2 Historia życia
Cerkarie FBF są drobne, trudne do zidentyfikowania morfologicznego i zazwyczaj mają bardzo niską częstość występowania w populacjach bezkręgowców będących żywicielami pośrednimi (Cribb i in., 2011). Być może w wyniku tych cech, żywiciel(e) pośredni(e) jest nieznany dla wszystkich z wyjątkiem kilku gatunków FBF: kilku gatunków słodkowodnego rodzaju Sanguinicola (patrz Bullard i Overstreet, 2008) oraz gatunków morskich Aporocotyle simplex (patrz Køie, 1982; Køie i Petersen, 1988, infekcje eksperymentalne; nie zastosowano markerów molekularnych), Paracardicoloides yamagutii (patrz Nolan i Cribb, 2004a; patrz dalszy tekst), C. forsteri (zob. Cribb i in., 2011; patrz dalszy ciąg tekstu), i Cardicola opisthorchis (patrz Sugihara et al., 2014; patrz dalszy ciąg tekstu). Sekwencje ITS2 rDNA zostały wykorzystane do dopasowania morfologicznie nieokreślonych larwalnych okazów FBF, tj. cerkarii, sporocyst i redii, zebranych od żywicieli bezkręgowych, do morfologicznie wyróżniających się dorosłych okazów od sympatycznych żywicieli ryb. Szybko i tanio, markery molekularne umożliwiają szybkie wykrywanie infekcji; identyfikację czynnika infekcyjnego, poprzez wnioskowanie filogenetyczne lub poprzez homologię sekwencji do już zsekwencjonowanego taksonu; oraz identyfikację żywicieli pośrednich, łącząc w ten sposób stadia rozwojowe potencjalnie patogenicznych FBF. Z pewnością określenie tożsamości żywicieli pośrednich i ostatecznych stanowi pierwszy, krytyczny krok w zrozumieniu cyklu życiowego FBF. Jednak poza metodami diagnostycznymi, wiele pozostaje do odkrycia na temat specyficznych szczegółów relacji żywiciel-pasożyt między FBF i ich wieloszczetami, ślimakami i żywicielami pośrednimi małżami. W końcu ich historia ewolucyjna może być w równym lub większym stopniu kształtowana przez żywicieli pośrednich, jak i ostatecznych. W związku z tym twierdzimy, że badania molekularne nie powinny w pełni wypierać klasycznych badań eksperymentalnych, w których prowadzi się bezpośrednie obserwacje mikroskopowe larwalnych i dorosłych FBF w tkankach żywicieli po ekspozycji naiwnych bezkręgowców i rybich żywicieli ostatecznych (Køie, 1982).
Większość informacji dotyczących cykli życiowych FBF pochodzi z programów zdrowia zwierząt wodnych związanych z akwakulturą komercyjną: 17 ze 109 (16%) dostępnych sekwencji FBF w GenBank pochodzi z zakażeń w akwakulturze morskiej (Tabela 1.1). FBF stanowią jedną z niewielu grup nicieni, których członkowie mogą wyrządzić szkodę żywicielowi ostatecznemu ryby jako osobniki dorosłe, które zamykają naczynia krwionośne i powodują asfiksję, jako jaja, które uszkadzają lub blokują nabłonek skrzeli i naczynia rozgałęzione, oraz jako miracidia, które wylęgają się z jaj osadzonych w nabłonku skrzeli i wydostają się na zewnątrz ryby (Bullard i Overstreet, 2002, 2008). W związku z tym ich cykle życiowe są przedmiotem zainteresowania komercyjnych przedsiębiorstw akwakultury, ponieważ FBF mogą zabijać lub osłabiać ryby i powodować straty ekonomiczne w stawach słodkowodnych, torach wyścigowych i morskich klatkach przybrzeżnych. Sekwencje pochodzące od niedorosłych osobników FBF zarażających ślimaki, małże i wieloszczety, które są siedliskiem bezpłciowych stadiów reprodukcyjnych FBF – sporocyst, redii i cerkarii – są znacznie mniej liczne (4 ze 109) (Tabela 1.1) niż te pochodzące od dorosłych osobników zarażających ryby.
W pierwszym opublikowanym badaniu cyklu życiowego FBF, ustalonego za pomocą metody molekularnej, Nolan i Cribb (2004a) udokumentowali dwa morfotypy cerkarii („typ A” i „typ B”) zarażające 80 z 11 314 (0,7%) osobników hydrobiologicznego ślimaka Posticobia brazieri w pływowych potokach Queensland w Australii. Sekwencje ITS2 rDNA z cerkarii typu A dopasowały się (100% zgodności) do dorosłych osobników P. yamagutii, które zostały pobrane z krwi (aorta grzbietowa, przedsionek, komora, skrzela, nerki oraz naczynia krwionośne jelita i pęcherza pławnego) węgorza długopłetwego Anguilla reinhardtii. W innym badaniu, w odpowiedzi na obawy dotyczące chorób związanych z infekcjami C. forsteri zarażającymi hodowlane tuńczyki błękitnopłetwe T. maccoyii w południowej Australii, Cribb i wsp. (2011) przebadali 9351 osobników z 11 rodzin małży, 2 rodzin ślimaków i 24 rodzin wieloszczetów pod kątem infekcji FBF. Dane sekwencji ITS2 rDNA uzyskane z cerkarii zainfekowanych Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) pokryły się w 100% z dorosłymi osobnikami C. forsteri z serca pobliskiego tuńczyka błękitnopłetwego w zagrodzie sieciowej w Port Lincoln w Australii. Sekwencjonowali oni również fragment 28S rDNA (721 bp w regionie D1-D2) z cerkarii C. forsteri, które zainfekowały L. modestus. Podążając za podejściem Cribb i wsp. (2011), Sugihara i wsp. (2014) skupili się na wieloszczetach, badając 744 bezkręgowce pod kątem infekcji FBF w miejscu hodowli tuńczyka błękitnopłetwego Thunnus orientalis, u południowych wybrzeży Japonii. Sporocysty i cerkarie FBF znaleziono u pięciu osobników wieloszczeta terebeliowego (Terebella) zebranych z wnętrza muszli martwych pąkli pobranych z podłoża oraz z lin i pływaków znajdujących się pod klatką morską. Sekwencje ITS2 i 28S ze sporocyst były identyczne (100%) z sekwencjami dorosłych osobników C. opisthorchis z serca hodowanego tuńczyka błękitnopłetwego.
Shirakashi i wsp. (2012) badali równoczesne infekcje Cardicola orientalis i C. opisthorchis u tuńczyka błękitnopłetwego. Wykorzystali oni dane sekwencji ITS2 rDNA do odróżnienia półksiężycowatych jaj C. opisthorchis w tętnicy wiciowej od owalnych jaj C. orientalis infekujących blaszki skrzelowe. Stwierdzili oni, że specyficzne gatunkowo primery PCR zastosowane do próbek tkanki skrzelowej mogłyby uzupełnić badania histopatologiczne i pomóc w diagnozowaniu infekcji zanim jaja i osobniki dorosłe będą wystarczająco liczne, aby można je było łatwo zaobserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Yong i wsp. (2013) wykorzystali kompletne dane sekwencji ITS2 rDNA do identyfikacji jaj FBF złożonych w skrzelach pięciu gatunków ryb motylkowatych (Perciformes: Chaetodontidae) z Wielkiej Rafy Koralowej jako pojedynczego gatunku Cardicola chaetodontis (różnica jednej pary zasad w dwóch próbkach). Jaja FBF są nierzadko obserwowane w nabłonku skrzelowym i tętniczkach rozgałęzionych ryb podczas rutynowych sekcji zwłok (SAB, obserwacje własne), ale w wielu przypadkach nie udaje się odzyskać odpowiadających im dorosłych osobników, które zarażają krew poszczególnych ryb. Techniki molekularne, które skutecznie ekstrahują i amplifikują DNA z jaj FBF, które są bardzo małe (na przykład jaja C. chaetodontis mają 40-60 μm długości całkowitej), mogą ujawnić obecność nienazwanych gatunków FBF i dotychczas nieudokumentowanych żywicieli, jeśli uzyskane sekwencje zostaną umieszczone w kontekście filogenetycznym z sekwencjami nazwanych gatunków. To samo można powiedzieć o sekwencjach uzyskanych z cerkarii (patrz dalszy tekst). Wykorzystując ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), Norte Do Santos et al. (2012) zidentyfikowali jaja C. forsteri zgromadzone w skrzelach hodowanego tuńczyka błękitnopłetwego. Podobnie Kirchhoff i wsp. (2012) zastosowali tę metodę do diagnozowania jaj C. forsteri zarażających T. maccoyii. Polinski i wsp. (2013) poszli o krok dalej, opracowując czułą i dokładną technikę PCR w czasie rzeczywistym, która może być również stosowana do identyfikacji C. forsteri, C. orientalis i C. opisthorchis w próbkach nieśmiertelnych. W żadnej z testowanych metod, tj. qPCR opartej na SYBR i wspólnym teście reporterowym TaqMan, nie wykryto amplifikacji międzygatunkowej ani amplifikacji genomu gospodarza; jednakże ich łączne zastosowanie poprawiło wiarygodność rozróżniania gatunków. Metody te potwierdziły jednoczesne zakażenia C. forsteri i C. orientalis u T. maccoyii, wskazując również na większą prewalencję i rozmieszczenie C. orientalis u gospodarza.
W ostatnim czasie poparto przydatność obu opracowanych technik do oceny patologicznych konsekwencji zakażeń FBF. Polinski i wsp. (2014) połączyli qPCR z transkrypcją immunologiczną genów gospodarza w celu ilościowego określenia ilości DNA z tkanek zainfekowanych przez C. opisthorchis i C. orientalis. Określili oni również czasową odpowiedź immunologiczną gospodarza na te infekcje u hodowanego w klatkach tuńczyka błękitnopłetwego. Wcześniejsze dane udokumentowały występowanie osobników dorosłych i jaj C. orientalis w skrzelach (Ogawa i in., 2010; Shirakashi i in., 2012), podczas gdy osobniki dorosłe i jaja C. opisthorchis zainfekowały odpowiednio serce i tętnice rozgałęzione dośrodkowe (Ogawa i in., 2011; Shirakashi i in., 2012). Wyniki Polinski i wsp. (2014) wykazały jednak korelację transkrypcji IgM z wysokimi ilościami infekcji „C. orientalis only” w tkankach skrzeli, ale nie z DNA C. opisthorchis, co sugeruje, że taka odpowiedź immunologiczna w tym narządzie może być wywołana raczej obecnością osobników dorosłych niż jaj. Co więcej, wysoki poziom DNA C. orientalis w sercu przypisano obecności młodocianych motyli. Chociaż takie metody nie są w stanie zidentyfikować stadiów rozwojowych FBF ani tego, czy paciorkowce są żywe czy martwe, to takie ilościowe podejście umożliwia wnioskowanie o intensywności i statusie infekcji, co samo w sobie jest obiecującym narzędziem dla przyszłych badań epidemiologicznych z udziałem ryb dzikich lub hodowlanych.
Brant et al. (2006) wykorzystali wnioskowanie filogenetyczne (28S, 18S, i COI) w leczeniu kilku niezidentyfikowanych cerkarii FBF wyizolowanych ze ślimaków (Planorbidae i Thiaridae) w Ugandzie, Kenii i Australii. Morfologicznie scharakteryzowali oni cerkarie za pomocą fotomikrografów oraz na podstawie obecności/braku oczodołów, fałdów płetwowych na ogonie i ciele cerkarii oraz kształtu ogona. Chociaż brakuje spójnej i filogenetycznie konsekwentnej, opartej na morfologii definicji (diagnozy) cerkarii FBF, cerkarie te są typowo charakterystyczne: miniaturowe, o rozwidlonych ogonkach, bez przyssawki brzusznej, z charakterystycznym narządem penetrującym, który prawdopodobnie składa się z wyspecjalizowanej przyssawki przedniej (Truong i Bullard, 2013), fałd płetwowy na ciele cerkarii oraz fałd płetwowy obecny lub nieobecny na furce ogonowej (Cribb i in., 2011). Jedna z tych cerkarii (W5004) była szczególnie dziwaczna morfologicznie, tj. opisana jako afaryngeata i furkokerkoidalna, ale z „ekstrawaganckimi bocznymi błonami ogonowymi i spiczastym kształtem ciała”, a żadna z tych cerkarii nie miała wszystkich cech typowych dla cerkarii FBF (patrz poprzedni tekst). Jednakże połączona analiza 18S i 28S tych cerkarii połączyła je w grupę z innymi sekwencjami FBF (zakładamy, że „Sanguinicolid sp.” to sekwencja „Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Z tego powodu, a także dlatego, że były one morfologicznie dziwaczne w stosunku do znanych cerkarii FBF, autorzy ci stwierdzili, że istnieje znacznie większa różnorodność morfologiczna cerkarii FBF niż ta, która została dotychczas rozpoznana w literaturze. Tożsamość taksonomiczna i znaczenie filogenetyczne tych sekwencji są omówione w dalszej części tekstu.