2 Livshistoria
FBF-cerkarier är mycket små, svåra att identifiera morfologiskt och har vanligtvis en extremt låg prevalens av infektion bland ryggradslösa mellanvärdspopulationer (Cribb et al., 2011). Kanske som ett resultat av dessa egenskaper är mellanvärdena okända för alla utom några få FBF-arter: flera arter av sötvattenssläktet Sanguinicola (se Bullard och Overstreet, 2008) och de marina arterna Aporocotyle simplex (se Køie, 1982; Køie och Petersen, 1988, experimentella infektioner; inga molekylära markörer tillämpade), Paracardicoloides yamagutii (se Nolan och Cribb, 2004a; se efterföljande text), C. forsteri (se Cribb et al, 2011; se efterföljande text) och Cardicola opisthorchis (se Sugihara et al., 2014; se efterföljande text). ITS2 rDNA-sekvenser har använts för att matcha morfologiskt obestämda larver av FBF, dvs. cerkarier, sporocystor och rediae, som samlats in från ryggradslösa värddjur med morfologiskt distinkta vuxna exemplar från sympatiska fiskvärdar. Molekylära markörer är snabba och billiga och gör det möjligt att snabbt upptäcka infektioner, identifiera det smittbärande agenset genom fylogenetisk slutsats eller genom sekvenshomologi med en redan sekvenserad taxon och identifiera mellanvärdar, vilket gör det möjligt att koppla samman livsstadier av potentiellt patogena FBF:er. Att fastställa identiteten hos mellan- och slutvärdar är ett viktigt första steg för att förstå FBF:s livscykel. Utöver de diagnostiska metoderna återstår dock mycket att lära om specifika detaljer i värd-parasit-förhållandet mellan FBF:er och deras mellanvärdar i form av polychaeter, snäckor och musslor. När allt kommer omkring kan deras evolutionära historia mycket väl påverkas lika mycket, eller mer, av dessa mellanvärdar som av deras slutvärdar. Vi hävdar därför att molekylära studier inte helt och hållet bör ersätta klassiska experimentella studier som gör direkta mikroskopiska observationer av larver och vuxna FBF i värdvävnader efter exponering av naiva ryggradslösa djur och slutgiltiga fiskvärdar (Køie, 1982).
En stor del av informationen om FBF:s livscykler härstammar från hälsoprogrammen för vattenlevande djur som är knutna till det kommersiella vattenbruket: 17 av 109 (16 %) av de tillgängliga FBF-sekvenserna i GenBank kommer från infektioner i marint vattenbruk (tabell 1.1). FBF utgör en av de få trematodgrupper vars medlemmar kan skada den slutgiltiga fiskvärden som vuxna individer som täpper till blodkärl och orsakar asfyxi, som ägg som skadar eller blockerar gälepitel och grenkärl och som miracidier som kläcks från ägg som är inbäddade i gälepitelet och borrar sig ut ur fisken (Bullard och Overstreet, 2002, 2008). Deras livscykler är därför ett problem för kommersiella vattenbruksverksamheter eftersom FBF:er kan döda eller försvaga fiskar och orsaka ekonomiska förluster i sötvattensdammar, tävlingsbanor och havsburar till havs. Sekvenser från icke-vuxna FBF:er som infekterar snäckor, musslor och polychaeter, som hyser FBF:s asexuella reproduktionsstadier – sporocystor, rediae och cerkarier – är mycket färre (4 av 109) (tabell 1.1) än sekvenser från vuxna exemplar som infekterar fiskvärdar.
I den första publicerade studien av FBF:s livscykel som bestämdes genom tillämpning av en molekylär metod dokumenterade Nolan och Cribb (2004a) två cerkariemorfotyper (”typ A” och ”typ B”) som infekterade 80 av 11 314 (0,7 %) exemplar av den hydrobiida snäckan Posticobia brazieri i tidvattenbäckar i Queensland, Australien. ITS2 rDNA-sekvenser från cerkarier av typ A anpassades (100 % överensstämmelse) till vuxna exemplar av P. yamagutii som samlades in från blodet (dorsala aorta, förmak, ventrikel, gälar, njurar och blodkärl i tarmen och simblåsan) hos fläckig långfenad ål Anguilla reinhardtii. I en annan studie, som svarade på oro för sjukdomar i samband med infektioner av C. forsteri som infekterar odlad sydlig blåfenad tonfisk T. maccoyii utanför södra Australien, undersökte Cribb et al. (2011) 9351 individer från 11 familjer av musslor, 2 familjer av snäckor och 24 familjer av polychaeter för FBF-infektioner. ITS2 rDNA-sekvensdata från cerkarier som infekterade Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) överensstämde till 100 % med vuxna exemplar av C. forsteri från hjärtat av närliggande sydlig blåfenad tonfisk i ett nätfäste vid Port Lincoln, Australien. De sekvenserade också 28S rDNA-fragmentet (721 bp i D1-D2-regionen) från cerkarier av C. forsteri som infekterade L. modestus. I likhet med Cribb et al. (2011) fokuserade Sugihara et al. (2014) på polychaeter när de undersökte 744 ryggradslösa djur med avseende på FBF-infektioner i en odlingsplats för blåfenad tonfisk i Stilla havet, Thunnus orientalis, utanför södra Japan. Sporocystor och cerkarier av FBF hittades i fem individer av en terebellid polychaete (Terebella) som samlades in från insidan av skalet på döda havstulpaner som tagits från substratet och från rep och flytetyg under havsburen. ITS2- och 28S-sekvenser från sporocystor var identiska (100 %) med sekvenser från vuxna C. opisthorchis från hjärtat av odlad blåfenad tonfisk från Stilla havet.
Shirakashi et al. (2012) studerade samtidiga infektioner av Cardicola orientalis och C. opisthorchis i blåfenad tonfisk från Stilla havet. De använde ITS2 rDNA-sekvensdata för att skilja de halvmåneformade äggen av C. opisthorchis i den afferenta filamentartären från ovoida ägg av C. orientalis som infekterar gällamellerna. De konstaterade att artspecifika PCR-primers som tillämpas på prover av gälvävnad skulle kunna komplettera histopatologi och hjälpa till att diagnostisera infektioner innan äggen och de vuxna djuren är tillräckligt många för att lätt kunna observeras med ljusmikroskopi. Yong et al. (2013) använde fullständiga ITS2 rDNA-sekvensdata för att identifiera FBF-ägg som satt i gälarna hos fem arter av fjärilsfiskar (Perciformes: Chaetodontidae) från Stora barriärrevet som en enda art Cardicola chaetodontis (en enda baspars skillnad i två prover). FBF-ägg observeras inte sällan i gälepitelet och grenartärerna hos fiskar under rutinmässiga fisknekopsier (SAB, personliga observationer), men i många fall återfinns inte motsvarande vuxna exemplar som infekterar blodet hos den enskilda fisken. Molekylära tekniker som effektivt extraherar och amplifierar DNA från FBF-ägg, som är mycket små, till exempel är äggen av C. chaetodontis 40-60 μm långa, lovar att avslöja förekomsten av icke namngivna FBF-arter och hittills odokumenterade värdar om de resulterande sekvenserna placeras i ett fylogenetiskt sammanhang med sekvenser från namngivna arter. Samma sak kan sägas om sekvenser som härrör från cerkarier (se efterföljande text). Med hjälp av kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) identifierade Norte Do Santos et al. (2012) ägg av C. forsteri som samlats i gälarna hos ranchad sydlig blåfenad tonfisk. På samma sätt tillämpade Kirchhoff et al. (2012) denna metod för att diagnostisera ägg av C. forsteri som infekterar T. maccoyii. Polinski et al. (2013) tog tillvägagångssättet ett steg längre genom att utveckla en känslig och exakt realtids-PCR-teknik som också kan användas för identifiering av C. forsteri, C. orientalis och C. opisthorchis i icke-dödliga prover. Ingen artöverskridande eller värdgenomisk amplifiering upptäcktes i någon av de testade metoderna, dvs. SYBR-baserad qPCR och en gemensam TaqMan-analys, men deras kombinerade tillämpning förbättrade tillförlitligheten när det gäller att skilja arter åt. Dessa metoder har bekräftat samtidiga infektioner av C. forsteri och C. orientalis hos T. maccoyii, vilket också visar på högre prevalens och spridning av C. orientalis i värden.
Nyligen stöddes användbarheten av båda de utvecklade teknikerna för att bedöma de patologiska konsekvenserna av FBF-infektioner. Polinski et al. (2014) kombinerade qPCR med immuntranskription av värdgener för att kvantifiera mängden DNA från vävnader som infekterats av C. opisthorchis och C. orientalis. De kvantifierade också det temporala immunsvaret från värden på dessa infektioner hos blåfenad tonfisk från Stilla havet i bur. Tidigare uppgifter dokumenterade vuxna individer och ägg av C. orientalis i gälarna (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), medan vuxna individer och ägg av C. opisthorchis infekterade hjärtat respektive de afferenta grenartärerna (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Resultaten från Polinski et al. (2014) visade dock en korrelation mellan IgM-transkriptionen och de stora mängderna av ”endast C. orientalis”-infektioner i gälvävnaden, men inte med DNA från C. opisthorchis, vilket tyder på att ett sådant immunsvar i detta organ kan utlösas av närvaron av vuxna snarare än av ägg. Dessutom tillskrivs höga nivåer av DNA från C. orientalis i hjärtat förekomsten av juvenila fläckar. Även om sådana metoder inte kan identifiera FBF:s livshistoriska stadier eller huruvida fläckarna är levande eller döda eller inte, möjliggör detta kvantitativa tillvägagångssätt gissningar om infektionsintensitet och infektionsstatus, vilket i sig är ett lovande verktyg för framtida epidemiologiska studier som omfattar vilda eller odlade fiskar.
Brant et al. (2006) använde sig av fylogenetisk inferens (28S, 18S och COI) för att behandla flera oidentifierade förmodade FBF-cerkarier som isolerats från gastropoder (Planorbidae och Thiaridae) i Uganda, Kenya och Australien. De karakteriserade cerkarierna morfologiskt med hjälp av fotomikrografer och baserat på närvaron/frånvaron av ögonfläckar, fenveck på cerkariernas svans och kropp samt svansens form. Även om det saknas en konsekvent och fylogenetiskt sammanhängande, morfologibaserad definition (diagnos) av FBF-cerkarier, är dessa cerkarier typiskt sett utmärkande: små, gaffelstjärtade, utan ventral suggapparat, med ett distinkt penetrerande organ som troligen består av en specialiserad främre sugpparat (Truong och Bullard, 2013), ett finneveck på cerkariekroppen och ett finneveck som är närvarande eller saknas på svansens furkae (Cribb et al., 2011). En av dessa cerkarier (W5004) var särskilt morfologiskt bisarr, dvs. beskrevs som apharyngeat och furcocercus men med ”extravaganta laterala svansmembran och en spetsig kroppsform”, och ingen av dessa cerkarier hade alla de typiska egenskaperna hos FBF-cerkarier (se föregående text). Den kombinerade 18S- och 28S-analysen av dessa cerkarier klustrade dem dock med andra FBF-sekvenser (vi antar att ”Sanguinicolid sp.” är den av ”Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Av den anledningen och eftersom de var morfologiskt bisarra i förhållande till kända FBF-cerkarier, hävdade dessa författare att det finns en mycket större morfologisk mångfald av FBF-cerkarier än vad som hittills har uppmärksammats i litteraturen. Den taxonomiska identiteten och den fylogenetiska betydelsen av dessa sekvenser diskuteras vidare senare i texten.