2 Life History
FBF cercariae são minúsculas, são difíceis de identificar morfologicamente, e tipicamente têm uma prevalência extremamente baixa de infecção entre as populações de hospedeiros invertebrados intermediários (Cribb et al., 2011). Talvez como resultado destes atributos, o(s) hospedeiro(s) intermediário(s) seja(m) desconhecido(s) para todas as espécies de FBF excepto algumas: várias espécies do género de água doce Sanguinicola (ver Bullard e Overstreet, 2008) e as espécies marinhas Aporocotyle simplex (ver Køie, 1982; Køie e Petersen, 1988, infecções experimentais; sem aplicação de marcadores moleculares), Paracardicoloides yamagutii (ver Nolan e Cribb, 2004a; ver texto seguinte), C. forsteri (ver Cribb et al, 2011; ver texto seguinte), e Cardicola opisthorchis (ver Sugihara et al., 2014; ver texto seguinte). As sequências ITS2 rDNA têm sido usadas para combinar espécimes morfologicamente indeterminados de FBF larvar, ou seja, cercariae, esporocistos e rediae, colhidos de hospedeiros invertebrados com espécimes adultos morfologicamente distintos de hospedeiros de peixes simpáticos. De forma rápida e económica, os marcadores moleculares permitem a rápida detecção de infecções; identificação do agente infeccioso, por inferência filogenética ou por homologia de sequência a um táxon já sequenciado; e identificação de hospedeiros intermediários, ligando assim as fases do historial de vida de FBFs potencialmente patogénicas. Certamente, a determinação da identidade dos hospedeiros intermediários e definitivos compreende um primeiro passo crítico para a compreensão do ciclo de vida das FBFs. Além das abordagens diagnósticas, no entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre detalhes específicos da relação hospedeiro-parasita entre as FBFs e seus hospedeiros policarbonato, gastrópodes e intermediários bivalves. Afinal, sua história evolutiva pode muito bem ser influenciada tanto ou mais por esses hospedeiros intermediários do que por seus hospedeiros definitivos. Como tal, argumentamos que os estudos moleculares não devem substituir totalmente os estudos experimentais clássicos que fazem observações microscópicas directas das FBFs larvares e adultas nos tecidos do hospedeiro após a exposição de invertebrados ingénuos e hospedeiros definitivos (Køie, 1982).
Muita da informação relativa aos ciclos de vida das FBFs tem origem em programas de saúde de animais aquáticos ligados à aquacultura comercial: 17 de 109 (16%) das sequências FBF disponíveis no GenBank derivam de infecções na aquacultura marinha (Tabela 1.1). As FBF compreendem um dos poucos grupos de trematódeos cujos membros podem prejudicar o hospedeiro definitivo como adultos que ocluem os vasos sanguíneos e causam asfixia, como ovos que danificam ou obstruem os epitélios branquiais e os vasos branquiais, e como milagres que eclodem dos ovos incrustados no epitélio das guelras e que são retirados dos peixes (Bullard e Overstreet, 2002, 2008). Como tal, os seus ciclos de vida são preocupantes para as operações de aquacultura comercial porque as FBF podem matar ou debilitar os peixes e causar perdas económicas em tanques de água doce, pistas e gaiolas marinhas offshore. As sequências provenientes de FBFs não adultas que infectam hospedeiros gastrópodes, bivalves, e poliquete, que albergam estágios de reprodução assexuados – esporócitos, rediae, e cercaria – são muito menos numerosas (4 de 109) (Quadro 1.1) do que as de espécimes adultos que infectam hospedeiros de peixes.
No primeiro estudo publicado do ciclo de vida de FBF determinado pela aplicação de um método molecular, Nolan e Cribb (2004a) documentaram dois morfotipos cercados (“tipo A” e “tipo B”) infectando 80 de 11.314 (0,7%) espécimes do gastrópode hidrobiótico Posticobia brazieri nos riachos das marés de Queensland, Austrália. ITS2 rDNA de cercaria tipo A alinhado (100% de concordância) com espécimes adultos de P. yamagutii que foram coletados do sangue (aorta dorsal, átrio, ventrículo, brânquias, rim e vasos sanguíneos do intestino e bexiga natatória) de Anguilla reinhardtii salpicada de enguias longas. Em outro estudo, respondendo às preocupações sobre doenças associadas com infecções de C. forsteri infectando o atum rabilho cultivado T. maccoyii do sul da Austrália, Cribb et al. (2011) examinaram 9351 indivíduos de 11 famílias de bivalves, 2 gastrópodes e 24 policarbonatos para infecções por FBF. Dados da sequência ITS2 rDNA derivados de cercaria que infectou Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) alinhados com 100% de concordância com espécimes adultos de C. forsteri do coração de atum rabilho do sul do país vizinho em uma caneta de rede em Port Lincoln, Austrália. Eles também sequenciaram o fragmento de rDNA 28S (721 bp na região D1-D2) de cercaria de C. forsteri que infectou L. modestus. Seguindo a abordagem de Cribb et al. (2011), Sugihara et al. (2014) concentraram-se nos poliquetas enquanto examinavam 744 invertebrados para infecções por FBF num local de cultura do atum rabilho do Pacífico Thunnus orientalis, ao largo do sul do Japão. Foram encontrados esporocistos e cercaria de FBFs em cinco indivíduos de uma poliqueta terebelida (Terebella) coletada de dentro da casca de cracas mortas retiradas do substrato e de cordas e flutuadores abaixo da gaiola do mar. As sequências ITS2 e 28S dos esporocistos foram idênticas (100%) às dos adultos de C. opisthorchis do coração do atum rabilho do Pacífico cultivado.
Shirakashi et al. (2012) estudaram infecções simultâneas de Cardicola orientalis e C. opisthorchis no atum rabilho do Pacífico. Eles usaram dados da seqüência ITS2 rDNA para diferenciar os ovos de C. opisthorchis em forma de lua crescente na artéria filamentosa aferente dos ovos ovóides de C. orientalis que infectam as lamelas branquiais. Eles afirmaram que os primers PCR específicos da espécie aplicados em amostras de tecido das brânquias podiam complementar a histopatologia e ajudar a diagnosticar infecções antes que os ovos e os adultos fossem numerosos o suficiente para serem prontamente observados com microscopia ligeira. Yong et al. (2013) utilizaram dados completos da sequência ITS2 rDNA para identificar os ovos FBF alojados na brânquia de cinco espécies de borboletas (Perciformes: Chaetodontidae) da Grande Barreira de Corais como uma única espécie Cardicola chaetodontis (uma única diferença de par de base em duas amostras). Os ovos de FBF não são raramente observados no epitélio branquial e nas arteríolas branquiais dos peixes durante necropsias de rotina (SAB, observações pessoais), mas em muitos casos, os espécimes adultos correspondentes que infectam o sangue de cada peixe não são recuperados. As técnicas moleculares que extraem e amplificam eficazmente o ADN dos ovos de FBF, que são minúsculos, por exemplo, os ovos de C. chaetodontis são 40-60 μm em comprimento total, prometem revelar a presença de espécies não nomeadas de FBF e hospedeiros até agora não documentados se as sequências resultantes forem colocadas num contexto filogenético com sequências de espécies nomeadas. O mesmo pode ser dito das sequências derivadas de cercariae (ver texto seguinte). Usando a reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), Norte Do Santos et al. (2012) identificaram os ovos de C. forsteri agregados na brânquia do atum rabilho do sul. Da mesma forma, Kirchhoff et al. (2012) aplicaram este método para diagnosticar ovos de C. forsteri infectando T. maccoyii. Polinski et al. (2013) deram um passo adiante ao desenvolver uma técnica de PCR sensível e precisa em tempo real que também pode ser usada para a identificação de C. forsteri, C. orientalis e C. opisthorchis em amostras não letais. Não foi detectada nenhuma espécie cruzada ou amplificação genómica hospedeira em nenhum dos métodos testados, ou seja, o qPCR baseado no SYBR e um ensaio comum de TaqMan; contudo, a sua aplicação combinada melhorou a fiabilidade para diferenciar as espécies. Estes métodos confirmaram infecções simultâneas de C. forsteri e C. orientalis em T. maccoyii, indicando também a maior prevalência e distribuição de C. orientalis no hospedeiro.
Recentemente, a utilidade de ambas as técnicas desenvolvidas foi suportada para avaliar as consequências patológicas das infecções por FBF. Polinski et al. (2014) combinaram qPCR com transcrição imunológica do gene hospedeiro para quantificar as quantidades de DNA dos tecidos infectados por C. opisthorchis e C. orientalis. Eles também quantificaram a resposta imunológica do hospedeiro temporal a essas infecções no atum rabilho do Pacífico enjaulado. Dados anteriores documentaram adultos e ovos de C. orientalis na brânquia (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), enquanto adultos e ovos de C. opisthorchis infectaram o coração e artérias branquiais aferentes, respectivamente (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Polinski et al. (2014) revelaram, no entanto, uma correlação da transcrição de IgM com as altas quantidades de infecções “C. orientalis only” nos tecidos branquiais mas não com o DNA de C. opisthorchis, sugerindo que tal resposta imune neste órgão pode ser desencadeada pela presença de adultos e não de ovos. Além disso, altos níveis de DNA de C. orientalis no coração foram atribuídos à presença de gripe juvenil. Embora tais métodos não possam identificar as fases do historial de vida da FBF ou se as barbatanas estão ou não vivas ou mortas, esta abordagem quantitativa permite conjecturar sobre a intensidade da infecção e o estado de infecção, o que por si só é uma ferramenta promissora para futuros estudos epidemiológicos envolvendo peixes selvagens ou cultivados.
Brant et al. (2006) usaram a inferência filogenética (28S, 18S, e COI) no tratamento de vários cercados putativos não identificados de FBF isolados de gastrópodes (Planorbidae e Thiaridae) no Uganda, Quénia, e Austrália. Eles caracterizaram morfologicamente os cercariae com fotomicrografias e com base na presença/ausência de pontos oculares, pregas de barbatanas na cauda e no corpo do cercaria, e forma da cauda. Embora falte uma definição morfológica (diagnóstico) consistente e filogenética das cercarias de FBF, estas cercarias são tipicamente distintas: minúsculas, de bifurcação, sem sugador ventral, com um órgão penetrante distinto que provavelmente compreende um sugador anterior especializado (Truong e Bullard, 2013), uma prega de barbatana no corpo cercarial e uma prega de barbatana presente ou ausente no furcador da cauda (Cribb et al., 2011). Uma dessas cercarias (W5004) era especialmente bizarra morfologicamente, ou seja, descrita como afaríngea e furcocercosa, mas com “membranas laterais da cauda extravagantes e uma forma pontiaguda do corpo”, e nenhuma dessas cercarias tinha todas as características típicas das cercarias de FBF (ver texto anterior). Entretanto, a análise combinada de 18S e 28S desses cercariae os agrupou com outras seqüências de FBF (presumimos que “Sanguinicolid sp.” é a de “Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Por essa razão e por serem morfologicamente bizarros em relação às cercarias conhecidas, esses autores afirmaram que existe uma diversidade morfológica de cercarias de FBF muito maior do que a reconhecida na literatura até o momento. A identidade taxonômica e o significado filogenético dessas seqüências são discutidos mais adiante no texto.