Cellodling
Humana embryonala njurar 293FT (HEK293) odlades i DMEM som kompletterades med 10 % FBS och 1 % penicillin/streptomycin (100 iU per ml; 100 μg per ml). Cellinjerna var inte autentiserade. Cellerna var fria från mykoplasma. Cellerna inkuberades i en fuktig atmosfär med 5 % CO2 vid 37 °C. För stabila cellinjer selekterades transfekterade celler i närvaro av puromycin (3 μg per ml). För transienta transfektionsstudier såddes HEK293-celler i 6-hålsplattor i närvaro av vektorerna med hjälp av Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Podocytcellinjer etablerades från mänsklig urin42 och APOL1-genotypning utfördes efter att informerat samtycke erhållits enligt forskningsprotokoll (94-DK-0127, 94-DK-0133) som i förväg godkänts av NIDDK Institutional Review Board. Fall A är G0/G0 man med FSGS, fall B är G0/G0 man med hiv-associerad FSGS, fall C är G0/G0 man med FSGS (HP55-345O-1), fall D är G1/G2 man med FSGS och fall E är G1/G2 man med hiv-associerad FSGS. Cellerna odlades i RPMI1640 kompletterat med 10 % FBS, ITS och 1 % penicillin/streptomycin (100 iU per ml; 100 μg per ml). Cellerna inkuberades i en fuktig atmosfär med 5 % CO2 vid 33 °C och differentierades vid 37 °C i 7-10 dagar. Cellinjerna var inte autentiserade. Cellerna var fria från mykoplasma. Innan celllysaten samlades in behandlades cellerna med 103 U per ml IFNα (Abcam) i 24-72 timmar och 100 mM calyculin A (LC Laboratories) i 30 minuter. För PKR-hämmande experiment behandlades cellerna med 1 μM imidazolo-oxindol PKR-hämmare C16 (Sigma Aldrich) i 1 h43.
Mänsklig vävnad
Deidentifierad mänsklig njurbiopsivävnad erhölls från Dr Preeti Chandra, University of Maryland. Forskningen godkändes i förväg av Institutional Review Boards vid University of Maryland och NIDDK, NIH.
Plasmidinformation
APOL1 G0-uttrycksvektorn består av CMV-promotor som härrör från humant APOL1 cDNA (NM_001136540: 298-1453). För APOL1 G1 (rs73885319 A→G och/eller rs60910145 T→G) och G2 (rs71785313 del) utfördes platsriktad mutagenes för att göra den. För APOL1-uttrycksvektorn som saknar proteinuttryck framställdes genom att infoga en stoppkodon och en ramförskjutningssekvens (TAATAGATGA) efter det 138:e kodonet. För vektorn för sekundärstrukturmutation ändras de ursprungliga sekvenserna genom åtta synonyma förändringar (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G och 1242T→C). För den stabila dsRNA-vektorn G0 ändras de ursprungliga sekvenserna genom fem mutationer i 3′ UTR (CCA CAGAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGT GGC AGG GGC GGC CAG GAG GC→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). För flankerande RNA runt APOL1-allelerna (NM_001136540.1, 1031-1453) användes pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) som bakgrundsvektor. Scheman för vektorkartor finns i kompletterande figur 1.
Immunoblotting
Cellerna lyserades i en RIPA-buffert som innehåller en cocktail av proteashämmare/fosfatashämmare. Lysaten separerades genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores och proteinerna utsattes för Western Blotting och blockerades i 30 minuter i Odyssey blockeringsbuffert (LI-COR). Blots inkuberades med primära antikroppar mot APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836) och GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) och p62 (Cell signaling #5114). Blots inkuberades med färgämnesmärkt antikropp av antiribbit (LI-COR). Alla blottor avbildades med hjälp av Odyssey infraröd skanner (LI-COR). Rågelbilder visas i kompletterande figur 13.
Reverse transkriptas-PCR och kvantitativ realtids-PCR
Celler eller total njure skördades i TRIzol-reagens och totalt RNA isolerades. Totalt RNA behandlades med DNas före syntesen av cDNA med oligo (dT). En alikvot på 5 μg RNA användes för cDNA-syntes med Superscript II omvänt transkriptas. Proverna analyserades genom PCR (RT) eller kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) med hjälp av Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Det relativa uttrycket i varje prov beräknades som en kvot (attamolespecifik gen per β-actin). Primerpar finns listade i kompletterande tabell 1.
Proteinsyntesanalys
Transfekterade HEK293-celler eller humana podocytcellinjer odlades i 96-brunnsplattor och behandlades med 103 U per ml IFNα (Abcam) för kvantifiering eller kammarglas för visualisering. Syntesanalysen (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, katalognr. C10289, Invitrogen) utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Kärnornas motfärgning utfördes med Hoechst. HEK293-celler utan vektor som behandlats med 1 μM puromycin (InvivoGen, San Diego, CA) användes som en negativ kontroll för denna analys, där bakgrunden sattes till 0 % signalintensitet. HEK293-celler med APOL1 G0-vektorceller sattes till 100 % signalintensitet.
Celllevnad
Celllevnadsanalyser utfördes med hjälp av ATP-analyser. För att kvantifiera ATP som genereras av metaboliskt aktiva celler använde vi en CellTiter-Glo luminescent cellviabilitetsanalys (Promega) enligt tillverkarens anvisningar. Cellerna odlades i sterila 96-hålsplattor i närvaro av 103 U per ml IFNα (Abcam) i 72 timmar, och sedan tillsattes 100 μl CellTiter-Glo-reagens för att lysera cellerna. Efter 10 minuters inkubation i rumstemperatur detekterades luminescensen med hjälp av en luminometer med en integrationstid på 1 s per brunn. Luminescenssignalerna för cellerna normaliserades med cellantalet.
Cellproliferationshastighetsanalys
Cellerna såddes med 5,0 × 103 celler per 150 µl odlingsmedium i varje brunn i 96-brunnsplattan och PKR-hämmaren C16 tillsattes i angiven koncentration. Efter 0, 24, 48, 50 µL mättes cellantalet med Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Syreförbrukningshastigheter i odlade humana podocyter
Den extracellulära flödesanalysatorn XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) användes för att utvärdera cellulära syreförbrukningshastigheter (OCR) enligt företagets anvisningar. Kortfattat så såddes odlade humana podocyter i XF24-brunnsplattor som köpts från Seahorse Bioscience, med en densitet på 2,0 × 104 celler per brunn (yta 0,33 cm2) i 100 μL odlingsmedium och inkuberades över natten vid 37 °C. Följande dag behandlades cellerna med IFNα (1 × 103 U per ml) med/utan PKR-hämmare C16 (100 nM) i 72 timmar, följt av 24 timmars behandling på XF24-brunnsplattorna. Före OCR-mätningar tvättades den experimentella XF24-plattan med cellerna med bikarbonatfritt DMEM-analysmedium (Seahorse Bioscience) innehållande 25 mM glukos och 1 mM natriumpyruvat, och cellerna förinkuberades i 1 timme vid 37 °C utan koldioxidtillförsel i 625 μL analysmedium. Före OCR-mätningarna kalibrerades XF24 med hjälp av en kalibreringspatron enligt företagets anvisningar. Efter kalibreringen utfördes baslinjemätningar av OCR i testplattan i 4 min.
RNA-immunoprecipitation (RNA-IP)
Stabila HEK293-celler med APOL1-G0-, G1- eller G2-varianten mockbehandlades med följande: (a) 103 U per ml IFNα i 24-72 timmar och 100 μM palmitinsyra (Sigma) i 2 timmar, eller b) 100 mM 103 U per ml IFNα i 24-72 timmar och calyculin A i 30 minuter. Palmitinsyra binder PKR direkt och hämmar dsRNA-bindningen till PKR44 och därför användes palmitinsyra som negativ kontroll. Cellerna bestrålades med UV-ljus vid 200 mJ per cm2. Tio procent av varje celllysat sparades för att tjäna som inmatningsprov för RT-qPCR. Immunutfällning utfördes med hjälp av immunutfällningskit för RNA-bindande protein (EMD Millipore) baserat på den tidigare rapporten med PKR45. Phospho-PKR-antikropp (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) eller kontrollkanin-IgG användes för RNA-IP. RNA extraherades med TRIzol, följt av DNasbehandling och etanolfällning. cDNA genererades med hjälp av random hexamer primers och SuperScript Reverse transcriptase II. Proverna analyserades genom PCR (RT) eller qRT-PCR med hjälp av Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Anrikningen beräknades som en kvot (IP-prov per inmatningsprov). Primerpar finns förtecknade i kompletterande tabell 1. Ingen SYBR-signal detekterades i de negativa kontrollerna, mockbehandlade celler med fosfo-PKR-antikropps-IP och interferon-α + calyculin A-behandlade celler med kontrollkanin-IgG-IP
PKR-proteinexpression och -rening
Rekombinant PKR renades som tidigare rapporterats46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) transformerades till BL21(DE3) Rosetta-celler (Novagen). Cellerna odlades i LB-medium vid 37 °C tills A600 nm ~ 0,7 och proteinuttrycket inducerades med 1 mM IPTG i 3 timmar vid ~20 °C. För PKR-rening resuspenderades cellerna i buffert A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanol, 10 % glycerol) kompletterad med proteashämmare (Sigma). Cellerna lyserades genom inkubation med 5 mg per ml lysozym i 30 minuter följt av sonikation i 3 minuter. Lysatet centrifugerades i 20 minuter vid 20 000 g. Supernatanten applicerades på en heparin-sefaros-kolonn (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) som jämnats ut i buffert A och PKR eluerades med hjälp av en NaCl-gradient. Toppfraktionerna späddes två gånger med buffert A och applicerades på en poly(I:C)-agaroskolonn (Amersham) som balanserades i buffert A. PKR eluerades vid 1,1 M NaCl, koncentrerades till ~10 mg per ml och förvarades vid -80 °C.
PKR-aktiveringsassay
PKR-aktiveringsassays utfördes som tidigare rapporterats47. PKR avfosforylerades med λ-proteinfosfatas under 1 timme vid 30 °C och inhiberades sedan med 2 mM natriumorthovanadat. PKR (4 μM) inkuberades med långt RNA (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng per ml)/kort RNA (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng per ml)/poly (I:C) 20 μg per ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT och 100 μM ATP (Ambion). Reaktionsblandningarna inkuberades vid 30 °C under de angivna tiderna och släcktes med 1× SDS laddningsbuffert. Fosforylerade PKR:er detekterades med phospho-PKR-antikropp (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
RNA-beredning för gelmigrationsexperiment och SHAPE
Truncated APOL1 RNA:er med olika 3′-strukturkassetter bereddes genom in vitro-transkription med hjälp av MegaShortScript-kitet (ThermoFisher) enligt tillverkarens rekommendationer. Transkriptionsmallar genererades i två semi-nested PCR-reaktioner från plasmider som innehöll APOL1-alleler (G0, G1, G2) eller muterade varianter av dessa (mG0, mG1, mG2). För den första reaktionen användes framåt- och bakåtriktade primers för att lägga till en 5′ T7-promotor respektive en 45 nt 3′ SC till de trunkerade APOL1-sekvenserna (kompletterande tabell 1). Det sistnämnda elementet införs för att tillhandahålla en hybridiseringsplats för omvänd transkription för SHAPE. En fraktion av varje reaktion amplifierades på nytt med hjälp av den ursprungliga framåtriktade primern och en kortare omvänd primer för att göra de slutliga transkriberingsmallarna mer homogena. Transkriptionsreaktionerna behandlades med Turbo DNase I i 5 minuter vid 37 °C, inkuberades vid 85 °C i 2 minuter och fraktionerades över en denatureringsgel (5 % polyakrylamid-19:1, 1× TBE, 7 M urea) vid konstant temperatur (45 °C, 30 W max). De önskade RNA-produkterna detekterades genom UV-skuggning, klipptes ut från gelen, elektrolyterades vid 200 V i 2 timmar vid 4 °C, utfälldes med etanol och förvarades vid -20 °C i 10 mM Tris, pH 7,0 före användning. RNA-stocklösningar kvantifierades genom spektrofotometri.
Gelmigrationsanalys
Varje trunkerat APOL1-RNA späddes till 1 μM i 20 μL RNA-renatureringsbuffert (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5 % glycerol (w per v)), denaturerades genom uppvärmning till 85 °C i 2 minuter och renaturerades genom långsam nedkylning (0,1 °C per s) till 25 °C. MgCl2 tillsattes sedan till en slutkoncentration på 0, 1 eller 3 mM och blandningarna inkuberades ytterligare 30 minuter vid 37 °C för att främja bildandet av Mg-beroende och/eller andra tertiära RNA-interaktioner. RNA-konformerna stabiliserades genom snabbkylning till 4 °C, varefter de fraktionerades över en 5 % icke-denaturerande polyakrylamidgel (5 % akrylamid, 19:1) i 16-18 timmar vid 4 °C. Både gel- och körbuffert innehöll 1× TBE och 1 mM MgCl2, och gelerna kördes i förväg i ~1 timme före laddning. Gelen exponerades för SybrGreen-färgämnet (ThermoFisher) i enlighet med tillverkarens anvisningar och RNA-konformers migrationspositioner detekterades med hjälp av en Typhoon Trio+ bildbildare med variabelt läge (GE Healthcare).
SHAPE och generering av sekundära strukturella RNA-modeller
SHAPE-experimentella metoder har beskrivits tidigare48,49. Kortfattat viktades det trunkerade APOL1-RNA:t med SC RNA:t som i gelmigrationsanalysen förutom att blandningsvolymen var 150 μL, den slutliga MgCl2-koncentrationen var 1 mM och glycerol var utesluten. RNA-lösningarna delades upp i kontroll- (1M7-) och experimentella (1M7+) alikvotar (72 μL vardera), och 8 μL DMSO eller 8 μL 30 mM 1M7 i DMSO tillsattes respektive. Modifieringsreaktionerna inkuberades vid 37 °C i 5 minuter, kyldes ned till 4 °C, etanol fälldes ut och åter suspenderades i 10 μL nukleasfritt vatten. Behandlat RNA transkriberades omvänt från olika märkta primers som är komplementära till 3′-strukturkassetten (1M7-primer, Cy5,5; 1M7+-primer, Cy5) och hydrolyserades genom alkalibehandling. De resulterande cDNA-biblioteken precipiterades med etanol och upplöstes på nytt i Sample Loading Solution (Genome Lab), varefter de sammanfördes med ddA- och ddG-sekvenseringsstigare märkta med WellRED D2 (Beckman Coulter) respektive IRDye 800RS (LI-COR). De kombinerade proverna fraktionerades genom kapillärelektrofores (CE) med hjälp av en Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer. För varje RNA genererades reaktivitetsprofiler från CE-elektroherogrammen med hjälp av programvaran SHAPEfinder50 och matades sedan in i programvaran RNAstructure version 5.751,52 tillsammans med RNA-sekvenserna för att generera sekundära strukturmodeller. Standardparametrar för lutning (1,8 kcal per mol) och intercept (-0,6 kcal per mol) användes för att omvandla reaktivitetsvärden till pseudoenergibegränsningar som modulerar RNA-falsningsalgoritmen. RNAstructure genererar automatiskt flera strukturella modeller som bäst matchar de SHAPE-avledda reaktivitetsprofilerna och rangordnar dem efter fri Gibbs-energi. De strukturella modeller med lägst energi som produceras på detta sätt illustreras i fig. 3a, b och kompletterande fig. 4.
In vitro knock down
Vi utförde knock down-experiment med hjälp av villkorligt odödliga humana cellinjer från mänsklig urin42. Vi transfekterade dessa celler med antingen Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) eller med förkonstruerat stealth siRNA mot APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) med hjälp av Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo samtransfekterades och användes som transfektionskontroll. Knock down-effektiviteten var 52,4-75,4 % (RNA-nivåer) eller 31,1 % (proteinnivåer).
Möss
Vi använde transgena möss med humant APOL1-genlocus (BAC-APOL1-möss), som genererades med hjälp av en artificiell bakteriell kromosom som innehåller locus för APLOL-G0, eller APOL1-G1, eller APOL1-G2. Ett mänskligt DNA på ~47 kb, som endast omfattar APOL1-genen med 5′ och 3′ flankerande regioner (inklusive exon 1 och 2 av APOL2 och 3′-regionen inklusive exon 39-41 av en del av MYH9-genen), isolerades och subklonades från en mänsklig BAC-klon (ENST00000000397278, som motsvarar NM_003661). Enskilda G0-, G1- och G2-BAC-subkloner injicerades i 129SvJ/B6N F1-embryon och grundarna återkorsades därefter till 129SvJ. Subklonen sekvenserades för att säkerställa att den var som referensgenomsekvens från NCBI och Ensembl. De enda skillnaderna var polymorfismer i de introniska regionerna. I försöken med betingade transgena möss använde vi podocytspecifika transgena möss med trunkerat RNA av APOL1 med FVB-bakgrund. Vi producerade dessa möss med hjälp av ett villkorligt transgent system med hjälp av nephrin (NPHS1)-promotorstyrd trunkerad RNA-sekvens (NM_001136540, 1031-1453). Vi genererade två stammar: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA med rs73885319 A och rs60910145 G och NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA med rs73885319 G och rs60910145 G.
Isolering av glomeruli
BAC/APOL1-möss (mellan 8 och 12 veckor gamla) administrerades dagligen med IFNγ (106 U per kg kroppsvikt IP) i 3 dagar före vävnadsprovtagning. Protokollet för glomerulär isolering har rapporterats i detalj53. I korthet sövdes mössen genom en intraperitoneal injektion av Avertin (2,2,2-tribromoetyl- och tertiär amylalkohol; 17 μL per g) och perfunderades med 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylaktiverad: Dynal #140.04) utspädda i 20 ml fosfatbuffrad saltlösning genom hjärtat. Njurarna smältes med kollagenas A och DNas I vid 37 °C i 10 minuter. Den kollagenasupplösta vävnaden pressades försiktigt genom en 100-μm cellfilter och tvättades med HBSS. Proverna tvättades och resuspenderades med hjälp av ett magnetiskt stativ. Glomeruli samlades upp och inkuberades i RPMI1640 kompletterat med 10 % FBS, ITS, 1 % penicillin/streptomycin (100 iU per ml; 100 μg per ml) och 100 mM calyculin A (LC Laboratories) i 30 minuter och användes för Western blot-analys.
Immunohistokemi (musprover)
BAC/APOL1-möss (mellan 8 och 12 veckor gamla) fick IFNγ (106 U per kg kroppsvikt IP) dagligen i 3 dagar. Mössen perfunderades med 100 mM calyculin A som innehöll PBS före vävnadsprovtagning. Därefter skars njurarna i små bitar och inkuberades i RPMI1640 kompletterat med 10 % FBS, ITS och 100 mM calyculin A i 30 minuter. Därefter fixerades vävnaderna omedelbart med 10 % buffrat formalin. BAC/APOL1-möss (mellan 8 och 12 veckor gamla) gavs IFNγ (106 U per kg kroppsvikt IP) dagligen i tre dagar. NPHS1-APOL1-ΔRNA-möss gavs IFNγ (106 U per kg kroppsvikt IP) dagligen i 3 dagar före vävnadsprovtagning. Vi använde paraffinfixerade 4-5 μm vävnadssektioner. Sektionerna deparaffiniserades/rehydrerades, antigenhämtning utfördes genom uppvärmning i citratbuffratbuffratmedium i 5 minuter i mikrovågsugn. Vävnaderna blockerades med 1 % BSA och 0,1 % saponin. Sektionerna inkuberades med primära antikroppar, bl.a. följande: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) och podocalyxin (R&D Systems AF1556). För immunofluorescens använde vi sekundära Alexa Fluor-antikroppar (ThermoFisher) och visualiserade med hjälp av konfokal mikroskopi. För ABC-färgning användes biotinkonjugerade sekundära antikroppar och Avidin-HRP (Vector). Ett DAB-kit (Vector) användes för visualisering. I musförsök behandlades möss (mellan 8 och 12 veckor gamla) med IFNγ (106 U per kg kroppsvikt IP), som injicerades 3 dagar före vävnadsprovtagning. För signalkvantifiering upptäcktes phospho-PKR-signalen från podocyter genom motfärgning för WT1 i musförsök.
Immunohistokemi (humana prover)
Denna studie godkändes i förväg av IRB i University of Maryland och av NIDDK, NIH. Grundläggande egenskaper hos fallen anges i kompletterande figur 5b. Färgning utfördes med hjälp av 5 μm tjocka formalinfixerade, paraffinininbäddade vävnadssektioner. Efter deparaffinering utfördes värmeinducerad antigenhämtning i 20 minuter i en buffert med pH 6,0 med hjälp av en tryckkokare (Pascal, Agilent Technologies Dako). Sektionerna inkuberades med primära antikroppar inklusive följande: phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) och WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Vi använde Alexa Fluor sekundära antikroppar (ThermoFisher) och visualiserade med hjälp av konfokalmikroskopi.
Immunohistokemi och avbildning av levande celler
Cellerna inkuberades med 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) och 200 nM TMRE (Invitrogen) i 20 minuter före signaldetektering, efter 20 μM FCCP-behandling och visualiserades med hjälp av konfokalmikroskopi.
Signalkvantifiering av mikroskopiska bilder
För mänsklig vävnad räknade vi glomeruli utan global skleros (6 fall utan riskgenotyp: 5, 6, 7, 10, 5 och 9 glomeruli för varje fall, respektive; 6 fall med riskgenotyp: 13, 6, 4, 5, 10 respektive 5 glomeruli). För vävnader från mus och människa justerades lasereffekten så att den maximala signalen inte mättades. Bildbehandling och kolokaliseringsanalyser utfördes med hjälp av Zen-programvaran (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland)54. Viktad kolokaliseringskoefficient och genomsnittlig intensitet i WT-1-positiva celler beräknades enligt tidigare rapport54. För medelintensiteten standardiserade vi podocytens signalintensitet med hjälp av signaler från WT1-negativa intra-glomerulära celler för varje glomerulus. Värdena var relativa poäng med signalintensiteten för APOL1-G0 som 100 %. Kvantifieringarna utfördes på ett blindat sätt.
In situ-hybridisering
Kromogen in situ-detektion utfördes på vävnadssektioner från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) block från musen med hjälp av RNAscope in situ-hybridisering (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Kortfattat avparaffiniserades 5 μm FFPE-vävnadssektioner, kokades med förbehandlingsreagens i 15 minuter och proteasedigerades sedan vid 40 °C i 30 minuter, följt av hybridisering i 2 timmar vid 40 °C med probe-Hs-APOL1-01 (katalog nr 439871, Advanced Cell Diagnostics). Dessutom användes Probe-Mm-PPIB (katalog nr 313911) och Probe-DapB (katalog nr 310043) som positiv respektive negativ kontroll. Detektion av specifika sondbindningsställen visualiserades med RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalog # 310035).
Mus proteinuriamodell
Alla experiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (vägledning för skötsel och användning av försöksdjur) och godkändes på förhand av NIDDK:s djurskydds- och djuranvändningskommitté (Animal study proposal (K097-KDB-14)). Vi använde både han- och honmöss i åldern 8-15 veckor. Möss i varje försök matchades med avseende på kön, ålder och kroppsvikt. Randomiseringar utfördes med avseende på kroppsvikt. Provstorlekarna för experimenten bestämdes utan formella effektberäkningar. Uteslutningskriterier var viktförlust mer än 20 % under försöksperioden. För induktion av proteinuri injicerades möss (mellan 8 och 12 veckor gamla) med bFGF och puromycinaminonukleosid enligt tidigare beskrivning30. För NPHS1-APOL1-deltaRNA-musstammen injicerades puromycinaminonukleosid (Sigma-Aldrich) subkutant på dag 0 (200 mg per kg kroppsvikt) och bFGF (Kaken Pharmaceutical) injicerades intravenöst på dag 0 respektive 2 (5 μg per djur). För PKR-hämmarexperiment användes PKR-hämmare C16 (10 μg per kg IP) dagligen från dag 0 till dag 1055. För BAC-APOL1-musstammen injicerades interferon γ (Prospec) på dag -1 och dag 1 (106 U per kg kroppsvikt), puromycinaminonukleosid injicerades subkutant på dag 0 (300 mg per kg kroppsvikt) och bFGF (Kaken Pharmaceutical) injicerades intravenöst på dag 0 respektive 2 (5 μg per djur). För PKR-hämmarexperiment användes PKR-hämmare C16 (10 μg per kg IP) dagligen från dag 0 till dag 1055.
Urinärt albumin- och kreatininmätning
Vi bestämde urinalbuminnivåerna med ELISA med hjälp av ett ELISA-kit för murin mikroalbuminuri (Exocell). Vi mätte urinkreatininkoncentrationen med kreatininkit (Exocell). Alla mätningar utfördes i två exemplar. Vi bestämde albuminuri som kvoten mellan urinalbumin och kreatinin. Alla förfaranden utfördes i enlighet med tillverkarnas protokoll. Undersökarna var inte blinda för grupptilldelningen men var blinda när de bedömde resultatet.
Statistisk analys
Data från minst tre enskilda experiment analyserades och presenterades som punktdiagram och medelvärde. Metoder för statistisk analys skrevs in i varje figurens legend. Vi justerade inte för multipla jämförelser. Värden på P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.