Todos os organismos vivos evoluíram formas de se protegerem contra ataques abióticos e bióticos. Por exemplo, micróbios utilizam sistemas de restrição/modificação de DNA para se protegerem contra DNA estranho; eles também contêm sistemas de desintoxicação e/ou extrusão de xenobióticos ou espécies de oxigênio reativo excessivo (ROS). Os organismos multicelulares utilizam outros sistemas, e a participação de um ou mais níveis de imunidade está frequentemente envolvida. O melhor estudado e mais apreciado nos vertebrados dos maxilares é o sistema imunitário adquirido/adaptativo com as suas conhecidas células B e T e anticorpos específicos de antigénios. Este nível de imunidade é sobreposto ao sistema imunitário inato, muito mais fundamental e evolutivo, que está presente não só nos mamíferos mas também em outros animais e nas plantas. Só nas últimas décadas é que a importância da imunidade inata para a sobrevivência dos organismos multicelulares começou a ser apreciada. Ela protege humanos, outros animais e plantas dos milhares de micróbios potencialmente nocivos encontrados diariamente. O desenvolvimento da imunidade inata em organismos multicelulares exigiu a evolução de receptores de superfície celular que pudessem reconhecer/ligar moléculas cuja estrutura química/padrão é geralmente conservada dentro de várias classes de organismos estranhos, mas está ausente em moléculas “self”. Estas moléculas estranhas conservadas (não auto) são chamadas de Padrões Moleculares Associados a Microorganismos (MAMPs), também chamados de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs), e sua presença é detectada por membros de uma grande família de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os PRRs ativam uma ou mais vias de sinalização, frequentemente com a ajuda de co-receptores, para induzir respostas de defesa a jusante. Exemplos de MAMPs incluem lipopolissacarídeo bacteriano, flagelina, EF-Tu, DNA, lipoproteínas, peptidoglicanos e quitina fúngica. Várias excelentes revisões de MAMPs estão disponíveis .
Além do ataque biótico, os organismos devem lidar com uma variedade de ataques abióticos, tais como danos mecânicos ou celulares, bem como tensões ambientais como seca e salinidade. Algumas moléculas endógenas ativam o sistema imunológico inato quando são liberadas no espaço extracelular (incluindo o apoplast vegetal) de sua localização normal devido a danos (trauma); essas moléculas são chamadas de Padrões Moleculares Associados a Danos (DAMPs ). Os DAMPs são liberados passivamente das células moribundas devido a danos, trauma, isquemia, ou necrose induzida por infecção. Além disso, eles podem ser secretados ativamente por certas células imunes ou células gravemente estressadas (por exemplo, certas células cancerígenas). Enquanto as MAMPs são derivadas de microorganismos e activam o sistema imunitário inato, as DAMPs são derivadas de células hospedeiras e ambas iniciam e perpetuam respostas imunitárias inatas. É geralmente aceite que estas defesas ajudam a proteger o tecido danificado, que é vulnerável à infecção devido à ruptura de barreiras físicas que de outra forma impediriam a entrada de microrganismos. Em mamíferos, a inflamação é outro componente da resposta imune inata; não só ajuda a prevenir/suprimir a infecção, mas também ajuda na cura.
Esta revisão irá focar os DAMPs, particularmente os das plantas. Os DAMPs serão comparados aos MAMPs e a uma classe recém-identificada de ativadores de imunidade inata chamados de Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMPs ), uma vez que todas as três classes induzem muitas das mesmas respostas de defesa e compartilham alguns componentes de transdução de sinal.
Animal DAMPs
Iniciamos nossa discussão com os DAMPs animais desde que eles foram reconhecidos e estudados mais extensivamente. O termo DAMPs foi cunhado por Seong e Matzinger em 2004 . A Tabela 1 lista 26 DAMPs, incluindo purinas, pirimidinas, DNA (CpG não metilado), lipoproteínas oxidadas de baixa densidade, peptídeos N-formil, e uma variedade de proteínas. Foram identificados receptores cognatos para a maioria (Tabela 1). Além disso, alguns DAMPs formam complexos com moléculas/interactores parceiros para melhorar ou facilitar a sinalização. Entre eles está a caixa de grupo 1 de alta mobilidade (HMGB1), que é um dos primeiros DAMPs identificados e melhor caracterizados. O HMGB1 é uma proteína associada à cromatina altamente abundante que está presente em todas as células animais. Consiste em dois domínios básicos de ligação ao DNA, designados caixas de HMG A e B, e uma cauda terminal C altamente ácida que participa em interações intra-moleculares específicas . No núcleo, o HMGB1 liga o sulco menor do DNA para facilitar a condensação do DNA, a formação de nucleossomos e a ligação do fator de transcrição . Quando é liberado no meio extracelular a partir de células necróticas, danificadas ou gravemente estressadas, ele funciona como um DAMP com atividades quimiotrativas e indutoras de citocinose .
Extracellular HMGB1 medeia uma gama de respostas biológicas em associação com múltiplos receptores, tais como o Receptor de produtos Advanced Glycation End (RAGE), receptor tipo Toll-like 2 (TLR2), TLR4, TLR9, receptor de quimiocina C-X-C tipo 4 (CXCR4), Siglec-10, e Receptor de Imunoglobulina T-Cell Mucin 3 (TIM3) . Notavelmente, a formação heterocomplexa específica entre o HMGB1 e uma variedade de interatores, como o adaptador MD-2 ou lipopolissacarídeos ligantes pró-inflamatórios, e oligodeoxinucleuídos CpG, melhora ou facilita a sinalização e, em alguns casos, é fundamental para o reconhecimento do HMGB1 por receptores distintos (Tabela 1). A formação heterocomplexa específica parece ser pelo menos parcialmente regulada pelos diferentes estados redox do HMGB1, que em parte dependem de uma ligação de dissulfureto intra-molecular reversível formada entre os resíduos de cisteína 23 e 45 . Estudos recentes mostraram que o HMGB1 reduzido forma um heterocomplexo com CXCL12, que promove o recrutamento de células inflamatórias para tecidos danificados através do reconhecimento pelo receptor CXCR4 . A ligação dissulfeto contendo HMGB1 liga especificamente MD-2, o que facilita o reconhecimento por TLR4, levando à indução da ativação transcripcional mediada por NF-κB de citocinas pró-inflamatórias . O HMGB1 também interage com vários outros receptores, incluindo RAGE e TLR2; atualmente não está claro se são necessários estados redox específicos para o seu reconhecimento por esses receptores . As diversas atividades, moléculas parceiras e receptores do HMGB1 provavelmente são responsáveis por seus múltiplos papéis em muitas doenças humanas prevalentes e devastadoras.
Recentemente descobrimos que o HMGB1 liga ácido salicílico (SA); isso suprime tanto a atividade quimioatrativa reduzida do HMGB1 quanto a capacidade da ligação de dissulfeto contendo HMGB1 de induzir a expressão de genes pró-inflamatórios de citocinas e COX-2 . Os sítios de ligação SA no HMGB1 foram identificados nos domínios da caixa do HMG por estudos de NMR e confirmados por análises mutacionais. Uma proteína HMGB1 mutada em um dos sítios de ligação da SA manteve a atividade quimiotrativa, mas perdeu a ligação e inibição pela SA, estabelecendo assim firmemente que a ligação da SA ao HMGB1 suprime diretamente suas atividades pró-inflamatórias. Também foram identificados derivados naturais e sintéticos de SA com muito maior potência de inibição do HMGB1, fornecendo assim prova de conceito de que novas moléculas baseadas em SA com alta eficácia são alcançáveis.
DAPS de plantas
Em contraste com os animais, muito menos DAMPs foram identificados em plantas até a data (Tabela 2). A classe maior e indiscutivelmente a mais bem caracterizada são os polipeptídeos/peptídeos produzidos a partir de proteínas precursoras maiores. Estes incluem três famílias descobertas por Ryan e seus colegas durante seus estudos para identificar systemin – um termo “usado para descrever sinais de defesa de polipeptídeos que são produzidos pela planta em resposta a danos físicos e que induzem genes de defesa, seja local ou sistemicamente” . Um polipéptido de 18 aminoácidos (aa) foi isolado a partir de 60 lb de plântulas de tomate e demonstrou induzir a síntese de proteínas inibidoras da proteinase induzível em feridas. Este sistema do tomate é gerado pelo processamento induzido por feridas de uma prosystemin 200 aa prohormone, que se encontra no citoplasma das células do parênquima floema vascular. Systemin induz as células companheiras vizinhas e os elementos peneirados do feixe vascular a sintetizar o ácido jasmônico (JA), que por sua vez ativa sistemicamente a expressão dos genes inibidores da proteinase .
Systemin está presente em muitas outras espécies de Solanáceas, incluindo a batata, a pimenta e a sombra noturna , não é encontrada no tabaco. Esta descoberta levou o grupo de Ryan a procurar por outro tipo de systemin. Finalmente, dois polipéptidos de 18 aa ricos em hidroxiprolina, que são processados a partir de uma pré-proteína de 165 aa mas não partilham nenhuma homologia de sequência com o tomate systemin, foram identificados .
Uma terceira família de DAMPs baseados em peptídeos foi descoberta em Arabidopsis . Estes 23 peptídeos elicitores de plantas aa (Peps) são derivados de um precursor 92 aa. Dois receptores foram identificados para AtPepl, PEPR1, e PEPR2 . O AtPeps induz uma variedade de respostas imunes inatas e aumenta a resistência, e uma forma de precursor ProPep3 foi recentemente liberada para o espaço extracelular após infecção por Arabidopsis com Pseudomonas syringae hemi-biotrofas. Um ortolog de milho (Zea mays), ZmPep1, foi posteriormente identificado e demonstrou aumentar a resistência a patógenos microbianos, tal como o AtPepl . Para uma discussão mais aprofundada dos elicitores peptídios endógenos, veja Yamaguchi e Huffaker .
Uma outra classe de DAMPs encontrados em plantas, assim como em animais, é derivada da matriz extracelular. Em vertebrados fragmentos de hialuronan, um polissacarídeo linear simples que consiste em repetir o ácido D-glucurônico e D-N-acetilglucosamina, induzem imunidade inata quando liberados por danos mecânicos ou por enzimas hidrolíticas . Estes fragmentos são percebidos pelos receptores TLR2 e TLR4, ricos em leucina e contendo TLR4. Da mesma forma, as plantas contêm o polissacarídeo homalacturonano pectíco, um polímero linear de ácido galacturónico 1, 4-linked α-D, que ajuda a manter a integridade da parede celular. Fragmentos deste polímero, chamados oligogalacturonídeos (OGs), podem ser liberados mecanicamente ou mais comumente por enzimas hidrolíticas codificadas por patógenos. Os OGs induzem respostas imunes inatas, incluindo ativação MAPK, deposição de calose, produção de ROS, Ca2+ citosólico elevado, e ativação de genes de defesa. A cinase associada à parede 1 (WAK1) foi identificada como um receptor provável para OGs .
ATP extracelular (eATP) compreende ainda outra classe de DAMPs vegetais encontrados tanto em plantas quanto em animais. Apesar de décadas de evidência crescente de que o ATP age como uma molécula de sinalização, esta função foi largamente descontada/descrevida, provavelmente devido à natureza ubíqua do ATP e ao papel central como a moeda energética universal em todos os organismos vivos, das bactérias aos seres humanos. Somente com a identificação de seus receptores localizados na membrana plasmática, primeiro nos animais (ver ) e depois nas plantas, sua função de sinalização foi aceita em ambos os reinos. Nos animais a eATP atua como um neurotransmissor e molécula de sinalização que participa da contração muscular, morte celular e inflamação. Dois tipos de receptores estão envolvidos: um receptor P2Y de proteína G acoplada e um receptor P2X de canal iônico ligeiro. Nas plantas o papel de sinalização da eATP foi mais recentemente confirmado com a identificação do seu receptor, Não Responde aos Nucleotídeos 1 (DORN1 ). A designação da eATP como DAMP da planta é baseada nas observações combinadas de que i) o mutante dorn1 apresenta resposta transcripcional suprimida não só ao ATP mas também à ferida, ii) a maioria dos genes induzidos pela aplicação da eATP são também induzíveis à ferida, e iii) o tratamento eATP induz respostas imunológicas inatas típicas, incluindo o influxo citosólico Ca2+, ativação MAPK, e indução de genes associados densos, incluindo alguns envolvidos na biossíntese de JA e etileno . Entretanto, ainda não se sabe se contribui para a resistência a patógenos.
Identificamos recentemente uma quarta classe de DAMPs vegetais, a proteína HMGB da Arabidopsis AtHMGB3 . Todas as células eucarióticas, incluindo as plantas, têm proteínas relacionadas ao HMGB1. Na Arabidopsis, 15 genes codificam proteínas que contêm domínio HMG-box. Elas foram subdivididas em quatro grupos: (i) proteínas do tipo HMGB, (ii) proteínas A/T-rich interaction domain (ARID)-HMG, (iii) proteínas 3xHMG que contêm três caixas de HMG, e (iv) a proteína de reconhecimento específico da estrutura 1 (SSRP1) . Com base em sua localização nuclear e estrutura de domínio, as oito proteínas do tipo HMGB (HMGB1/2/3/4/5/6/12/14) são pensadas para funcionar como proteínas cromossômicas arquitetônicas, semelhantes ao HMGB1 de mamíferos. Notavelmente, AtHMGB2/3/4 estão presentes no citoplasma e também no núcleo . A função citoplasmática destas proteínas não é conhecida. Entretanto, as subpopulações citoplasmáticas devem ter maior acesso ao espaço extracelular (apoplásto) após o dano celular, em comparação com os AtHMGBs localizados exclusivamente no núcleo, uma vez que eles não estão ligados ao DNA e só precisam atravessar a membrana plasmática para entrar no apoplásto. Dado o papel bem estabelecido do HMGB1 de mamíferos como o DAMP prototípico, a presença de uma subpopulação citoplasmática do AtHMGB3 levantou a possibilidade desta proteína servir a uma função similar. De fato, quando o AtHMGB3 recombinante foi infiltrado nas folhas de Arabidopsis, ele exibia atividades semelhantes ao DAMP, semelhantes às do AtPep1. Tratamento com ativação MAPK induzida por ambas as proteínas, deposição de calose, expressão gênica relacionada à defesa e aumento da resistência à Botrytis cinerea necrófica .
Em contraste com o HMGB1 de mamíferos, que pode ser secretado ativamente após modificação pós-tradução, não há evidência de secreção de AtHMGB3. Ele provavelmente entra passivamente no espaço extracelular quando as células são danificadas mecanicamente, como por insetos, ou durante a infecção por patógenos necrófagos. De facto, a infecção por B. cinerea causou a libertação de AtHMGB3 no apoplast dentro de 24 h após a inoculação. Tal liberação rápida durante a fase inicial da necrose celular induzida por necrotrofos poderia aumentar a resistência ativando respostas imunes .
Análises adicionais revelaram que o AtHMGB3, como o HMGB1, liga SA, e que esta interação, que é mediada por resíduos de Arg e Lys conservados na caixa única de HMG do AtHMGB3, inibe sua atividade DAMP . Esta descoberta parece conflitar com o conhecido papel da SA como um regulador positivo de respostas imunológicas . Entretanto, enquanto as respostas de defesa induzidas pelas SA são críticas para a resistência a patógenos biotróficos e hemi-biotróficos, o principal hormônio responsável pela ativação das defesas contra patógenos necróficos e insetos é a JA . As vias de sinalização de defesa JA e SA são geralmente antagónicas entre si. A inibição mediada pela SA da atividade do DAMP do AtHMGB3 pode, portanto, fornecer um mecanismo através do qual essas vias se cruzam. Neste cenário, danos celulares causados por infecção com patógenos necrófagos levariam à liberação do AtHMGB3 nos espaços extracelulares; isto ativaria as defesas associadas ao JA/etileno para ajudar a neutralizar esta ameaça. Em contraste, a infecção por patógenos biotróficos induz a biossíntese de SA. O aumento dos níveis de SA poderia então antagonizar a activação das defesas associadas às JA ao suprimir a actividade DAMP do AtHMGB3, assim como promover a activação das defesas associadas às SA que são mais eficazes contra este tipo de patogéneo .
A descoberta de que o AtHMGB3 extracelular é um DAMP vegetal cuja actividade indutora de resposta imunitária é inibida pela ligação às SA fornece provas cruzadas de que as proteínas HMGB funcionam extracelularmente como DAMPs tanto em plantas como em animais. Além disso, destaca a existência de objectivos comuns e mecanismos de acção partilhados para as SA nas plantas e nos seres humanos. Curiosamente, a maioria dos DAMPs vegetais identificados até à data têm contrapartidas em animais. Os nossos estudos indicaram ainda que as plantas e os animais partilham alvos comuns de SA para além dos HMGBs . Por exemplo, a enzima glicolítica gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), tanto nas plantas como nos seres humanos, liga as SA e, como resultado, alterou a actividade. A SA suprime o papel da GAPDH na replicação do Tomato Bushy Stunt Virus nas plantas e pode ter efeitos semelhantes na replicação do vírus da hepatite C em humanos . Também suprime a morte celular neuronal mediada por GAPDH em animais . Análises preliminares de telas de alta produtividade sugerem a existência de muitos mais alvos SA tanto em plantas quanto em humanos. Talvez a presença de múltiplos alvos de SA em animais evoluiu em resposta ou à ingestão de baixos níveis de SA que estão naturalmente presentes no material vegetal, ou à síntese endógena de SA a partir de benzoatos . Estudos futuros serão necessários para avaliar se estas novas proteínas vegetais e animais que interagem com a SA funcionam como DAMPs.
NAMPs
Nematodes, um dos animais mais abundantes na natureza, parasitam tanto as plantas como os animais. Vários estudos indicaram que as plantas podiam perceber infecção por nematódeos , mas a identidade do sinal percebido derivado de nematódeos era desconhecida. Recentemente identificamos um grupo de moléculas de sinalização de defesa de vários gêneros de nematódeos parasitas de plantas, incluindo os nematódeos do nó-raiz e nematódeos do cisto. Eles são uma família de feromonas de nematóides evolutivamente conservadas chamadas ascarosides. Ascr#18, o ascarósido mais abundante nos nematódeos parasitas vegetais, induz respostas imunes inatas, incluindo a ativação de i) MAPKs, ii) genes de defesa, e iii) as vias de sinalização de defesa SA e JA, bem como, maior resistência a patógenos virais, bacterianos, fúngicos e oomycete e nematódeos de nós radiculares em várias espécies de dicotiledôneas e monocotiledôneas.
MAMPs, DAMPs e NAMPs
Embora as fontes dos sinais indutores sejam muito diferentes, com MAMPs derivadas de micróbios, NAMPs derivadas de nematóides, e DAMPs sendo moléculas endógenas aberrantemente localizadas, Estudos de Arabidopsis sugerem que a maioria dos membros dessas três classes de moléculas indutoras de imunidade ativa a sinalização imunológica inata através de vias que compartilham as mesmas kinases BRI1-Associated Kinase1 (BAK1) e BAK1-Like Kinase1 (BKK1), ricas em leucina, semelhantes às kinases BRI1-Associated Kinase1 (BAK1) e BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, para NAMP resultado não publicado M. Manohar, F.C. Schroeder, e D.F. Klessig). Além disso, essas moléculas induzem muitas das mesmas respostas de defesa imunológica inatas, incluindo um influxo de Ca+2 no citosol, deposição de calose, ativação dos MAPKs MPK3 e MPK6 associados à defesa, produção de ROS e expressão aprimorada de muitos genes relacionados à defesa (Tabela 3). Foram identificados receptores vegetais para várias MAMPs, tais como FLS2 para flagellin/flg22 e EFR para EF-Tu/elf18 . Receptores para a maioria dos DAMPs vegetais também foram descobertos, incluindo Arabidopsis PEPR1/2 para Peps , Arabidopsis WAK1 para OGs , e Arabidopsis DORN1 para eATP . Enquanto o tomate SR160 foi inicialmente reportado como o receptor para o sistemain , dois estudos recentes argumentam que não é . Os receptores vegetais para AtHMGB3 e o ascaroside NAMP ascr#18 permanecem desconhecidos (Tabela 2). Também não se sabe se a sinalização DAMP do AtHMGB3 é melhorada ou facilitada pela interação de moléculas como foi mostrado para mamíferos HMGB1.