Cell culture
Human embryonic kidney 293FT (HEK293) cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin (100 iU per ml; 100 μg per ml). Linie komórkowe nie były uwierzytelnione. Komórki były wolne od mykoplazmy. Komórki inkubowano w nawilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Dla stabilnych linii komórkowych, komórki poddane transfekcji selekcjonowano w obecności puromycyny (3 μg na ml). Do badań transfekcji przejściowej, komórki HEK293 posiewano na płytki 6-dołkowe w obecności wektorów przy użyciu Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Linie komórkowe podocytów utworzono z ludzkiego moczu42 i przeprowadzono genotypowanie APOL1, po uzyskaniu świadomej zgody na podstawie protokołów badawczych (94-DK-0127, 94-DK-0133) zatwierdzonych wcześniej przez NIDDK Institutional Review Board. Przypadek A to mężczyzna G0/G0 z FSGS, przypadek B to mężczyzna G0/G0 z FSGS związanym z HIV, przypadek C to mężczyzna G0/G0 z FSGS (HP55-345O-1), przypadek D to mężczyzna G1/G2 z FSGS, a przypadek E to mężczyzna G1/G2 z FSGS związanym z HIV. Komórki hodowano w RPMI1640 uzupełnionym 10% FBS, ITS i 1% penicyliną/streptomycyną (100 iU na ml; 100 μg na ml). Komórki inkubowano w atmosferze nawilżonej 5% CO2 w 33 °C i różnicowano w 37 °C przez 7-10 dni. Linie komórkowe nie były uwierzytelniane. Komórki były wolne od Mycoplasma. Przed zebraniem lizatów komórkowych, komórki były traktowane 103 U na ml IFNα (Abcam) przez 24-72 h i 100 mM kalikuliną A (LC Laboratories) przez 30 min. Do eksperymentów hamowania PKR, komórki traktowano 1 μM imidazolo-oksindolowym inhibitorem PKR C16 (Sigma Aldrich) przez 1 h43.
Tkanka ludzka
Deidentyfikowane tkanki biopsji ludzkiej nerki uzyskano od dr Preeti Chandra, University of Maryland. Badania zostały wcześniej zatwierdzone przez Institutional Review Boards na Uniwersytecie w Maryland i NIDDK, NIH.
Informacje o plazmidzie
Wektor ekspresji APOL1 G0 składa się z pochodzącego z promotora CMV ludzkiego cDNA APOL1 (NM_001136540: 298-1453). Dla APOL1 G1 (rs73885319 A→G i/lub rs60910145 T→G) i G2 (rs71785313 del) przeprowadzono mutagenezę site-directed, aby je wytworzyć. Dla wektora ekspresyjnego APOL1 pozbawionego ekspresji białka wykonano wstawienie kodonu stop i sekwencji frameshift (TAATAGATGA) po 138. kodonie. Dla wektora mutacji struktury drugorzędowej, oryginalne sekwencje zostały zmienione ośmioma zmianami synonimicznymi (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G, oraz 1242T→C). Dla stabilnego wektora dsRNA G0 oryginalne sekwencje są zmienione przez 5 mutacji w 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Dla RNA flankującego wokół alleli APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453) jako wektora tła użyto pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript). Schematy map wektorowych znajdują się w Supplementary Figure 1.
Immunoblotting
Komórki lizowano w buforze RIPA zawierającym koktajl inhibitorów proteazy/inhibitorów fosfatazy. Lizaty rozdzielano za pomocą elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym, a białka poddawano western blotting i blokowano przez 30 min w buforze blokującym Odyssey (LI-COR). Bloty inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-EIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Aktynie (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), i GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) i p62 (Cell signaling #5114). Bloty inkubowano z barwnie znakowanym przeciwciałem anty-rabbitowym (LI-COR). Wszystkie plamy były obrazowane przy użyciu skanera podczerwieni Odyssey (LI-COR). Surowe obrazy żelu są przedstawione w Supplementary Figure 13.
Reverse transcriptase PCR i ilościowa PCR w czasie rzeczywistym
Komórki lub całkowitą nerkę zebrano w odczynniku TRIzol i wyizolowano całkowite RNA. Całkowite RNA było traktowane DNazą przed syntezą cDNA z oligo (dT). Jedna 5 μg porcja RNA była używana do syntezy cDNA przez odwrotną transkryptazę Superscript II. Próbki były analizowane metodą PCR (RT) lub ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) przy użyciu Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Względną ekspresję w każdej próbce obliczano jako stosunek (attamoles specific gene per β-actin). Pary primerów są wymienione w Tabeli dodatkowej 1.
Test syntezy białek
Transfekowane komórki HEK293 lub ludzkie linie komórkowe podocytów hodowano na płytkach 96-dołkowych i traktowano 103 U na ml IFNα (Abcam) do kwantyfikacji lub szkiełkiem komorowym do wizualizacji. Oznaczenie syntezy (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, nr katalogowy. C10289, Invitrogen) przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Barwienie przeciwjądrowe wykonano przy użyciu Hoechsta. Komórki HEK293 bez wektora traktowane 1 μM puromycyną (InvivoGen, San Diego, CA) zostały użyte jako kontrola negatywna dla tego testu, z tłem ustawionym na 0% intensywności sygnału. Komórki HEK293 z komórkami wektora APOL1 G0 ustawiono jako 100% intensywności sygnału.
Żywotność komórek
Atesty żywotności komórek przeprowadzono przy użyciu testów ATP. Aby określić ilość ATP generowanego przez komórki aktywne metabolicznie, użyliśmy testu luminescencyjnego CellTiter-Glo (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki hodowano w sterylnych płytkach 96-dołkowych w obecności 103 U na ml IFNα (Abcam) przez 72 h, a następnie dodawano 100 μL odczynnika CellTiter-Glo w celu zlizyfikowania komórek. Po 10 min inkubacji w temperaturze pokojowej, luminescencję wykrywano przy użyciu luminometru z czasem integracji 1 s na studzienkę. Sygnały luminescencji dla komórek znormalizowano przez liczbę komórek.
Cell proliferation speed assay
Komórki posiano w ilości 5,0 × 103 komórek na 150 µL podłoża hodowlanego do każdego dołka 96-dołkowej płytki i dodano inhibitor PKR C16 we wskazanym stężeniu. Po 0, 24, 48, 50 µL, liczba komórek została zmierzona przez Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Stopy zużycia tlenu w hodowanych ludzkich podocytach
Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) został użyty do oceny komórkowych stóp zużycia tlenu (OCR) zgodnie ze wskazówkami firmy. Krótko mówiąc, hodowlane ludzkie podocyty zostały zasiane na płytkach dołkowych XF24 zakupionych od Seahorse Bioscience, w gęstości 2,0 × 104 komórek na dołek (powierzchnia 0,33 cm2) w 100 μL podłoża hodowlanego i były inkubowane przez noc w temperaturze 37 ° C. Następnego dnia komórki poddano działaniu IFNα (1 × 103 U na ml) z/bez inhibitora PKR C16 (100 nM) przez 72 h, a następnie 24 h traktowano na płytkach z dołkami XF24. Przed pomiarami OCR, eksperymentalną płytkę XF24 zawierającą komórki przemyto wolną od wodorowęglanów pożywką testową DMEM (Seahorse Bioscience) zawierającą 25 mM glukozy i 1 mM pirogronianu sodu, a komórki preinkubowano przez 1 h w temperaturze 37 ° C bez dopływu CO2 w 625 μL pożywki testowej. Przed pomiarami OCR, XF24 był kalibrowany przy użyciu wkładu kalibracyjnego zgodnie z instrukcjami firmy. Po kalibracji, podstawowe pomiary OCR przeprowadzono w płytce testowej przez 4 min.
RNA-immunoprecypitacja (RNA-IP)
Stabilne komórki HEK293 noszące wariant APOL1-G0, G1, lub G2 poddano kpiącemu działaniu następujących czynników: (a) 103 U na ml IFNα przez 24-72 h i 100 μM kwasu palmitynowego (Sigma) przez 2 h, lub (b) 100 mM 103 U na ml IFNα przez 24-72 h i kalikuliną A przez 30 min. Kwas palmitynowy wiąże się bezpośrednio z PKR i hamuje wiązanie dsRNA do PKR44, dlatego kwas palmitynowy został użyty jako kontrola negatywna. Komórki napromieniano światłem UV o natężeniu 200 mJ na cm2. Dziesięć procent każdego lizatu komórkowego zapisywano jako próbkę wejściową do RT-qPCR. Immunoprecypitacja została wykonana przy użyciu zestawu do immunoprecypitacji białka wiążącego RNA (EMD Millipore) w oparciu o poprzedni raport z użyciem PKR45. Przeciwciało Phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) lub kontrolne królicze IgG było używane do RNA-IP. RNA ekstrahowano TRIzolem, a następnie poddawano działaniu DNazy i wytrącano etanolem. cDNA generowano przy użyciu losowych starterów heksamerowych i SuperScript Reverse transcriptase II. Próbki były analizowane metodą PCR (RT) lub qRT-PCR przy użyciu Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Wzbogacenie obliczano jako stosunek (próbka IP na próbkę wejściową). Pary primerów są wymienione w Tabeli Dodatkowej 1. Nie wykryto sygnału SYBR w kontrolach negatywnych, komórkach traktowanych mockami z przeciwciałem phospho-PKR IP i komórkach traktowanych interferonem-α + kalikuliną A z kontrolnym króliczym IgG IP
Ekspresja i oczyszczanie białka PKR
Rekombinowany PKR oczyszczono jak opisano wcześniej46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) transformowano do komórek BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Komórki hodowano w podłożu LB w temperaturze 37 °C do A600 nm ~ 0,7, a ekspresję białka indukowano za pomocą 1 mM IPTG przez 3 h w temperaturze ~20 °C. W celu oczyszczenia PKR, komórki zawieszano w buforze A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteaz (Sigma). Komórki były lizowane przez inkubację z 5 mg lizozymu na ml przez 30 min, a następnie sonikację przez 3 min. Lizat odwirowywano przez 20 min przy 20.000g. Supernatant nanoszono na kolumnę heparynową Sepharose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) zrównaną w buforze A, a PKR eluowano przy użyciu gradientu NaCl. Frakcje szczytowe rozcieńczano dwukrotnie buforem A i nanoszono na kolumnę agarozową z poli(I:C) (Amersham) kalibrowaną w buforze A. PKR eluowano w 1,1 M NaCl, zatężano do ~10 mg na ml i przechowywano w temperaturze -80 °C.
PKR activation assay
PKR activation assays were performed as previously reported47. PKR była deposforylowana przez fosfatazę białkową λ przez 1 h w 30 °C, a następnie hamowana 2 mM ortowanadanem sodu. PKR (4 μM) inkubowano z długim RNA (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng na ml)/krótkim RNA (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng na ml)/poly (I:C) 20 μg na ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT, i 100 μM ATP (Ambion). Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 30 °C przez wskazane czasy i hartowano 1× buforem ładującym SDS. Fosforylowane PKR wykrywano za pomocą przeciwciała phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
Przygotowanie RNA do eksperymentów migracji w żelu i SHAPE
Truncated APOL1 RNAs with various 3′ structure cassettes were prepared by in vitro transcription using the MegaShortScript kit (ThermoFisher) according to manufacturers’ recommendations. Szablony transkrypcyjne generowano w dwóch reakcjach semi-nested PCR z plazmidów zawierających allele APOL1 (G0, G1, G2) lub ich zmutowane warianty (mG0, mG1, mG2). W pierwszej reakcji użyto primerów forward i reverse, aby dodać odpowiednio 5′ promotora T7 i 45 nt 3′ SC do okrojonych sekwencji APOL1 (Tabela Dodatkowa 1). Ten ostatni element został wprowadzony w celu zapewnienia miejsca hybrydyzacji odwrotnej transkrypcji dla SHAPE. Część każdej reakcji była ponownie amplifikowana z użyciem oryginalnego primera forward i krótszego primera reverse, aby końcowe szablony transkrypcyjne były bardziej homogenne. Reakcje transkrypcji traktowano Turbo DNazą I przez 5 min w 37 °C, inkubowano w 85 °C przez 2 min i frakcjonowano na denaturującym żelu (5% poliakrylamid-19:1, 1× TBE, 7 M mocznik) w stałej temperaturze (45 °C, 30 W max). Pożądane produkty RNA były wykrywane przez cieniowanie UV, wycinane z żelu, elektrolizowane przy 200 V przez 2 h w 4 °C, wytrącane etanolem i przechowywane w -20 °C w 10 mM Tris, pH 7.0 przed użyciem. Podstawowe roztwory RNA oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometrii.
Gel migration assay
Każdy okrojony APOL1 RNA rozcieńczono do 1 μM w 20 μL buforu renaturującego RNA (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerol (w per v)), denaturowano przez ogrzewanie do 85 °C przez 2 min i renaturowano przez powolne chłodzenie (0,1 °C na s) do 25 °C. Następnie dodawano MgCl2 do końcowego stężenia 0, 1 lub 3 mM i inkubowano mieszaniny przez dodatkowe 30 min w 37 °C w celu promowania tworzenia się zależnych od Mg i/lub innych trzeciorzędowych oddziaływań RNA. Konformery RNA stabilizowano przez błyskawiczne schłodzenie do 4 °C, po czym frakcjonowano je na 5% niedenaturującym żelu poliakrylamidowym (5% akrylamid, 19:1) przez 16-18 h w 4 °C. Zarówno żel, jak i bufor zawierały 1× TBE i 1 mM MgCl2, a żele były wstępnie prowadzone przez ~1 h przed załadowaniem. Żele naświetlano barwnikiem SybrGreen (ThermoFisher) zgodnie z instrukcjami producenta, a pozycje migracji konformerów RNA wykrywano za pomocą urządzenia Typhoon Trio+ variable mode imager (GE Healthcare).
SHAPE i generowanie wtórnych modeli strukturalnych RNA
Metody eksperymentalneSHAPE zostały opisane wcześniej48,49. W skrócie, przycięte RNA APOL1 z SC RNA składano jak w teście migracji w żelu, z wyjątkiem tego, że objętość mieszaniny wynosiła 150 μL, końcowe stężenie MgCl2 wynosiło 1 mM, a glicerol był wykluczony. Roztwory RNA dzielono na kontrolne (1M7-) i eksperymentalne (1M7+) (po 72 μL) i dodawano odpowiednio 8 μL DMSO lub 8 μL 30 mM 1M7 w DMSO. Reakcje modyfikacji inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 min, schładzano do 4 °C, wytrącano etanol i ponownie zawieszano w 10 μL wody pozbawionej nukleazy. Traktowane RNA poddawano odwrotnej transkrypcji z różnie znakowanych primerów komplementarnych do kasety struktury 3′ (primer 1M7-, Cy5,5; primer 1M7+, Cy5) i hydrolizowano przez traktowanie alkaliczne. Powstałe biblioteki cDNA wytrącano etanolem i ponownie rozpuszczano w Sample Loading Solution (Genome Lab), a następnie łączono z drabinkami sekwencjonującymi ddA i ddG znakowanymi odpowiednio WellRED D2 (Beckman Coulter) i IRDye 800RS (LI-COR). Połączone próbki były frakcjonowane metodą elektroforezy kapilarnej (CE) przy użyciu analizatora genetycznego Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer. Dla każdego RNA profile reaktywności zostały wygenerowane z elektroforegramów CE przy użyciu oprogramowania SHAPEfinder50 , a następnie wprowadzone do oprogramowania RNAstructure w wersji 5.751,52 wraz z sekwencjami RNA w celu wygenerowania wtórnych modeli strukturalnych. Domyślne parametry slope (1,8 kcal na mol) i intercept (-0,6 kcal na mol) zostały użyte do przekształcenia wartości reaktywności w ograniczenia pseudoenergetyczne, które modulują algorytm składania RNA. RNAstructure automatycznie generuje wiele modeli strukturalnych, które najlepiej pasują do profili reaktywności otrzymanych z SHAPE i szereguje je według energii swobodnej Gibbsa. Wytworzone w ten sposób modele strukturalne o najniższej energii są zilustrowane na Rys. 3a, b oraz na Uzupełniającym Rys. 4.
In vitro knock down
Przeprowadziliśmy eksperymenty knock down używając warunkowo immortalizowanych ludzkich linii komórkowych utworzonych z ludzkiego moczu42. Komórki te transfekowaliśmy albo Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) albo zaprojektowanym wcześniej stealth siRNA przeciwko APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) przy użyciu Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo był współtransfekowany i użyty do kontroli transfekcji. Wydajność knock down wynosiła 52,4-75,4% (poziomy RNA) lub 31,1% (poziomy białka).
Myszy
Użyliśmy myszy transgenicznych z ludzkim locus genu APOL1 (myszy BAC-APOL1), wygenerowanych przy użyciu sztucznego chromosomu bakteryjnego, który zawiera locus dla APLOL-G0, lub APOL1-G1, lub APOL1-G2. Z ludzkiego klonu BAC (ENST00000397278, który odpowiada NM_003661) wyizolowano i subklonowano ludzkie DNA o masie ~47 kb, obejmujące wyłącznie gen APOL1 z regionami 5′ i 3′ flankującymi (w tym eksony 1 i 2 genu APOL2 oraz region 3′ obejmujący eksony 39-41 części genu MYH9). Poszczególne subklony G0, G1 i G2 BAC wstrzyknięto do zarodków 129SvJ/B6N F1, a założycieli następnie skrzyżowano wstecznie z 129SvJ. Podklon poddano sekwencjonowaniu, aby upewnić się, że jest to referencyjna sekwencja genomu z NCBI i Ensembl. Jedynymi różnicami były polimorfizmy w regionach intronowych. W eksperymentach z warunkowymi transgenicznymi myszami użyto specyficznych dla podocytów myszy transgenicznych APOL1 z obciętym RNA o pochodzeniu FVB. Myszy te wyprodukowaliśmy za pomocą warunkowego systemu transgenicznego wykorzystującego sekwencję skróconego RNA sterowaną przez promotora nefryny (NPHS1) (NM_001136540, 1031-1453). Stworzyliśmy dwa szczepy: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA z rs73885319 A i rs60910145 G oraz NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA z rs73885319 G i rs60910145 G.
Isolacja kłębuszków
Myszy BAC/APOL1 (między 8 a 12 tygodniem życia) podawano IFNγ (106 U na kg masy ciała IP) codziennie przez 3 dni przed pobraniem próbek tkanek. Protokół izolacji kłębuszków został szczegółowo opisany53. Krótko mówiąc, myszy zostały znieczulone przez dootrzewnowe wstrzyknięcie Avertinu (2,2,2-tribromoetylu i trzeciorzędowego alkoholu amylowego; 17 μL na g) i perfundowane 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04) rozcieńczonych w 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez serce. Nerki trawiono kolagenazą A i DNazą I w temperaturze 37 °C przez 10 min. Strawioną kolagenazą tkankę delikatnie przeciskano przez sitko komórkowe 100-μm i przemywano HBSS. Próbki płukano i ponownie zawieszano przy użyciu magnetycznego statywu. Kłębuszki zebrano i inkubowano w RPMI1640 uzupełnionym 10% FBS, ITS, 1% penicyliną/streptomycyną (100 iU na ml; 100 μg na ml) i 100 mM kalikuliną A (LC Laboratories) przez 30 min i wykorzystano do analizy Western blot.
Immunohistochemia (próbki mysie)
Myszy BAC/APOL1 (w wieku od 8 do 12 tygodni) podawano IFNγ (106 U na kg masy ciała IP) codziennie przez 3 dni. Myszy perfundowano 100 mM kalikuliną A zawartą w PBS przed pobraniem próbek tkanek. Następnie nerki były cięte na małe kawałki i inkubowane w RPMI1640 uzupełnionym 10% FBS, ITS i 100 mM kalikuliną A przez 30 min. Następnie tkanki natychmiast utrwalano w 10% zbuforowanej formalinie. Myszom BAC/APOL1 (w wieku od 8 do 12 tygodni) podawano IFNγ (106 U na kg masy ciała IP) codziennie przez 3 dni. Myszom NPHS1-APOL1-ΔRNA podawano IFNγ (106 U na kg masy ciała IP) codziennie przez 3 dni przed pobraniem próbek tkanek. Do badań wykorzystano utrwalone w parafinie wycinki tkankowe o grubości 4-5 μm. Wycinki były deparafinowane/odwadniane, a pobieranie antygenów odbywało się poprzez ogrzewanie w podłożu buforowanym cytrynianem przez 5 min w mikrofalówce. Tkanki blokowano za pomocą 1% BSA i 0,1% saponiny. Sekcje inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi, w tym z następującymi: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) i podocalyxin (R&D Systems AF1556). Do immunofluorescencji użyto przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor (ThermoFisher), a wizualizację przeprowadzono za pomocą mikroskopu konfokalnego. Do barwienia ABC użyto przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z biotyną i Avidin-HRP (Vector). Do wizualizacji użyto zestawu DAB (Vector). W eksperymentach na myszach, myszy (w wieku od 8 do 12 tygodni) były leczone IFNγ (106 U na kg masy ciała IP), wstrzykiwanym przez 3 dni przed pobraniem próbek tkanek. W celu kwantyfikacji sygnału, sygnał fosfo-PKR podocytu był wykrywany przez przeciwbarwienie dla WT1 w doświadczeniach na myszach.
Immunohistochemia (próbki ludzkie)
To badanie zostało zatwierdzone z wyprzedzeniem przez IRB w University of Maryland i NIDDK, NIH. Podstawowa charakterystyka przypadków jest podana na rycinie uzupełniającej 5b. Barwienie przeprowadzono przy użyciu 5 μm grubości utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie odcinków tkanek. Po deparafinizacji przeprowadzono indukowane termicznie odzyskiwanie antygenu przez 20 min w buforze o pH 6,0 przy użyciu szybkowaru (Pascal, Agilent Technologies Dako). Sekcje inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi: phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) i WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Użyliśmy przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor (ThermoFisher) i wizualizowaliśmy za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Immunohistochemia i obrazowanie żywych komórek
Komórki inkubowano z 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) i 200 nM TMRE (Invitrogen) przez 20 min przed detekcją sygnału, po leczeniu 20 μM FCCP i wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Kwantyfikacja sygnału obrazów mikroskopowych
W przypadku tkanki ludzkiej, policzyliśmy kłębuszki bez globalnego stwardnienia (6 przypadków o genotypie bez ryzyka: 5, 6, 7, 10, 5, i 9 kłębuszków dla każdego przypadku, odpowiednio; 6 przypadków o genotypie ryzyka: 13, 6, 4, 5, 10 i 5 kłębuszków, odpowiednio). W przypadku tkanek myszy i człowieka moc lasera dostosowano tak, aby nie doszło do nasycenia maksymalnego sygnału. Przetwarzanie obrazu i analizę kolokalizacji przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy)54. Ważony współczynnik kolokalizacji i średnią intensywność w komórkach WT-1 pozytywnych obliczono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami54. Dla średniej intensywności, znormalizowaliśmy intensywność sygnału podocytów używając sygnałów z WT1-negatywnych komórek wewnątrz kłębuszków dla każdego kłębuszka. Wartości były względną punktacją, z intensywnością sygnału APOL1-G0 jako 100%. Kwantyfikacje przeprowadzono w sposób zaślepiony.
Hybrydyzacja in situ
Chromogenne wykrywanie in situ przeprowadzono na przekrojach tkanek z utrwalonych w formalinie parafinowych bloczków myszy (FFPE) przy użyciu hybrydyzacji in situ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Krótko mówiąc, 5 μm wycinki tkanek FFPE były odparafinowane, gotowane z odczynnikiem do obróbki wstępnej przez 15 min, a następnie trawione proteazą w 40 °C przez 30 min, po czym następowała hybrydyzacja przez 2 h w 40 °C z sondą-Hs-APOL1-01 (katalog # 439871, Advanced Cell Diagnostics). Dodatkowo, sonda-Mm-PPIB (katalog # 313911) i sonda-DapB (katalog # 310043) zostały użyte odpowiednio do kontroli pozytywnej i negatywnej. Wykrywanie specyficznych miejsc wiązania sond wizualizowano za pomocą RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalog # 310035).
Mouse proteinuria model
Wszystkie doświadczenia przeprowadzono zgodnie z National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały wcześniej zatwierdzone przez NIDDK Animal Care and Use Committee (propozycja badania na zwierzętach (K097-KDB-14)). Używaliśmy zarówno samców, jak i samic myszy w wieku 8-15 tygodni. Myszy w każdym eksperymencie były dopasowane pod względem płci, wieku i masy ciała. Randomizację przeprowadzono w odniesieniu do masy ciała. Liczebność próby dla eksperymentów określono bez formalnego obliczania mocy. Kryterium wykluczenia była utrata masy ciała większa niż 20% podczas okresu doświadczalnego. W celu indukcji białkomoczu myszom (w wieku od 8 do 12 tygodni) wstrzykiwano bFGF i aminonukleozyd puromycyny, jak opisano wcześniej30. Dla szczepu myszy NPHS1-APOL1-deltaRNA, aminonukleozyd puromycyny (Sigma-Aldrich) wstrzykiwano podskórnie w dniu 0 (200 mg na kg masy ciała), a bFGF (Kaken Pharmaceutical) wstrzykiwano dożylnie w dniach 0 i 2 (5 μg na zwierzę), odpowiednio. Dla eksperymentów z inhibitorem PKR, inhibitor PKR C16 (10 μg na kg IP) codziennie od dnia 0 do dnia 1055. Dla szczepu myszy BAC-APOL1, interferon γ (Prospec) był wstrzykiwany w dniu -1 i dniu 1 (106 U na kg masy ciała), aminonukleozyd puromycyny był wstrzykiwany podskórnie w dniu 0 (300 mg na kg masy ciała), a bFGF (Kaken Pharmaceutical) był wstrzykiwany dożylnie odpowiednio w dniu 0 i 2 (5 μg na zwierzę). Do eksperymentów z inhibitorem PKR, inhibitor PKR C16 (10 μg na kg IP) codziennie od dnia 0 do dnia 1055.
Pomiar albuminy moczowej i kreatyniny
Określiliśmy poziomy albuminy moczowej metodą ELISA, używając zestawu ELISA do mikroalbuminurii u myszy (Exocell). Mierzyliśmy stężenie kreatyniny w moczu za pomocą zestawu do oznaczania kreatyniny (Exocell). Wszystkie pomiary były wykonywane w dwóch egzemplarzach. Oznaczaliśmy albuminurię jako stosunek stężenia albuminy w moczu do kreatyniny. Wszystkie procedury były wykonywane zgodnie z protokołami producentów. Badacze nie byli zaślepieni na przydział do grupy, ale byli zaślepieni przy ocenie wyniku.
Analiza statystyczna
Dane z co najmniej trzech indywidualnych eksperymentów zostały przeanalizowane i przedstawione jako wykres kropkowy i średnia. Metody analizy statystycznej zostały zapisane w legendach do każdej figury. Nie dostosowaliśmy się do wielokrotnych porównań. Wartości P < 0,05 zostały uznane za statystycznie istotne.
.