ADN-metiltransferazele (MTase) care transferă o grupare metil de la S-adenozilmetionină la reziduuri de adenină sau citozină, se găsesc într-o mare varietate de procariote și eucariote. Trebuie să se ia în considerare metilarea atunci când se digeră ADN cu endonucleaze de restricție, deoarece scindarea poate fi blocată sau afectată atunci când o anumită bază din situsul de recunoaștere este metilată.
Metilarea procariotă
La procariote, MTazele au fost cel mai adesea identificate ca elemente ale sistemelor de restricție/modificare care acționează pentru a proteja ADN-ul gazdă de scindarea de către endonucleazele de restricție corespunzătoare. Cele mai multe tulpini de laborator de E. coli conțin trei ADN-metilaze specifice situsului.
- Dam metilază-metilarea la poziția N6 a adeninei în secvența GATC (1,2).
- Dcm metiltransferaze-metilarea la poziția C5 a celei de-a doua citosine în secvențele CCAGG și CCTGG (1,3).
- EcoKI metilază-metilarea adeninei în secvențele AAC(N6)GTGC și GCAC(N6)GTT.
Câteva sau toate situsurile pentru o endonuclează de restricție pot fi rezistente la scindare atunci când sunt izolate din tulpini care exprimă metilazele Dam sau Dcm dacă situsul de recunoaștere a metilazei se suprapune peste situsul de recunoaștere a endonucleazei. De exemplu, ADN-ul plasmidic izolat din E. coli Dam+ este complet rezistent la clivarea de către MboI, care clivează la situsurile GATC.
Nu tot ADN-ul izolat din E. coli este metilat în aceeași măsură. În timp ce ADN-ul pBR322 este complet modificat (și, prin urmare, este complet rezistent la digestia MboI), doar aproximativ 50% din situsurile λ DNA Dam sunt metilate, probabil pentru că metilaza nu are posibilitatea de a metila complet ADN-ul înainte ca acesta să fie împachetat în capul fagului. Ca urmare, enzimele blocate de modificarea Dam sau Dcm vor produce modele de digestie parțială cu ADN λ.
Siturile de restricție care sunt blocate de metilarea Dam sau Dcm pot fi nemetilate prin clonarea ADN-ului dumneavoastră într-o tulpină de E. coli dam-, dcm-, cum ar fi dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Siturile de restricție pot fi, de asemenea, blocate dacă este prezent un sit suprapus. În acest caz, o parte din secvența Dam sau Dcm este generată de secvența enzimei de restricție, urmată de secvența de flancare. Această situație ar trebui, de asemenea, să fie luată în considerare atunci când se proiectează digestări ale enzimelor de restricție.
Metilare eucariotă
Mtazele CpG, întâlnite la eucariote superioare (de exemplu, Dnmt1), transferă o grupare metil în poziția C5 a reziduurilor de citosină. Tiparele de metilare CpG sunt ereditare, specifice țesuturilor și sunt corelate cu expresia genelor. În consecință, s-a emis ipoteza că metilarea CpG joacă un rol în diferențiere și în expresia genelor (4).
Nota: Efectele metilării CpG reprezintă în principal o preocupare atunci când se digeră ADN genomic eucariot. Modelele de metilare CpG nu sunt păstrate odată ce ADN-ul este clonat într-o gazdă bacteriană.
Sensibilitatea la metilare
Tabelul de mai jos rezumă sensibilitatea la metilare pentru enzimele de restricție NEB, indicând dacă scindarea este sau nu blocată sau afectată de metilarea Dam, Dcm sau CpG dacă sau când aceasta se suprapune peste fiecare situs de recunoaștere. Acest tabel trebuie privit mai degrabă ca un ghid pentru comportamentul enzimelor enumerate decât ca un indicator absolut. Consultați REBASE , baza de date a enzimelor de restricție, pentru informații mai detaliate și exemple specifice pe care se bazează aceste orientări.
- Marinus, M.G. și Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.și Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. și Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. și Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legendă
| ● | Nu sensibil | ◆ | Împiedicat |
| ◼ | Blocat | ◇ ol | Împiedicat prin suprapunere |
| ◻ ol | Blocat de suprapunerea | ◇ scol | Împiedicat de unele combinații de suprapunere |
| ◻ scol | Blocat de unele combinații de suprapunere | ||
Cod cu o singură literă