Diagramele Arrhenius convexe și interpretarea lor

În ultimii ani, un număr tot mai mare de studii au măsurat dependența de temperatură a reacțiilor enzimatice atât pentru enzimele termostabile, cât și pentru cele mezostabile (enzime provenite de la organisme care se dezvoltă în mod optim la temperaturi ridicate și, respectiv, la temperatura normală a corpului). Dependența de temperatură este de obicei prezentată într-un grafic Arrhenius, care reprezintă logaritmul natural al coeficientului de viteză în funcție de reciproca temperaturii absolute (Fig. 1). Unele dintre metodologiile de măsurare a dependențelor de temperatură ale vitezelor de reacție au fost aplicate pentru a măsura, de asemenea, dependențele de temperatură ale efectelor cinetice izotopice (KIE) ale reacțiilor catalizate, iar astfel de experimente furnizează date experimentale foarte relevante pentru caracterizarea blocajelor dinamice ale reacțiilor (1-6). Un număr mare de modele teoretice au fost avansate pentru interpretarea acestui tip de date (7-19).

Experimentele asupra reacțiilor catalizate de o varietate de enzime dehidrogenază și oxidază termostabile și mezo-stabile au arătat că, în unele cazuri, diagrama Arrhenius pentru etapa chimică este convexă (20-23). În lucrarea de față, comentăm semnificația acestei observații și oferim o interpretare a acestei constatări care o plasează în perspectiva mai largă a cineticii chimice non-biologice, precum și a celei biochimice. Această lucrare evidențiază faptul că comportamentul Arrhenius convex pune o constrângere severă asupra coeficientului de viteză unimoleculară microcanonică pentru etapa chimică. În special, putem merge dincolo de interpretarea evidentă conform căreia un grafic Arrhenius convex poate fi interpretat ca o rată mai mică decât cea așteptată la temperaturi ridicate și putem spune, în anumite condiții, că coeficientul de viteză microcanonică unimoleculară pentru etapa chimică trebuie de fapt să scadă odată cu creșterea energiei.

În general, este de dorit să separăm interpretarea datelor experimentale în două etape. În primul rând, deducem consecințe generale care se bazează pe fundamente solide, cum ar fi termodinamica și principiile generale ale mecanicii statistice. În al doilea rând, trecem la modele mai detaliate din punct de vedere microscopic care se bazează pe fundamente mai puțin sigure. Aspectul nou al analizei de față se referă în întregime la prima etapă.

Caracteristica izbitoare a reacțiilor din ref. 20-23 pe care le discutăm aici este convexitatea pozitivă C a graficelor lor Arrhenius, unde 1 k(T) este coeficientul de viteză catalitică, iar T este temperatura. Scriem 2 unde 3 Ea este energia fenomenologică de activare dependentă de temperatură, iar R este constanta gazelor. Astfel, o convexitate pozitivă înseamnă că Ea scade odată cu creșterea temperaturii. În domeniul larg al cineticii, fără a restrânge considerațiile la cinetica enzimatică, atunci când pot fi observate diagrame Arrhenius neliniare, acestea sunt aproape întotdeauna concave, adică C este negativ. Acest rezultat general este explicat prin interpretarea lui Tolman a energiei de activare, care poate fi scrisă sub forma (25-27) 4 unde o bară dublă denotă o medie pe toate sistemele care reacționează, iar o singură bară denotă o medie pe toate sistemele, indiferent dacă acestea reacționează sau nu. Cu alte cuvinte, Ecuația 4 a lui Tolman afirmă că negativul pantei locale a unui grafic Arrhenius poate fi interpretat ca fiind egal cu energia medie a moleculelor care reacționează minus energia medie a tuturor reactanților posibili. Pentru reacțiile unimoleculare ale unei specii aflate în echilibru termic: 5 și 6 unde E este energia totală, dP/dE este densitatea de probabilitate normalizată ca un sistem să aibă energia E într-un ansamblu canonic la temperatura T, iar k(E) este coeficientul de viteză unimoleculară pentru un ansamblu microcanonic la energia E.§ De obicei, E̿ crește mai rapid decât Ē odată cu creșterea T, deoarece k(E) este de obicei o funcție crescătoare a energiei.¶ Acest lucru explică de ce Ea crește de obicei cu T și, prin urmare, de ce C este negativ. O diagramă Arrhenius convexă înseamnă că E̿ scade sau că crește mai puțin rapid decât Ē odată cu creșterea temperaturii, iar în paragraful următor argumentăm că acest lucru implică în mod obișnuit faptul că k(E) scade odată cu creșterea energiei în regiunea de energie care domină integralele din Ecuația 6.

Se poate face o afirmație mai precisă despre consecința faptului că E̿ scade sau crește mai puțin rapid decât Ē odată cu creșterea temperaturii. Observând că 7 unde β este 1/RT, iar ρ(E) este densitatea de stări, și folosind Ecuațiile 4-6, se poate arăta cu ușurință că 8 Astfel, afirmația că dEa/dT este negativă este aceeași cu afirmația că distribuția energiilor de reacție este mai îngustă decât distribuția energiilor reactanților. Dacă dP/dE ar fi simetrică în jurul lui Ē, atunci semnul lui dEa/dT ar depinde de forma funcției k(E), și nu doar de semnul acesteia. Dar dP/dE este, de fapt, o funcție foarte înclinată. Pentru moleculele tipice, forma sa este bine aproximată prin stabilirea lui ρ(E) din Ecuația 7 egală cu En-1, unde n este aproximativ egal cu numărul de grade de libertate (31). Dacă se asumă această formă și se presupune, de asemenea, că k(E) variază lent și liniar pe intervalul important al integralelor din Ecuația 6, se poate arăta că partea dreaptă a Ecuației 8 este proporțională cu dk/dE cu o constantă de proporționalitate pozitivă. Pentru funcții k(E) mai complicate, nu se mai dispune de o proporționalitate exactă, dar direcția efectului este stabilită de caracterul înclinat pozitiv al dP/dE. Deși identitatea semnelor lui dEa/dT și dk/dE nu este o teoremă matematică, este de așteptat ca ea să fie valabilă pentru densități normale de stări și funcții k(E) netede.

Acest rezultat prezintă o constrângere asupra oricărei interpretări microscopice și – la fel de important – sugerează noi interpretări microscopice. De exemplu, să presupunem că spațiul de configurație al reactanților poate fi împărțit în două tipuri de conformații, dintre care una (numită tip R) este reactivă cu coeficientul de viteză kR(E), iar cealaltă (numită tip N) este nereactivă cu coeficient de viteză zero. Atunci 9 unde PR(E) este probabilitatea condiționată ca un sistem care are energia E să se afle într-o conformație de tip R. Acest lucru oferă un mecanism pentru ca k(E) să scadă cu E, adică PR(E) scade cu E mai repede decât crește kR(E). Acest lucru s-ar putea întâmpla deoarece sistemele cu energie mai mare vizitează o regiune mai largă a spațiului de fază și, prin urmare, petrec o fracțiune mai mică din timpul lor într-o singură regiune constrânsă. Această interpretare poate avea o importanță deosebită pentru enzimologie. În ultimii ani, mai multe studii au fost preocupate de înțelegerea rolului eșantionării conformaționale în cataliza enzimatică (17, 18, 22, 32-37). Într-o analiză recentă, Bruice și Benkovic (17) au susținut că configurațiile active eșantionate de complexul enzimatic nu au o energie mai mare decât populația generală de conformații și că popularea acestor conformații poate determina viteza de reacție. Spre deosebire de modelele uneori detaliate din lucrările citate, interpretarea de față pornește de la baze foarte generale, fără a invoca vreun mecanism sau model molecular microscopic particular, cum ar fi tunelizarea promovată de fluctuațiile enzimatice excitate termic (11, 13, 38, 39), calculele energiei libere de activare care includ eșantionarea corespunzătoare asupra conformațiilor (40) sau mecanismele specifice de tranziție între microstatele cu flexibilitate conformațională variabilă (41-44). Cu toate acestea, ea poate găzdui în mod clar interpretări mai specifice, cum ar fi o proteină care este rigidă la T scăzută sau o mișcare dinamică care necesită popularea unor stări vibraționale specifice de energie scăzută. Cu toate acestea, nimic din ceea ce am spus aici nu oferă un sprijin specific pentru astfel de modele, a căror valabilitate ar trebui examinată prin experimente suplimentare și simulări detaliate. Discuția de față nu invocă în mod specific efectele asociate cu descompunerea teoriei stărilor de tranziție. Efectele cuantice, cum ar fi tunelizarea, pot fi luate în considerare prin simpla lor includere în k(E) sau kR(E).

În contextul analizei noastre, rezultatele menționate mai sus pentru alcool dehidrogenazele alcoolice termofile ADH-hT (22, 32) pot fi interpretate în termeni de tendințe relative ale E̿ și Ē atunci când temperatura este modificată. O ipoteză larg avansată este aceea că enzimele termofile au evoluat pentru a funcționa în nișa lor fiziologică, adică la temperaturi ridicate, și sunt mai puțin active la temperatura camerei (chiar mai puțin active, în unele cazuri, decât se anticipează prin entalpia lor de activare la temperatura fiziologică). Analiza noastră poate oferi o legătură între această noțiune și calculele care se ocupă cu identificarea conformațiilor active și neactive (16, 17). De exemplu, Wrba și colab. (21) au raportat o observație empirică conform căreia, pentru enzimele cu temperaturi de topire diferite, diferența dintre temperaturile de curbură maximă în diagramele Arrhenius este similară cu diferența dintre temperaturile de topire. Acest lucru poate fi legat de deplasările dependențelor PR(E) și kR(E) față de E în intervalele care sunt importante la temperaturile de tranziție pentru denaturare și activitate. Ca un exemplu suplimentar, observăm că s-a sugerat recent că „poate nu este surprinzător faptul că, pentru reacțiile de scindare a legăturilor C-H, o împărțire a energiei termice în moduri proteice de frecvență joasă este un factor major. Aceste moduri pot deveni semnificativ excitate la temperatura ambiantă, spre deosebire de modul de întindere C-H, care este de așteptat să fie în mare măsură limitat la nivelul său de energie de punct zero” (22). Aceste tipuri de considerații pot fi legate de dependența de temperatură a E̿ și Ē și, prin urmare, de concavitatea sau convexitatea diagramelor Arrhenius.

Concluzia generală privind dependența de energie a coeficientului de viteză microcanonică se poate aplica, de asemenea, diagramelor Arrhenius convexe care sunt observate ocazional în alte studii. Dacă se vor aplica aceste argumente, trebuie să se aibă grijă să se asigure că diagrama Arrhenius convexă reprezintă o reacție elementară adevărată cu reactanți echilibrați intern. De exemplu, în prototipul problemei de stare staționară 10 unde 11 cu 12 se poate aplica la k1, k-1 sau k2, dar nu în general la k. Cu toate acestea, dacă k-1 și k1 sunt mult mai mari decât k2, atunci k devine un coeficient de viteză elementar pentru A → C, iar concluziile nu sunt schimbate de preechilibrul dinaintea etapei de determinare a vitezei. Acest lucru se aplică în continuare în cazul în care k2 este mult mai mare decât k1 și k-1, unde k devine k1. Un caz special în care se poate aplica abordarea în stare de echilibru este cel în care A corespunde reactantului și enzimei nelegate, starea B este complexul Michaelis, iar starea C este produsul (45). Rețineți că, în acest caz, k1 (în ecuația 12) ar trebui să fie o constantă de viteză de ordinul al doilea care conduce la ecuația Michaelis: 13 unde este concentrația reactantului (substrat), Vmax este viteza de reacție la o valoare mult mai mare decât KM, care este constanta Michaelis, (k2 + k-1)/k1, pentru Ecuația 10. Discuția nu se aplică coeficienților de viteză efectivi care rezultă dintr-o modificare a etapei care determină viteza sau a modificărilor concentrației efective a enzimei , și nici nu se aplică coeficienților de viteză cu histerezis atribuibilă formării de sticlă. Acest punct ar trebui subliniat pentru reacțiile enzimatice: ratele măsurate reprezintă de fapt o constantă de viteză semnificativă și consecventă pe întreaga gamă de temperaturi? De exemplu, într-un raport timpuriu al graficului Arrhenius convex pentru alcoolul dehidrogenază termofilă din Bacillus stearothermophilus (ADH-hT), toate măsurătorile au fost efectuate cu aceeași concentrație de substrat (care satura enzima la temperatura camerei), iar Vmax a fost prezentat (47). Un raport ulterior (22) a constatat că KM crește cu temperatura, astfel încât la temperaturi ridicate nu a fost suficient de mare decât KM, iar rata măsurată s-a dovedit a fi mai lentă decât Vmax, prezentând un grafic Arrhenius aparent convex. Chiar și pentru cea mai simplă cinetică enzimatică realistă, mecanismul 10 ar trebui să fie mărit cu o etapă de eliberare a produsului, iar datele ar trebui să fie analizate ținând seama în mod corespunzător de angajamentul pentru cataliză și de raportul de cataliză (48, 49); în caz contrar, kcat măsurat poate prezenta o dependență de temperatură diferită de k2 intrinsecă. Reperele 20-24 au fost selectate ca exemple în care s-a acordat o atenție deosebită pentru a se asigura și a se demonstra că graficul Arrhenius corespunde unei singure etape de reacție chimică elementară de limitare a vitezei în funcție de temperatură. Rubach și Plapp (comunicare personală a rezultatelor nepublicate), de exemplu, au utilizat tehnici de stare pre-staționară cu flux oprit pentru a măsura KIE-urile pe constantele de viteză microscopice pentru a studia reacția catalizată de alcool dehidrogenază din ficatul de cal. Aceștia au găsit diagrame Arrhenius convexe atât pentru transferul de hidrură, cât și pentru cel de deuteriu, dar nu au constatat o dependență a KIE-urilor de temperatură și au demonstrat că nicio modificare a etapei care determină viteza nu ar putea afecta rezultatele lor. De asemenea, am exclus cazurile pentru care intervalul de temperatură permite o proteină topită ireversibil sau parțial topită. Spre deosebire de exemplele enzimatice care prezintă un comportament Arrhenius convex care implică o singură etapă elementară, menționăm cazul permeabilității cutanate a medicamentelor, în care a fost observat un comportament Arrhenius convex, dar în care etapele elementare nu au fost sau nu pot fi sortate (50, 51). Pentru comparație cu permeabilitatea prin piele, menționăm, de asemenea, că cazul oarecum mai bine definit al dependenței non-Arrhenius de temperatură a difuziei în solidele amorfe a fost modelat printr-un model de site-hopping în mai multe etape (52, 53).

Un exemplu din chimia organică oferă o ilustrare utilă a acestor concepte în combinație cu o reorganizare structurală dependentă de temperatură. Limbach a observat diagrame Arrhenius convexe (comunicare personală a rezultatelor nepublicate) pentru transferul intramolecular de protoni catalizat de baze în 1,3-bis-(4-fluorofenil)-triazenul dizolvat în eter etilic de metil. Coeficientul de viteză reprezintă o medie pe diferite forme cu legături de hidrogen ale reactantului, în special molecula liberă și complexul cu baza. Transferul de protoni are loc în complex. Curbura Arrhenius convexă rezultă din faptul că molecula se transformă la temperaturi ridicate în forma necomplexată, unde bariera pentru transferul de protoni este mai mare (ref. 55 și H. H. Limbach, comunicare personală). Astfel, interpretarea Tolman nu se aplică în mod strict, deoarece coeficientul de viteză nu reprezintă un singur pas elementar. Graficul Arrhenius al reacției din oricare dintre forme separat ar fi, probabil, cvasiiliniar sau concav. Cu toate acestea, dacă diferitele forme cu legături de hidrogen sunt considerate ca fiind conformeri ai unui singur reactant, se poate aplica interpretarea Tolman, iar aceasta oferă o ilustrare a unei molecule care reacționează mai lent la o energie mai mare, deoarece explorează o regiune mai largă a spațiului de fază care include conformeri esențialmente nereactivi. În mod similar, Massey et al. (23) sugerează o posibilă explicație a graficului lor Arrhenius convex care implică două forme enzimatice concurente, fiecare dominând într-un interval de temperatură diferit. Acest model este un exemplu particular de model care ar putea fi în concordanță cu rezultatul independent de model prezentat aici. Pentru reacțiile non-biologice ne așteptăm ca configurațiile deosebit de reactive să fie adesea specii cu energie ridicată. Este posibil ca diagramele Arrhenius convexe să fie mai frecvente în sistemele biologice, deoarece o enzimă poate să fi evoluat în mod specific astfel încât stările cu cea mai joasă energie (adică cele mai accesibile la T ambiantă) să fie cele reactive, conducând astfel la un E̿ scăzut chiar și pe măsură ce T crește.

Dramele Arrhenius convexe au fost, de asemenea, observate pentru difuzia în lichide și sticle supraîncălzite. Astfel de cazuri, ca și problema de permeabilitate cutanată menționată mai sus, pot fi complicate de mai multe căi paralele, dar, cu toate acestea, au cedat la analize detaliate. O explicație citată pe scară largă este aceea că moleculele din lichidele la temperaturi scăzute difuzează prin traversarea unor bariere de potențial apreciabile, în timp ce la temperaturi ridicate, mișcările de difuzie sunt aproape libere (24, 56). Acest model recunoaște că, odată cu creșterea temperaturii, energiile termice vor deveni mai mari în comparație cu înălțimile barierelor; ceea ce este necesar pentru un grafic Arrhenius convex este ca energia medie a moleculelor care fac tranziții (în acest caz, salturi difuzive de la un minim local la altul) să crească mai încet decât energia medie a tuturor moleculelor. Există multe teorii detaliate ale comportamentului non-Arrhenius în fluidele și sticlele metastabile care nu abordează în mod explicit dependența de temperatură a energiei de activare în termenii interpretării lui Tolman (58), dar orice explicație coerentă a unei diagrame Arrhenius convexe în termeni de coeficienți de viteză elementară de echilibru local trebuie să fie în concordanță cu rezultatul lui Tolman la un anumit nivel subiacent, chiar dacă acest lucru nu este explicit sau nici măcar recunoscut.

În rezumat, prezentul articol a evidențiat informația microcanonică fundamentală care este furnizată de o observație a convexității graficului Arrhenius, dar care aparent nu a fost interpretată anterior. Analiza are o aplicabilitate pe scară largă și face o predicție certă, independentă de model, cu privire la energiile medii ale sistemelor care fac tranziții. Rezultatul este relevant pentru toate domeniile cineticii (în enzime, în chimia atmosferică, în reacțiile de cluster etc.) în care pot fi observate diagrame Arrhenius convexe și, prin urmare, am păstrat prezentarea cât mai generală posibil, citând în același timp experimente recente cu catalizatori termostabili și mezoostabili de dehidrogenază și oxidază ca exemple specifice care prezintă fenomenul. Am făcut, de asemenea, o legătură cu teoria difuziei. Sperăm că punctul de vedere îmbrățișat în această lucrare va stimula noi moduri de gândire cu privire la vitezele de reacție, cataliză și difuzie.

• Primit pentru publicare la 12 septembrie 2000.

.