Abstract
A principal via de transmissão da infecção pelo CoV da SRA é presumivelmente as gotículas respiratórias. Contudo o vírus é também detectável noutros fluidos corporais e excrementos. Foi estudada a estabilidade do vírus a diferentes temperaturas e humidade relativa em superfícies lisas. O vírus seco em superfícies lisas manteve a sua viabilidade por mais de 5 dias a temperaturas de 22-25ºC e humidade relativa de 40-50%, ou seja, ambientes com ar condicionado típico. Contudo, a viabilidade do vírus foi rapidamente perdida (>3 log10) a temperaturas e humidade relativa mais elevadas (por exemplo, 38°C, e humidade relativa de >95%). A melhor estabilidade do vírus corona da SRA a baixa temperatura e ambiente de baixa humidade pode facilitar a sua transmissão na comunidade em área subtropical (como Hong Kong) durante a Primavera e em ambientes com ar condicionado. Pode também explicar porque alguns países asiáticos em área tropical (como a Malásia, Indonésia ou Tailândia) com ambiente de alta temperatura e humidade relativa elevada não tiveram grandes surtos comunitários da SRA.
1. Introdução
SRA, foi uma nova doença emergente associada à pneumonia grave e que se espalhou para envolver mais de 30 países nos 5 continentes em 2003. Um novo coronavírus foi identificado como a sua causa. A SRA teve um impacto dramático nos serviços de saúde e economias dos países afectados, e a taxa de mortalidade global foi estimada em 9%, mas aumentando para 50% nas pessoas com 60 anos ou mais. Uma característica notável desta doença foi a sua predilecção pela transmissão no contexto dos cuidados de saúde e pelo estreitamento dos contactos familiares e sociais. Presume-se que a doença se propaga por gotículas, contacto directo ou indirecto próximo, mas a importância relativa destas vias de transmissão não é actualmente clara. Um estudo mostrou que a geração de aerossóis virais por um doente com SRA era possível e, portanto, a transmissão por via aérea de gotículas era um possível meio de transmissão. Contudo, o papel dos fomites e da contaminação ambiental na transmissão da infecção ainda não está presentemente esclarecido. Um surto de doença que afecta mais de 300 residentes em edifícios de apartamentos altos (Amoy Gardens) em Hong Kong não pode ser explicado pela transmissão de gotículas respiratórias de doentes infectados. O vírus infeccioso é detectável nas fezes , e acredita-se que a aerossolização do vírus nas fezes contaminadas seja o modo de transmissão deste surto .
Nós e outros relatamos que a infecciosidade do CoV da SRA (vírus corona da SRA) foi perdida após o aquecimento a 56ºC durante 15 minutos, mas que se manteve estável durante pelo menos 2 dias após a secagem em plástico. Foi completamente inactivado por fixadores comuns usados em laboratório. Outro estudo mostrou que foi inactivado por luz ultravioleta, alcalina (), ou ácida (). Foi demonstrado que os coronavírus humanos sobrevivem em PBS ou meio de cultura com 5-10% FCS durante vários dias, mas só sobrevivem algumas horas após a secagem . Houve alguns estudos que relataram uma associação entre o surto da SRA, factores metrológicos e poluição atmosférica . Assim, a informação sobre a sobrevivência do vírus corona da SRA (SCoV) no ambiente a diferentes condições de temperatura e humidade é de interesse significativo para compreender a transmissão do vírus. Um estudo recente usando o vírus corona de substituição (vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) e o vírus da hepatite do rato (MHC)) investigou o efeito da temperatura do ar e humidade relativa na sobrevivência do vírus corona na superfície. Os efeitos destes factores ambientais na sobrevivência do vírus corona da SRA continuam a ser pouco claros. Neste estudo, relatamos a estabilidade do vírus corona da SRA a diferentes temperaturas e humidade relativa.
2. Material e Métodos
2.1. Linha de Vírus e Células
A estirpe da SRA CoV utilizada neste estudo é HKU39849. As células renais de macaco fetal (FRhK-4) foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM, Gibco, EUA) com 10% de soro de bezerro fetal e estreptomicina penicilina (Gibco, EUA) a 37°C em 5% de CO2 e foram usadas para o crescimento do vírus do stock e para a titulação da infecciosidade viral .
2.2. Preparação do Vírus de Estoque
Vírus de Estoque foi colhido quando a infecção de aproximadamente 75% da monocamada celular de um frasco infectado com vírus manifestou efeito citopático (CPE). As células infectadas foram submetidas a um ciclo de congelamento e descongelamento centrífugo a 2000 rpm por 20 minutos para remover os resíduos celulares e o sobrenadante de cultura foi aliquotado e armazenado a -80°C até o uso.
2,3. Determinação da Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos (50%) (TCID50)
96-poços placas de microtítulo contendo 100 μL de FRhK-4 confluente foram infectados com 100 μL de diluições em série 10 vezes mais diluição do vírus de estoque em meio mínimo essencial com 1% FCS (meio de manutenção) começando de 10-1 a 108. As titulações foram feitas em quadruplicado. As células infectadas foram incubadas durante 4 dias a 37°C. A aparição de CPE foi registada diariamente. TCID50 foi determinado de acordo com Reed e o método Muench .
2.4. Efeito da Secagem, Calor e Umidade Relativa
Dez microlitros de meio de manutenção contendo 107 TCID50 por mL de vírus foram colocados em poços individuais de placas plásticas de 24 poços e deixados secar à temperatura ambiente (22~25°C) e umidade relativa de 40-50% (ou seja, condições prevalecentes em uma sala com ar condicionado típico). Cem microlitros de MM foram usados para ressuspender o vírus a 0 hr, 3 hr, 7 hr, 11 hr, 13 hr, 24 hr, e até 4 semanas e a infecciosidade residual do vírus foi titulada. Controles em tubo eppendorf fechado foram incluídos a cada vez e tratados de forma similar, mas sem secagem.
O experimento foi repetido em diferentes temperaturas (38°C, 33°C, 28°C) e umidades relativas (>95%, 80~89%) por 3 hr, 7 hr, 11 hr, 13 hr, e 24 hr. Um nebulizador em condição controlada foi usado para gerar ambiente de alta e baixa umidade relativa. Todos os experimentos acima foram conduzidos em duplicata e a infecciosidade viral residual foi titulada.
2.5. Ensaio de Infectividade
A infecciosidade do vírus residual foi titulada em quadruplicado em placas de 96 microtítulo contendo 100 μL de células FRhK-4 confluentes. 100 μL de diluições seriais de 10 vezes o vírus em meio de manutenção a partir de 10-1 a 108 foi adicionado às células FRhK-4. As células infectadas foram incubadas a 37°C durante 4 dias. A aparição de CPE foi registada diariamente. O TCID50 foi determinado de acordo com o método de Reed e Muench .
3. Resultados
Dez microlitros de 107 TCID50 por mL de vírus foram colocados em poços individuais de uma placa de plástico de 24 poços (representando uma superfície não porosa) e secos. O vírus seco foi então incubado a diferentes temperaturas (38°C, 33°C, 28°C) a diferentes humidades relativas (>95%, 80~89%) durante 3 hr, 7 hr, 11 hr, 13 hr, e 24 hr e a infecciosidade viral residual foi titulada. Um experimento similar foi conduzido à temperatura ambiente e umidade relativa de cerca de 40-50% (sala climatizada) por até 4 semanas. O vírus secou em plástico retido viável por até 5 dias a 22~25°C a uma umidade relativa de 40~50% com apenas perda de título (Figura 1). Depois disso, a infecciosidade do vírus é gradualmente perdida. A perda de infecciosidade do vírus em solução foi geralmente semelhante ao vírus seco sob estas condições ambientais. Isto indica que o SRA CoV é um vírus estável que pode potencialmente ser transmitido por contacto indirecto ou por fomites, especialmente em ambientes com ar condicionado.
Infetividade residual do vírus a 22-25ºC com humidade relativa de 40-50% (titulo inicial 105/10 μL) e a 33ºC ou 38ºC com humidade relativa de >95%.
Umidade relativa alta (>95%) a uma temperatura relativamente baixa (28°C e 33°C) não afectou significativamente a infecciosidade do vírus (Figura 2(a)). A alta temperatura (38°C) a 80-90% de umidade relativa levou a uma perda de título de 0,25~2 a 24 hr (Figura 2(b)). Entretanto, se o vírus seco foi armazenado a alta temperatura (38°C) e alta umidade relativa (>95%), houve uma perda de título adicional de ~1,5 para cada ponto de tempo até 24 hr (0,38~3,38 ) quando comparado com alta temperatura (38°C) a uma umidade relativa menor 80-90% (Figuras 3(a)-3(c)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Infectividade do Coronavírus da SRA (105/10 μL) a diferentes temperaturas a (a) >95% de humidade relativa, (b) >80–89%.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Infectividade do Coronavírus da SRA (título inicial 105/10 μL) com diferente humidade relativa a (a) 38°C, (b) 33°C, e (c) 28°C.
4. Discussão
Vírus não se replicam fora das células vivas mas o vírus infeccioso pode persistir em superfícies ambientais contaminadas e a duração da persistência do vírus viável é afectada marcadamente pela temperatura e humidade. As superfícies contaminadas são conhecidas por serem vectores significativos na transmissão de infecções no ambiente hospitalar, bem como na comunidade. O papel dos fomites na transmissão de RSV tem sido claramente demonstrado. A sobrevivência de vírus em uma variedade de fomites tem sido estudada para vírus da gripe, paramixovírus, poxvírus e retrovírus . O coronavírus humano associado ao resfriado comum foi relatado para permanecer viável apenas por 3 horas em superfícies ambientais após a secagem, embora continue viável por muitos dias em suspensão líquida . Os vírus Parainfluenza e RSV foram viáveis após secagem em superfícies por 2 e 6 horas, respectivamente . Na forma aerossolizada, o coronavírus humano 229E é geralmente menos estável em alta umidade . A estabilidade ambiental do SCoV era anteriormente desconhecida e esta informação é claramente importante para compreender os mecanismos de transmissão deste vírus num ambiente hospitalar e comunitário.
No presente estudo, demonstrámos que o SRA CoV pode sobreviver pelo menos duas semanas após a secagem em condições de temperatura e humidade, encontradas num ambiente com ar condicionado. O vírus é estável durante 3 semanas à temperatura ambiente num ambiente líquido, mas é facilmente morto pelo calor a 56ºC durante 15 minutos . Isto indica que o SRA CoV é um vírus estável que pode potencialmente ser transmitido por contacto indirecto ou por fomites. Estes resultados podem indicar que superfícies contaminadas podem ter um papel importante na transmissão da infecção no hospital e na comunidade.
Os nossos estudos indicam que o SCoV é relativamente mais estável que os vírus corona humanos 229E ou OC43 e alguns outros patogénios respiratórios virais, como o vírus sincicial respiratório. Estes resultados sugerem que, embora a transmissão directa de gotículas seja uma via importante de transmissão, o papel dos fomites e da contaminação ambiental na transmissão do vírus pode desempenhar um papel significativo na transmissão do vírus. Em particular, os fomitos podem contribuir para a transmissão contínua da infecção no ambiente nosocomial que continua a ocorrer, apesar da grande atenção e das precauções rigorosas tomadas para evitar a propagação das gotículas. Para além das precauções com as gotas, é necessário reforçar as precauções de contacto e a lavagem das mãos.
A contaminação fecal do vírus corona SCoV pode, assim, ser uma via eficaz de transmissão da doença. O surto no Amoy Garden em Hong Kong que afectou mais de 300 residentes num bloco de um único apartamento com a possibilidade de ter sido transmitido por esgotos contaminados. A estabilidade do vírus em superfícies ambientais e sua presença nas fezes indica o potencial que a contaminação fecal da produção de alimentos frescos pode representar uma ameaça para a transmissão do vírus; especialmente em países com sistemas de saneamento e eliminação de esgotos deficientes e que são necessários estudos para abordar esta possibilidade.
Neste estudo, mostrámos que temperaturas elevadas com humidade relativa elevada tem um efeito sinergético na inactivação da viabilidade do CoV da SRA enquanto que temperaturas mais baixas e baixa humidade suportam a sobrevivência prolongada do vírus em superfícies contaminadas. As condições ambientais de países como a Malásia, Indonésia, e Tailândia não são assim propícias à sobrevivência prolongada do vírus. Em países como Singapura e Hong Kong onde existe um uso intensivo de ar condicionado, a transmissão ocorreu em grande parte em ambientes bem climatizados, como hospitais ou hotéis. Além disso, um estudo separado mostrou que durante a epidemia, o risco de aumento da incidência diária da SRA foi 18,18 vezes maior em dias com uma temperatura do ar mais baixa do que em dias com uma temperatura mais alta em Hong Kong e outras regiões. No seu conjunto, estas observações podem explicar porque alguns países asiáticos na área tropical (com temperaturas elevadas e humidade relativa elevada) como a Malásia, Indonésia e Tailândia não tiveram surtos nosocomiais da SRA (Tabelas 1 e 2(a)-2(c)). Pode também explicar porque é que Singapura, que também está na área tropical (Tabela 2(d)), teve a maioria dos seus surtos da SRA em hospitais (ambiente com ar condicionado). Curiosamente, durante o surto da SRA em Guangzhou, os clínicos mantiveram as janelas dos quartos dos doentes abertas e bem ventiladas e estas podem muito bem ter reduzido a sobrevivência do vírus e isto reduziu a transmissão nosocomial. O SRA CoV pode reter a sua infecciosidade até 2 semanas em ambiente de baixa temperatura e baixa humidade, o que pode facilitar a transmissão do vírus na comunidade como em Hong Kong que se localiza na área subtropical (Tabela 2(e)). Outros factores ambientais incluindo a velocidade do vento, luz solar diária e pressão atmosférica, mostraram estar associados à epidemia da SRA, devem também ser considerados. A dinâmica da epidemia da SRA envolve múltiplos factores incluindo a propriedade física do vírus, ambientes exteriores e interiores, higiene, espaço e predisposições genéticas . Compreender a estabilidade dos vírus em diferentes condições de temperatura e humidade é importante para compreender a transmissão de um novo agente infeccioso, incluindo o da recente gripe Apandémica H1N12009.
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| *Os dados estão disponíveis no site da BBC sobre o tempo (http://www.bbc.co.uk/weather/world/city_guides/results). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Conflito de interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses.