elettroni nell’anammoxosoma. (a) Catabolismo dell’anammox che usa il nitrito come accettore di elettroni per la creazione di una forza motrice protonica sulla membrana anammoxosomica. (b) Il trasporto inverso di elettroni guidato dalla forza motrice protonica combina il catabolismo centrale con la nitrato reduttasi (NAR) per generare la ferredossina per la riduzione del biossido di carbonio nella via dell’acetil-CoA. HAO, idrazina ossidoreduttasi; HD, idrazina deidrogenasi; HH, idrazina idrolasi; NIR, nitrito ossidoreduttasi; Q, chinino. Diamanti azzurri, citocromi; frecce blu, riduzioni; frecce rosa, ossidazioni. Figura modificata, con il permesso, da Nature.

4. Sviluppo del mezzo basale e designato

Una volta che il nitrito è stato realizzato per essere l’accettore di elettroni con ammonio come donatore di elettroni, un mezzo basale contenente ammonio, nitrito, bicarbonato, minerali e oligoelementi è stato sviluppato per l’arricchimento dei microorganismi anammox. Il mezzo conteneva ammonio (5-30 mM) e nitrito (5-35 mM), come unico donatore ed accettore di elettroni, rispettivamente, con bicarbonato (10 mM) come unica fonte di carbonio. Sono stati forniti anche minerali e oligoelementi. La concentrazione di fosfato del mezzo è stata mantenuta al di sotto di 0,5 mM, al fine di evitare il suo possibile effetto inibitorio sul processo, e il mezzo è stato lavato con gas argon per ottenere condizioni anaerobiche. Gli esperimenti condotti in un reattore a letto fluido con mezzo di arricchimento basale hanno mostrato che il tasso di rimozione anaerobica dell’ammonio è aumentato dagli originali 0,4 kg N/m3/giorno a 2,4 kg N/m3/giorno. La massima attività specifica della biomassa nel reattore a letto fluido era di 25 nmol /mg VS/min. Per ogni mol di ammonio ossidato, 0,041 mol di CO2 è stata incorporata nella biomassa. Il tasso di crescita stimato nei sistemi a letto fluido era di 0,001/h, equivalente a un tempo di raddoppio di circa 29 giorni. Il mezzo basale ha migliorato le attività dei batteri anammox.

Lo sviluppo del mezzo basale, la pietra miliare dell’arricchimento anammox, ha acceso il fervente zelo per questa indagine infantile. Da allora, un gran numero di ricercatori si è riversato in questo specifico argomento. Poiché il mezzo mostra effetti positivi sul processo di anammox, molti studi hanno concentrato la loro attenzione su questo settore. Sfortunatamente, non c’è uno studio sistematico di sviluppo del mezzo come quelli per altri batteri.

Nel nostro laboratorio, uno studio è stato condotto verso la progettazione di un mezzo appropriato indagando il requisito di crescita dei batteri anammox rispetto agli aminoacidi. Venti L-amminoacidi sono stati aggiunti al terreno di base (tabella 2). Dopo la serie di esperimenti I, la serie II è stata effettuata per valutare ulteriormente gli effetti potenziati degli aminoacidi selettivi sulla crescita dei microrganismi. Per quantificare la crescita dei batteri anammox, sono state impiegate tecniche molecolari quantitative. Gli esperimenti preliminari hanno indicato che la glicina, la metionina, la treonina, il triptofano e la tirosina hanno migliorato la crescita dei batteri anammox. D’altra parte, l’asparagina, l’acido aspartico e l’istidina hanno leggermente diminuito le attività batteriche. Mentre 12 dei 20 L-amminoacidi (alanina, arginina, cisteina, acido glutammico, glutammina, isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, prolina, serina e valina) hanno totalmente inibito la crescita dei batteri anammox, con conseguente trasformazione del fango da rossastro a nero. Altri 3 aminoacidi (asparagina, acido aspartico e istidina) hanno rallentato la crescita dei batteri anammox. Questo studio inedito gioverebbe allo studio dell’anammox e alla sua applicazione.

5. Cultura Anammox in laboratorio

Il processo Anammox è stato riconosciuto come difficile da applicare per applicazioni pratiche. I batteri anammox crescono in una miscela di popolazioni batteriche, e non sono stati isolati in una cultura pura. I batteri Anammox, essendo strettamente anaerobici e autotrofi, sono difficili da arricchire rendendo l’applicazione di questo processo limitata a causa della non disponibilità di sufficiente biomassa necessaria per il processo. Sono stati impiegati diversi metodi per coltivare e arricchire la biomassa anammox da diversi tipi di fanghi di semi. Una popolazione relativa dell’88% di batteri anammox è stata raggiunta in uno studio batch inoculato da un contattore biologico rotante (RBC) che tratta un percolato di discarica. Cultura di arricchimento dei batteri anammox è stato sviluppato anche in reattori su scala di laboratorio inoculato con sedimenti marini e campioni di terreno di risaia e fanghi attivati da impianti di trattamento delle acque reflue .

Il lento tasso di crescita dei batteri anammox con il tempo di raddoppio approssimativo di 11 giorni è il principale ostacolo per l’attuazione del processo anammox. Un lungo periodo di avvio è quindi previsto nel processo anammox. Accorciare il periodo di avvio del processo anammox riducendo il potenziale di lavaggio della biomassa anammox diventa una strategia importante per l’applicazione su larga scala. Sono stati utilizzati diversi tipi di reattori per ridurre al minimo il dilavamento della biomassa anammox, tra cui il reattore continuo a vasca agitata, il reattore biologico anaerobico filtrato, il reattore a lotti in sequenza (SBR), il reattore upflow e il reattore a biofilm. Una crescita più rapida dei batteri anammox è stata raggiunta in un bioreattore a membrana (MBR) (il tempo di raddoppio era inferiore a 10 giorni), con conseguente purezza senza precedenti dell’arricchimento del 97,6%. La formazione di aggregati compatti è stata riportata per mantenere una grande quantità di biomassa anammox attiva in un reattore. Pertanto, la granulazione è anche un approccio alternativo per l’arricchimento anammox.

In sintesi, ci sono due approcci principali (strategie) per avviare un reattore anammox: (a) avviare un reattore da zero e (b) inocularlo con fanghi anammox altamente arricchiti. Per la prima strategia, la configurazione del reattore è molto importante. La tecnica SBR ha garantito per oltre un anno un funzionamento affidabile in condizioni stabili con un’efficiente ritenzione della biomassa (più del 90% della biomassa è stata mantenuta nel reattore) e una distribuzione omogenea di substrati, prodotti e aggregati di biomassa. L’MBR è stato applicato con successo anche per la coltivazione di batteri anammox con un tasso di crescita veloce (il tempo minimo di raddoppio per i batteri anammox è stato stimato in 5,5-7,5 giorni). Tra i diversi reattori, il reattore a membrana non tessuta anammox (ANMR) è una nuova configurazione di reattore per arricchire la biomassa anammox (Figura 5). Il reattore è stato sviluppato collegando una serie di moduli di membrane non tessute, che servivano anche come porta di scarico, con un reattore anaerobico. Il modulo di membrana è stato installato all’esterno del reattore, il che è diverso dai reattori a membrana immersi. A differenza degli MBR convenzionali, l’acqua di scarico circolava nel modulo a membrana, e i biofilm crescevano sulla superficie interna della membrana. Una grande quantità di biomassa sospesa poteva rimanere nel reattore filtrando attraverso la membrana non tessuta e i biofilm, con conseguente miglioramento della qualità dell’effluente e aumento della ritenzione dei solidi nel reattore. Dopo oltre otto mesi di funzionamento, la purezza (percentuale di cellule anammox nella comunità) dei batteri anammox nel reattore è stata quantificata al 97,7%. Il costo-efficace ANMR ha dimostrato di essere adatto per i batteri anammox a crescita lenta con i seguenti vantaggi: (1) una grande quantità di biomassa potrebbe rimanere nel reattore per filtrazione attraverso la membrana non tessuta e la formazione di biofilm, (2) la formazione di aggregati e biofilm ha migliorato la ritenzione solida nel reattore, (3) la membrana non tessuta era efficiente in termini di costi, e (4) il design del reattore anaerobico potrebbe diluire il mezzo influente ed evitare l’inibizione da alte concentrazioni di nitriti, portando ad una elevata capacità di tolleranza dei substrati. Recentemente, il reattore UASB (upflow anaerobic sludge blanket) è stato altamente raccomandato per la cultura di batteri a crescita lenta. Ciò è dovuto non solo al miglioramento delle condizioni fisiologiche, rendendole favorevoli ai batteri e alle loro interazioni, in particolare ai sinantropi nel sistema anaerobico, ma anche alla formazione di fango granulare, essendo la ragione principale del successo dell’introduzione del reattore UASB. Quindi, la granulazione migliora anche l’applicazione dell’anammox. Sorprendentemente, Ni e i suoi colleghi hanno usato granuli metanogeni inattivi come inoculi per realizzare con successo la granulazione veloce. La concentrazione di nitrito all’inizio era significativamente più alta del livello tossico pubblicato per i batteri anammox e di altri studi su scala di laboratorio. Le sistemazioni e le proliferazioni dei batteri anammox nei granuli metanogenici inattivi potrebbero essere la ragione principale dell’elevata purezza anammox in un breve periodo. Le cellule anammox potrebbero utilizzare lo scheletro dei granuli metanogenici inattivi e proliferare dall’interno come osservato in TEM (Figura 6). Il secondo approccio menzionato in precedenza accorcia significativamente il tempo necessario per l’avvio dell’anammox sotto la premessa di una grande quantità di fango anammox, ma è solitamente limitato dalla mancanza di fango anammox. La costruzione graduale di impianti anammox su larga scala aumenta la disponibilità di fanghi anammox. L’introduzione dei fanghi anammox esotici per seminare un reattore granulare è una buona scelta. Il reattore è stato avviato con successo in due settimane; inoltre, è stata raggiunta un’elevata rimozione di azoto per un lungo periodo, dimostrando che l’inoculazione di granuli di anammox maturi era ideale per avviare un nuovo reattore.

Figura 5

Schema del reattore a membrana non tessuta anammox (ANMR) .

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