Materiały
Kwas 4′-hydroksyazobenzeno-2-karboksylowy (HABA), biotyna, sól trifluorooctanowa N-(2-aminoetylo)maleimidu (amino-maleimid), kwas octowy, octan sodu, kwas fosforowy, chlorek magnezu, Tween 20, Tween 80, albumina surowicy bydlęcej (BSA), dimetylosulfotlenek (DMSO), dekstran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; liofilizowany przed użyciem), chloroformian 4-nitrofenylu (PNC; sublimowany przed użyciem), LiCl (przed użyciem suszony w temperaturze 110 °C), tyramina (TA), bezwodna pirydyna, bezwodny N,N-dimetyloformamid (DMF), N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA), piperydyna, aminokwasy, bezwodnik octowy, triizopropylosilan, kwas trifluorooctowy (TFA), wodorotlenek sodu (NaOH), N-Boc-1,4-butanodiamina (NH2-Boc), wodorowęglan sodu (NaHCO3), biotyna-atto565, biotyna-4-fluoresceina (biotyna-FITC), 6-aminofluoresceina, peroksydaza chrzanowa (HRP, typ VI), biotyna-HRP, nadtlenek wodoru (H2O2; z inhibitorem), płodowa surowica bydlęca (FBS), kalceina AM, homodimer etydowy-1 (EthD-1), błękit tiazolilobetrazolowy (MTT) i wszystkie inne rozpuszczalniki, o ile nie podano inaczej, zostały zakupione od firmy Sigma-Aldrich. Matryca w kształcie kości została zakupiona od firmy LEGO. Polidimetylosiloksan (PDMS; Sylgard 184) zakupiono w firmie Dow Corning. Sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zakupiono od firmy Lonza. Rekombinowany ludzki BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna (TMB) i H2SO4 zostały zakupione od firmy R&D Systems. Żywicę Fmoc-Rink 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA) (waga 50 mg, podstawienie 0,52 mmol g-1) i N,N,N′,N′-Tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)uroniowy heksafluorofosforan (HBTU) zakupiono w firmie MultiSynTech. Chloroform i 1-metylo-2-pirolidynon (NMP) zakupiono w firmie WR Chemicals. Przeciwciało VHH przeciwko BMP7 (Q32c-lab, klon G7) i poliklonalne królicze przeciwciało przeciwko VHH (K1216) zakupiono od QVQ. Biotynowane przeciwciało przeciwko IL-1β (508301, klon JK1B2, RRID:AB_315512) zakupiono w firmie Biolegend. Biotynowaną IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) zakupiono w firmie Jackson Immunoresearch. Skoniugowane HRP drugorzędowe kozie przeciwciało przeciwko królikowi (P0448) zakupiono od firmy Dako. Biotynowane nanocząstki złota (20 nm) zakupiono od Cytodiagnostics. Biotynylowany peptyd o sekwencji aminokwasowej KGLPLGNSH zakupiono od firmy Pepscan. 6-(biotynoamido)heksanian sukcynimidylu (biotyna-LC-NHS) zakupiono w firmie ApexBio. Neutrawidyna, N-hydroksysukcynimid-destiobiotyna (EZ-Link NHS-destiobiotyna), 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) i zestaw do barwienia 3,3′-diaminobenzydyną (DAB) zostały zakupione od ThermoFisher Scientific. Wstępnie aktywowane czujniki do sprzęgania amin (G-type easy2spot) zostały zakupione od firmy Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Penicylinę i Streptomycynę oraz trypsynę-EDTA zakupiono w firmie Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), odczynnik do oznaczania lucyferaz (E1483) i QuantiFluor dsDNA System zakupiono w firmie Promega. Komórki C2C12-BRE-Luc zostały uprzejmie dostarczone przez prof. Daniel B. Rifkin.
Analiza wielowartościowości neutravidyny
Analiza spektrofotometryczna HABA została użyta do analizy liczby kieszeni wiążących biotynę z neutravidyną. W szczególności, HABA może specyficznie wiązać się z (neutr)awidyną w podobny sposób jak biotyna, ale z niższym powinowactwem wiązania. Kompleks HABA/neutravidin ma pik absorpcji około 500 nm. Niezwiązany HABA ma pik absorpcji około 350 nm. Wypieranie HABA przez biotynę może być zatem oceniane poprzez pomiar absorbancji przy 350 i 500 nm. Aby określić liczbę kieszeni wiążących biotynę w neutrawidynie, najpierw inkubowano ją z nadmiarem HABA, tak aby utworzyły się w pełni nasycone kompleksy HABA/neutrawidyna. Biotyna była dodawana do tych kompleksów w stosunku molowym neutrawidyna/biotyna 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 i 1:6. Dla każdego stosunku neutrawidyna/biotyna, ilość zarówno kompleksu HABA/neutrawidyna jak i wolnego HABA została określona przez pomiar absorbancji przy 500 i 350 nm, odpowiednio, przy użyciu spektrofotometru ND1000 (ThermoFisher scientific). Plateau przy 3,2 biotyny/neutrawidyny wskazywało na liczbę kieszeni wiążących biotynę, co było zgodne z arkuszem specyfikacji producenta (3,1 biotyny/neutrawidyny).
Pomiary SPRi
Biotynylowana IL-1B została unieruchomiona na czujnikach typu G easy2spot za pomocą urządzenia punktowego o ciągłym przepływie (Wasatch Microfluidics). Czujniki typu żelowego zostały użyte ze względu na ich zwiększoną zdolność wiązania i bardziej efektywne wykorzystanie pola ewanescencyjnego, w porównaniu do czujników o powierzchni planarnej. Reakcję immobilizacji przeprowadzono w 50 mM buforze kwasu octowego (150 µl na plamkę) ze stężeniami przeciwciał 5, 2,5, 1,25 i 0,625 µg ml-1. Jako kontrolę nanoszono BSA w stężeniu 5 µg/ml. Bufor immobilizacyjny (pH 4,6) zapewniał sprzężenie przeciwciał z najwyższą zachowaną aktywnością i dlatego był stosowany we wszystkich eksperymentach. W celu zmniejszenia niespecyficznych oddziaływań, sensor dezaktywowano 1% (w/v) BSA w 50 mM buforze octanowym (pH 4,6) przez 7 min, a następnie 0,2 M etanoloaminą (pH 8,5) przez dodatkowe 7 min. SPRi przeprowadzono przy użyciu systemu MX96 z oprogramowaniem SUIT (IBIS). Neutrawidyna, D-@BMP7, B-@BMP7 i BMP7 zostały rozpuszczone w buforze systemowym składającym się z PBS z 0,5% (w/v) BSA i 0,075% (v/v) Tween80 w stężeniu odpowiednio 250, 100, 100 i 100 nM. Biotynę rozpuszczono w stężeniu 400 µM w buforze systemowym uzupełnionym 0,1% (v/v) DMSO. Przepływ tam i z powrotem ustawiono na 10 µl min-1 w celi przepływowej zawierającej 12 µl próbki. Oprogramowanie Sprint było używane do zbierania danych i odnoszenia się do łącznie sześciu plamek w każdym stanie. Dane zostały następnie wyeksportowane do Matlab R2015a w celu dalszej analizy i kontroli jakości przy użyciu niestandardowych skryptów (dostępnych na życzenie). Stałe dysocjacji kompleksów supramolekularnych wyznaczono w następujący sposób: najpierw czujnik przepłukano, stosując trzy iniekcje ślepej próby (tj. buforu systemowego), aby zapewnić tło dla sygnałów interakcji. Następnie zastosowano podejście kaskadowe w celu określenia powinowactwa pomiędzy składnikami kompleksu. W tym celu sensor inkubowano z buforem, następnie z neutrawidyną, D-@BMP7 lub B-@BMP7, BMP7, a na końcu z roztworem biotyny. Czas asocjacji oddziaływań kaskadowych wynosił 30 min, po czym następowała 15 min dysocjacja. Pomiędzy każdą iniekcją sensor płukano buforem systemowym. Czas asocjacji oddziaływań wypierających z biotyną wynosił 180 min i był wykonywany dwukrotnie. Kinetykę można opisać prostą interakcją Langmuira 1:1, którą można ująć za pomocą wykładniczego równania (3).
W tym równaniu Rmax jest zdolnością wiązania liganda (RU), kon jest szybkością asocjacji (M-1 s-1), koff jest szybkością dysocjacji (s-1), c jest stężeniem analitu (M), a t jest czasem od rozpoczęcia interakcji (s). Stała dysocjacji Kd jest zdefiniowana jako koff/kon. Oprogramowanie Matlab z własnymi skryptami zostało użyte do analizy danych o powinowactwie poprzez dopasowanie interakcji Langmuira. W skrócie, puste miejsca były odejmowane, a sygnał był zerowany do pierwszej interakcji. Aby określić powinowactwo danego oddziaływania, najpierw wyznaczano szybkość koff w fazie dysocjacji. Następnie wyznaczano szybkość kon przy użyciu stałej koff. Dla wypierania z biotyną szybkość koff wyznaczono w fazie asocjacji.
Synteza i charakterystyka Dex-TAB
Dekstran poddano reakcji z chloroformanem p-nitrofenylu (PNC) tworząc koniugaty węglanu p-nitrofenylu, które następnie poddano działaniu związków zawierających aminy pierwszorzędowe (Supplementary Fig. 2). Koniugaty dekstran-p-nitrofenylo węglan (Dex-PNC) syntetyzowano w następujący sposób. W typowym eksperymencie dekstran (3,0 g, 56,3 mmol grup OH) rozpuszczano w DMF (200 mL, zawierającym 2,4 g LiCl) w temp. 90 °C pod atmosferą azotu. Po rozpuszczeniu dekstranu mieszaninę schłodzono do 0 °C. Do roztworu dodawano małymi porcjami pirydynę (1.5 mL, 18.6 mmol), a następnie PNC (2.8 g, 13.9 mmol), mieszając i utrzymując temperaturę 0 °C. Reakcję prowadzono przez godzinę, a produkt wytrącano w zimnym etanolu. Osad przefiltrowano i przemyto etanolem, a następnie eterem dietylowym, po czym wysuszono w piecu próżniowym. Dekstran-tyramina-butyloamina (Dex-TA-NH2) została zsyntetyzowana w następujący sposób. Dex-PNC najpierw poddano reakcji z N-Boc-1,4-diaminobutanem, a następnie z tyraminą. Ochronną grupę t-butyloksykarbonylową usuwano w reakcji z TFA. W typowym eksperymencie, Dex-PNC28 (1.0 g, 1.36 mmol grup PNC) rozpuszczono w 16 mL DMF. Dodano N-Boc-1,4-diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) pod przepływem azotu i pozwolono na prowadzenie reakcji przez 15 min. Następnie dodano tyraminę (0,20 g, 1,46 mmol) i pozostawiono reakcję na godzinę. Produkt wytrącano w zimnym etanolu, osad filtrowano i przemywano etanolem i eterem dietylowym, a następnie suszono w piecu próżniowym. Chroniony Boc Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) rozpuszczono w 10 mL dejonizowanej wody. Dodano kwas trifluorooctowy (TFA) (1 mL, 13.06 mmol) pod atmosferą azotu i mieszano przez noc. Mieszaninę reakcyjną zneutralizowano 2 M roztworem NaOH i oczyszczono przez dializę (1000 Da odcięcie masy cząsteczkowej) wobec 150 mM roztworu NaCl przez 48 h i wody dejonizowanej przez 24 h, a następnie wyizolowano przez liofilizację. Dex-TA-NH2 był dalej funkcjonalizowany biotyną poprzez reakcję 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 z 20-krotnym molowym nadmiarem biotyny-LC-NHS przez co najmniej 1 h w 0,1 M buforze wodorowęglanowym (pH 8,5) (Supplementary Fig. 3). Dex-TAB był następnie oczyszczany i zatężany przy użyciu kolumny z filtrem spinowym o masie cząsteczkowej odcięcia 3 kDa. Udaną syntezę Dex-PNC, Dex-TA-NH2 i Dex-TAB potwierdzono metodą 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) w DMSO-d6 lub D2O. Liczbę sprzężonych grup tyraminowych i butyloaminowych na 100 pierścieni anhydroglukozowych dekstranu określano obliczając stosunek zintegrowanych sygnałów odpowiednio dekstranu (δ 4,0-5,8 ppm) i grup tyraminowych (δ 6,66 i δ 6,98 ppm) oraz dekstranu i grup butyloaminowych (δ 1,4-1,5 ppm). Liczba sprzężonych cząsteczek biotyny na 100 pierścieni anhydroglukozowych dekstranu została określona przez obliczenie stosunku zintegrowanych sygnałów z grup tyraminowych (δ 6.66 ppm i δ 6.98 ppm) i sprzężonej 6-aminokapronowej przekładki (δ 2.13).
Sieciowanie Dex-TAB i ortogonalna postfunkcjonalizacja
Konstrukcje hydrożelowe Dex-TAB przygotowano przez zmieszanie 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 peroksydazy chrzanowej i 0,05% (w/v) H2O2. W celu ortogonalnej postfunkcjonalizacji hydrożele Dex-TAB inkubowano kolejno z 1 µM neutrawidyny w buforze przemywającym, który składał się z 1% (w/v) BSA w PBS, przemywano buforem przemywającym w celu usunięcia niezwiązanej neutrawidyny, inkubowano z 1 µM biotynylowanej lub destiobiotynowanej cząsteczki w buforze przemywającym i ponownie przemywano buforem przemywającym w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek. Konstrukty Dex-TAB/neutravidin/desthiobiotin mogą być następnie eksponowane na biotynylowane cząsteczki w celu utworzenia przeciwstawnego gradientu biochemicznego. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej (EVOS FL), fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej (Zeiss LSM 510 i Nikon A1+) oraz odzyskiwania fluorescencji po fotobieleniu (FRAP; Zeiss LSM 510), mikrożele były bezpośrednio funkcjonalizowane streptawidyną-FITC lub po funkcjonalizacji neutrawidyną, jak opisano powyżej, funkcjonalizowane biotyną-atto565, biotyną-FITC i/lub destiobiotyną-FITC, która została wyprodukowana w zakładzie przez sprzężenie destiobiotyny-NHS z 6-aminofluoresceiną w 1 M buforze wodorowęglanowym (pH 8). Krzywe FRAP otrzymano przez wykreślenie, w funkcji czasu, intensywności fluorescencji plamki wybielającej minus tło znormalizowane do średniej intensywności przed wybielaniem skorygowanej o współczynnik wybielania, gdzie współczynnik wybielania został określony przez normalizację intensywności fluorescencji próbki oprócz plamki wybielającej znormalizowanej do jej średniej intensywności przed wybielaniem. Aby scharakteryzować przemieszczenie desthiobiotyny/biotyny, konstrukty hydrożelowe Dex-TAB kolejno funkcjonalizowano neutrawidyną, przemywano PBS, funkcjonalizowano desthiobiotyną-FITC, przemywano PBS i funkcjonalizowano biotyną-atto565, jednocześnie obrazując je za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. Na koniec hydrożele przemywano kilkakrotnie PBS w celu usunięcia niezwiązanego B-ATTO i obrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej w celu określenia względnej ilości D-FITC, która została zastąpiona przez B-ATTO. Eksperyment został powtórzony z innymi związkami biotyny, aby zademonstrować uniwersalność tego podejścia. W szczególności, hydrożele Dex-TAB sfunkcjonalizowane neutrawidyną/D-FITC inkubowano i stale monitorowano przez 8 dni w obecności 1 µM biotyny, biotynylowanego peptydu (tj. peptydu B; sekwencja aminokwasowa KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), immunoglobuliny G (B-IgG) lub nanocząstek złota (B-GNP) w PBS. Próbki były dokładnie przemywane PBS przez co najmniej jeden dzień w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek przed analizą intensywności D-FITC. Biologiczną funkcję supramolekularnie skompleksowanego B-HRP oceniano przy użyciu zestawu do barwienia DAB zgodnie z protokołem producenta. Biotynowane hydrożele 3D w kształcie kości zostały wytworzone przez wtryskiwanie Dex-TAB do formy z polidimetylosiloksanu (PDMS), która została wyprodukowana przy użyciu matrycy w kształcie miniaturowej kości. Kości hydrożelowe funkcjonalizowano FITC w sposób homogenny poprzez następującą po tym całonocną inkubację z roztworami 1 µM neutrawidyny, PBS i 1 µM D-FITC. Po dokładnym przemyciu PBS, górne części hydrożeli w kształcie kości inkubowano z 1 µM B-ATTO stosując timed dip-coating, a następnie przemywano PBS w celu usunięcia niezwiązanych fluoroforów i analizowano przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. W celu zbadania długoterminowej stabilności kompleksowania supramolekularnego, dwa hydrożele Dex-TAB o wymiarach około 5 × 5 × 5 mm były wyłącznie znakowane D-FITC i B-FITC, dokładnie przemywane PBS i kowalencyjnie łączone przy użyciu pośrednika w postaci czystego (tj. nie znakowanego) Dex-TA poprzez enzymatyczne sieciowanie cząsteczek tyraminy. Połączone konstrukcje hydrożelowe były następnie inkubowane w PBS i stale obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej przez 2 tygodnie w celu zbadania stabilności desthiobiotynowanych i biotynylowanych wzorów. Intensywności przekrojowe wszystkich obrazów fluorescencyjnych określono przy użyciu oprogramowania ImageJ.
Analiza sieci hydrożelowej
Analizę dyfuzyjną przeprowadzono w celu przeanalizowania wpływu postfunkcjonalizacji konstrukcji hydrożelowych Dex-TAB wielowartościową neutrawidyną na właściwości sieci hydrożelowej. W tym celu nieskazitelne konstrukty hydrożelowe Dex-TAB oraz konstrukty poddane homogenicznej postfunkcjonalizacji z użyciem nadmiernej ilości neutrawidyny łączono z dekstranem znakowanym FITC o promieniach hydrodynamicznych RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) i RH = 27 nm (2000 kDa). Konstrukty hydrożelowe w roztworach fluorescencyjnych były następnie analizowane przy użyciu fluorescencyjnego obrazowania konfokalnego (Zeiss LSM 510), a intensywność fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz konstruktów była kwantyfikowana przy użyciu oprogramowania ImageJ. Względne przenikanie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek dekstranu do Dex-TAB określano poprzez normalizację intensywności z intensywnością fluorescencji na zewnątrz hydrożeli. To samo podejście zastosowano do ilościowego określenia i porównania względnej przepuszczalności 5% (w/v) Dex-TAB dla znakowanych FITC konwencjonalnych przeciwciał IgG i VHH.
Modyfikacja i charakterystyka VHH
Destiobiotyna sprzężona z maleimidem została zsyntetyzowana przez reakcję amino-maleimidu i destiobiotyny-NHS przez 2 h w buforze wodorowęglanowym (pH 8). Desthiobiotin-maleimid oczyszczano metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na aparacie 2545 Quaternary Gradient Module (Waters) od 90%/10% wody/acetonitrylu (0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA)) do 100% acetonitrylu (0,1% TFA). Otrzymany produkt scharakteryzowano za pomocą spektrometrii mas; MS(ESI): m/z = 336,96 (obliczone m/z = 337,18 dla C16H24N4O4). Rozpuszczalniki odparowano przy użyciu rotacyjnej wyparki próżniowej, po czym desthiobiotynę-maleimid ponownie zawieszono w wodzie milliQ, zamrożono w ciekłym azocie i zliofilizowano w ciągu nocy. Desthiobiotynowane i biotynylowane VHH zostały zsyntetyzowane przez QVQ BV poprzez reakcję niemodyfikowanej cysteiny VHH odpowiednio z desthiobiotyną sprzężoną z maleimidem i biotyną sprzężoną z maleimidem. Zastosowaliśmy metodę ELISA do oceny powinowactwa do BMP7 niemodyfikowanych VHH w porównaniu z desthiobiotylowanymi (D-@BMP7) i biotynylowanymi (B-@BMP7). W tym celu 96-dołkowe płytki Maxisorp powlekano przez noc w temperaturze 4 °C 0,5 µg ml-1 ludzkiego BMP7 w PBS. Płytki blokowano 4% mlekiem odtłuszczonym w PBS i dodawano różne stężenia (0-5 µM) VHH w 1% mleku odtłuszczonym. Detekcję VHH przeprowadzono przy użyciu poliklonalnego króliczego przeciwciała przeciwko VHH i drugorzędowego koziego przeciwciała przeciw królikowi, sprzężonego z HRP. Dodanie H2O2 wraz z TMB identyfikowało ilość HRP poprzez konwersję w barwny produkt. H2SO4 dodawano w celu zatrzymania reakcji. Spektrofotometryczne pomiary absorpcji przeprowadzono przy długości fali 450 nm przy użyciu czytnika płytek (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Krzywe dawka-odpowiedź uzyskano przez dopasowanie funkcji logistycznej do danych pomiarowych za pomocą równania (4).
Hodowla komórek
Komórki C2C12-BRE-Luc hodowano w podłożu hodowlanym składającym się z 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml Penicyliny i 100 µg/ml Streptomycyny w DMEM. Komórki hodowano w warunkach 5% CO2 w temperaturze 37 °C, a pożywkę wymieniano 2 razy w tygodniu. Kiedy hodowla komórkowa osiągała stan zbliżony do konfluencji, komórki były odłączane przy użyciu 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA w 37 °C, a następnie podkulturowywane lub wykorzystywane do doświadczeń. Żywotność komórek zamkniętych w enzymatycznie usieciowanym 5% (w/v) Dex-TAB analizowano bezpośrednio po enkapsulacji (tj. dzień 0) oraz po czterech i siedmiu dniach hodowli in vitro poprzez inkubację komórek przez 30 min z 2 µM kalceiny AM (żywe) i 4 µM EthD-1 (martwe) w PBS i wizualizację znakowanych komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Analizę żywych/umarłych komórek przeprowadzono również po zmodyfikowaniu hydrożeli Dex-TAB zawierających komórki neutrawidyną, D-@BMP7 i B-@BMP7 przy użyciu tego samego protokołu funkcjonalizacji poprodukcyjnej, jak opisano w poprzedniej sekcji metod „Sieciowanie Dex-TAB i ortogonalna postfunkcjonalizacja”. Aktywność metaboliczną komórek analizowano poprzez barwienie komórek przy użyciu 0,5 g l-1 MTT w medium hodowlanym, a następnie wizualizację przy użyciu mikroskopu jasnego pola. Do eksperymentów z indukcją BMP7, komórki były wysiewane w ilości 10,000 komórek cm-2 na plastiku do hodowli tkankowych i hodowane przez noc. Komórki były głodzone w podłożu hodowlanym zawierającym 0,5% (v/v) FBS przez okres 12 h. Po głodzeniu do hodowli komórkowej dodawano prefabrykowane konstrukty hydrożelowe Dex-TAB/neutravidin, Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidin/B-@BMP7 lub poddane działaniu biotyny Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, które następnie poddawano działaniu 100 ng ml-1 BMP7 przez 10 do 15 h (Supplementary Fig. 12). Następnie komórki lizowano przy użyciu reporterowego buforu lizującego i pojedynczego cyklu zamrażania-rozmrażania. Ekspresję lucyferazy określano przy użyciu testu lucyferazowego zgodnie z protokołem producenta i luminometru (Victor X3, Perkin Elmer). Ekspresja lucyferazy została znormalizowana do całkowitej zawartości DNA, która została określona ilościowo przy użyciu QuantiFluor dsDNA System zgodnie z protokołem producenta i fluorometrem (Victor X3).
Przedstawianie danych i statystyka
Spektrofotometryczne pomiary absorpcji HABA zostały wykonane na sześciu próbkach na warunek i przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe. Pomiary SPRi przeprowadzono na sześciu plamkach na warunek i podano jako średnią ± odchylenie standardowe (jasne kolorowe linie). Odczyty SPRi dla poszczególnych plamek zostały znormalizowane względem Rmax krzywych wiązania neutravidyny w celu skorygowania różnic w gęstości plamek (Ryc. 1 uzupełniająca). Kon, koff i Kd oddziaływań supramolekularnych wyznaczono z co najmniej trzech eksperymentów SPRi i podano jako średnią ± odchylenie standardowe lub nałożono na siebie poszczególne punkty danych. Pomiary FRAP fluorescencyjnie znakowanej streptawidyny przeprowadzono na co najmniej czterech konstruktach hydrożelowych dla każdego warunku i podano jako średnią ± odchylenie standardowe znormalizowane do średniej intensywności przed wybieleniem. Pomiary intensywności fluorescencji (konfokalne) (w tym eksperymenty poklatkowe) przeprowadzono na co najmniej czterech konstruktach hydrożelowych na warunek i podano jako średnią ± odchylenie standardowe lub nakładające się pojedyncze punkty danych, wszystkie znormalizowane do najwyższej średniej intensywności. Analiza regresji liniowej została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania OriginPro 2016. Wypieranie D-FITC przez biotynylowane cząsteczki mierzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej na dziesięciu próbkach na warunek. Istotność różnic badano za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya (dane były normalnie rozłożone, jak wskazał test Shapiro-Wilka: p > 0,1). Przenikanie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek dekstranu, VHH i IgG do Dex-TAB mierzono na czterech konstrukcjach hydrożelowych dla każdego warunku i podawano jako średnią ± odchylenie standardowe. Istotność różnic między przepuszczalnością VHH i IgG określono za pomocą testu Manna-Whitneya. Kwantyfikację żywych/umarłych przeprowadzono na trzech hydrożelach wypełnionych komórkami dla każdego warunku i podano jako średnią nałożoną na poszczególne punkty danych. Istotność różnic określono za pomocą testu ANOVA Kruskala-Wallisa. Analizy odpowiedzi na dawkę przeprowadzono przy użyciu trzech próbek dla każdego stężenia i przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe oraz nałożoną dopasowaną funkcję logistyczną opartą na równaniu (4). Przedziały ufności krzywych odpowiedzi na dawkę zostały automatycznie wygenerowane przez oprogramowanie do wykreślania wykresów. Względna indukcja komórek C2C12-BRE-Luc była mierzona na trzech próbkach in vitro dla każdego warunku i podawana jako średnia ± odchylenie standardowe. Istotność różnic określono za pomocą testów Kruskala-Wallisa ANOVA.
Schematics
Wszystkie wykresy wykonano przy użyciu oprogramowania OriginPro 2016. Wszystkie schematy wykonano przy użyciu oprogramowania ChemDraw Professional 16.0 oraz oprogramowania CorelDRAW X7.
Podsumowanie
Dalsze informacje na temat projektu badań dostępne są w Nature Research Reporting Summary, do którego odnośnik znajduje się w tym artykule.
.