Trame di Arrhenius convesse e la loro interpretazione

Negli ultimi anni, un numero crescente di studi ha misurato la dipendenza dalla temperatura delle reazioni enzimatiche per entrambi gli enzimi termostabili e mesostabili (enzimi da organismi che crescono in modo ottimale ad alta temperatura e alla normale temperatura corporea, rispettivamente). La dipendenza dalla temperatura è di solito esposta in un grafico di Arrhenius, che è il logaritmo naturale del coefficiente di velocità contro il reciproco della temperatura assoluta (Fig. 1). Alcune delle metodologie per misurare le dipendenze dalla temperatura dei tassi di reazione sono state applicate anche per misurare le dipendenze dalla temperatura degli effetti cinetici isotopici (KIE) delle reazioni catalizzate, e tali esperimenti forniscono dati sperimentali molto rilevanti per caratterizzare i colli di bottiglia dinamici delle reazioni (1-6). Un gran numero di modelli teorici sono stati avanzati per l’interpretazione di questo tipo di dati (7-19).

Sperimentazioni su reazioni catalizzate da una varietà di enzimi deidrogenasi e ossidasi termostabili e mesostabili hanno mostrato che in alcuni casi il plot di Arrhenius per la fase chimica è convesso (20-23). Nel presente articolo, commentiamo il significato di questa osservazione e forniamo un’interpretazione di questa scoperta che la colloca nella prospettiva più ampia della cinetica chimica non biologica e biochimica. Questo articolo sottolinea che il comportamento convesso di Arrhenius pone un vincolo severo sul coefficiente di tasso unimolecolare microcanonico per il passo chimico. In particolare, possiamo andare oltre l’ovvia interpretazione che un grafico convesso di Arrhenius può essere interpretato come un tasso più basso del previsto ad alte temperature, e possiamo dire, sotto certe condizioni, che il coefficiente di tasso unimolecolare microcanonico per il passo chimico deve effettivamente diminuire con l’aumentare dell’energia.

In generale, è auspicabile separare l’interpretazione dei dati sperimentali in due fasi. In primo luogo, si deducono conseguenze generali che poggiano su basi solide come la termodinamica e i principi generali della meccanica statistica. In secondo luogo, si procede a modelli più microscopicamente dettagliati che poggiano su basi meno sicure. Il nuovo aspetto della presente analisi riguarda interamente il primo passo.

La caratteristica sorprendente delle reazioni nei rif. 20-23 che discutiamo qui è la convessità positiva C dei loro diagrammi di Arrhenius, dove 1 k(T) è il coefficiente di velocità catalitica, e T è la temperatura. Scriviamo 2 dove 3 Ea è l’energia di attivazione fenomenologica dipendente dalla temperatura, e R è la costante del gas. Quindi una convessità positiva significa che Ea diminuisce con l’aumentare della temperatura. Nel vasto campo della cinetica, non limitando la considerazione alla cinetica enzimatica, quando si possono osservare diagrammi di Arrhenius non lineari, essi sono quasi sempre concavi, cioè C è negativo. Questo risultato generale è spiegato dall’interpretazione di Tolman dell’energia di attivazione, che può essere scritta come (25-27) 4 dove una barra doppia denota una media su tutti i sistemi che reagiscono, e una barra singola denota una media su tutti i sistemi, che reagiscano o meno. In parole povere, l’Eq. 4 di Tolman afferma che il negativo della pendenza locale di un grafico di Arrhenius può essere interpretato come uguale all’energia media delle molecole che reagiscono meno l’energia media di tutti i possibili reagenti. Per reazioni unimolecolari di una specie termicamente equilibrata: 5 e 6 dove E è l’energia totale, dP/dE è la densità di probabilità normalizzata che un sistema abbia energia E in un insieme canonico alla temperatura T, e k(E) è il coefficiente di tasso unimolecolare per un insieme microcanonico all’energia E.§ Di solito, E̿ aumenta più rapidamente di Ē con l’aumentare di T perché k(E) è di solito una funzione crescente dell’energia.¶ Questo spiega perché Ea di solito aumenta con T e quindi perché C è negativo. Un grafico di Arrhenius convesso significa che E̿ diminuisce o che aumenta meno rapidamente di Ē all’aumentare della temperatura, e nel prossimo paragrafo argomentiamo che questo implica ordinariamente che k(E) diminuisce con l’aumentare dell’energia nella regione di energia che domina gli integrali in Eq. 6.

Si può fare un’affermazione più precisa sulla conseguenza che E̿ diminuisce o aumenta meno rapidamente di Ē all’aumentare della temperatura. Notando che 7 dove β è 1/RT, e ρ(E) è la densità di stati, e usando le Eq. 4-6, si può facilmente mostrare che 8 Così l’affermazione che dEa/dT è negativa è la stessa dell’affermazione che la distribuzione delle energie di reazione è più stretta della distribuzione delle energie reagenti. Se dP/dE fosse simmetrico intorno a Ē, allora il segno di dEa/dT dipenderebbe dalla forma della funzione k(E), e non solo dal suo segno. Ma dP/dE è in realtà una funzione altamente asimmetrica. Per le molecole tipiche, la sua forma è ben approssimata impostando ρ(E) in Eq. 7 uguale a En-1, dove n è approssimativamente uguale al numero di gradi di libertà (31). Se si assume questa forma e si assume anche che k(E) varia lentamente e linearmente nell’importante intervallo degli integrali in Eq. 6, si può mostrare che il lato destro di Eq. 8 è proporzionale a dk/dE con una costante di proporzionalità positiva. Per funzioni k(E) più complicate, non si ha più una proporzionalità esatta, ma la direzione dell’effetto è stabilita dall’asimmetria positiva di dP/dE. Anche se l’identità dei segni di dEa/dT e dk/dE non è un teorema matematico, ci si aspetta che tenga per densità normali di stati e funzioni k(E) lisce.

Questo risultato presenta un vincolo su qualsiasi interpretazione microscopica, e – altrettanto importante – suggerisce nuove interpretazioni microscopiche. Per esempio, supponiamo che lo spazio di configurazione del reagente possa essere partizionato in due tipi di conformazioni, una delle quali (chiamata tipo R) è reattiva con coefficiente di tasso kR(E) e l’altra (chiamata tipo N) è non reattiva con coefficiente di tasso zero. Allora 9 dove PR(E) è la probabilità condizionata che un sistema con energia E sia in una conformazione di tipo R. Questo fornisce un meccanismo per k(E) per diminuire con E, cioè, PR(E) diminuisce con E più velocemente di kR(E) aumenta. Questo potrebbe accadere perché i sistemi ad alta energia visitano una regione più ampia dello spazio di fase e quindi trascorrono una frazione minore del loro tempo in una singola regione vincolata. Questa interpretazione può essere di particolare importanza per l’enzimologia. Negli ultimi anni, diversi studi si sono occupati di comprendere il ruolo del campionamento conformazionale nella catalisi enzimatica (17, 18, 22, 32-37). In una recente revisione, Bruice e Benkovic (17) hanno sostenuto che le configurazioni attive campionate dal complesso enzimatico non sono di energia più alta della popolazione generale di conformazioni e che il popolamento di queste conformazioni può determinare il tasso di reazione. In contrasto con i modelli a volte dettagliati negli articoli citati, la presente interpretazione procede su basi molto generali senza invocare alcun meccanismo o modello molecolare microscopico particolare, come il tunneling promosso da fluttuazioni enzimatiche termicamente eccitate (11, 13, 38, 39), l’energia libera dei calcoli di attivazione che include un campione adeguato di conformazioni (40), o meccanismi specifici di transizioni tra microstati di flessibilità conformazionale variabile (41-44). Tuttavia, può chiaramente ospitare interpretazioni più specifiche come una proteina che è rigida a bassa T o un movimento dinamico che richiede la popolazione di specifici stati vibrazionali a bassa energia. Tuttavia, nulla di ciò che abbiamo detto qui fornisce un supporto specifico a tali modelli, la cui validità dovrebbe essere esaminata da ulteriori esperimenti e simulazioni dettagliate. La presente discussione non invoca specificamente effetti associati alla rottura della teoria degli stati di transizione. Effetti quantistici come il tunneling possono essere accomodati semplicemente includendoli in k(E) o kR(E).

Nel contesto della nostra analisi, i risultati menzionati sopra per la deidrogenasi alcolica termofila ADH-hT (22, 32) possono essere interpretati in termini di tendenze relative in E̿ e Ē quando la temperatura viene modificata. Un’ipotesi ampiamente avanzata è che gli enzimi termofili si sono evoluti per funzionare nella loro nicchia fisiologica, cioè a temperatura elevata, e sono meno attivi a temperatura ambiente (anche meno attivi, in alcuni casi, di quanto previsto dalla loro entalpia di attivazione a temperatura fisiologica). La nostra analisi può offrire una connessione tra questa nozione e i calcoli relativi all’identificazione delle conformazioni attive e non attive (16, 17). Per esempio, Wrba et al. (21) hanno riportato un’osservazione empirica che, per enzimi con diverse temperature di fusione, la differenza nelle temperature di massima curvatura nei diagrammi di Arrhenius è simile alla differenza nella temperatura di fusione. Questo può essere legato agli spostamenti delle dipendenze PR(E) e kR(E) da E negli intervalli che sono importanti alle temperature di transizione per la denaturazione e l’attività. Come ulteriore esempio, notiamo che è stato recentemente suggerito che è “forse non sorprendente che, per le reazioni di scissione dei legami C-H, una suddivisione dell’energia termica in modi proteici a bassa frequenza è un fattore importante. Questi modi possono essere significativamente eccitati a temperatura ambiente, in contrasto con il modo di stiramento C-H, che dovrebbe essere in gran parte confinato al suo livello energetico del punto zero” (22). Questo tipo di considerazioni può essere collegato alla dipendenza dalla temperatura di E̿ e Ē e quindi alla concavità o convessità dei diagrammi di Arrhenius.

La conclusione generale sulla dipendenza energetica del coefficiente di velocità microcanonico è applicabile anche ai diagrammi di Arrhenius convessi che sono occasionalmente osservati in altri studi. Se si vogliono applicare questi argomenti, si deve fare attenzione a garantire che il grafico convesso di Arrhenius rappresenti una vera reazione elementare con reagenti internamente equilibrati. Per esempio, nel problema prototipo allo stato stazionario 10 dove 11 con 12 può essere applicato a k1, k-1, o k2, ma non generalmente a k. Tuttavia, se k-1 e k1 sono molto più grandi di k2, allora k diventa un coefficiente di tasso elementare per A → C, e nessuna conclusione viene modificata dal pre-equilibrio prima del passo di determinazione del tasso. Questo si applica anche al caso in cui k2 è molto più grande di k1 e k-1, dove k diventa k1. Un caso speciale in cui l’approccio dello stato stazionario può essere applicato è quello in cui A corrisponde al reagente non legato e all’enzima, lo stato B è il complesso di Michaelis e lo stato C è il prodotto (45). Si noti che in questo caso k1 (in Eq. 12) dovrebbe essere una costante di tasso del secondo ordine che porta all’equazione di Michaelis: 13 dove è la concentrazione del reagente (substrato), Vmax è la velocità di reazione a molto più alto di KM, che è la costante di Michaelis, (k2 + k-1)/k1, per Eq. 10. La discussione non si applica ai coefficienti di tasso effettivi risultanti da un cambiamento nella fase che determina il tasso o ai cambiamenti nella concentrazione effettiva dell’enzima, né ai coefficienti di tasso con isteresi attribuibile alla formazione del vetro. Questo punto dovrebbe essere enfatizzato per le reazioni enzimatiche: i tassi misurati rappresentano effettivamente una costante di tasso significativa e coerente per l’intero intervallo di temperatura? Per esempio, in un primo rapporto di trama Arrhenius convessa per l’alcol deidrogenasi termofila da Bacillus stearothermophilus (ADH-hT), tutte le misurazioni sono state condotte con la stessa concentrazione di substrato (che saturava l’enzima a temperatura ambiente), e la Vmax è stata presentata (47). Un rapporto successivo (22) ha trovato che KM aumenta con la temperatura, quindi ad alta temperatura non era sufficientemente più grande di KM, e il tasso misurato è stato trovato più lento di Vmax, presentando un grafico Arrhenius apparentemente convesso. Anche per la cinetica enzimatica realistica più semplice, il meccanismo 10 dovrebbe essere aumentato da una fase di rilascio del prodotto, e i dati dovrebbero essere analizzati tenendo conto dell’impegno alla catalisi e del rapporto di catalisi (48, 49); altrimenti, il kcat misurato potrebbe mostrare una dipendenza dalla temperatura diversa dal k2 intrinseco. I Rif. 20-24 sono stati selezionati come esempi in cui è stata prestata particolare attenzione a garantire e dimostrare che il grafico di Arrhenius corrisponde a un singolo passo di reazione chimica elementare limitante il tasso in funzione della temperatura. Rubach e Plapp (comunicazione personale di risultati non pubblicati), per esempio, hanno usato tecniche di stato stazionario stop-flow per misurare i KIE sulle costanti di velocità microscopiche per studiare la reazione catalizzata dall’alcol deidrogenasi del fegato di cavallo. Hanno trovato diagrammi di Arrhenius convessi sia per il trasferimento di idruri che di deuteridi, ma nessuna dipendenza dalla temperatura dei KIE, e hanno dimostrato che nessun cambiamento nella fase che determina la velocità può influenzare i loro risultati. Abbiamo inoltre escluso i casi in cui l’intervallo di temperatura permette di avere proteine irreversibilmente fuse o parzialmente fuse. In contrasto con gli esempi enzimatici che mostrano un comportamento Arrhenius convesso che coinvolge un singolo passo elementare, citiamo il caso della permeazione cutanea dei farmaci, dove è stato osservato un comportamento Arrhenius convesso, ma dove i passi elementari non sono stati o non possono essere separati (50, 51). Per confronto con la permeazione attraverso la pelle, menzioniamo anche che il caso un po’ meglio definito della dipendenza dalla temperatura non-Arrhenius della diffusione nei solidi amorfi è stato modellato da un modello multistep site-hopping (52, 53).

Un esempio dalla chimica organica fornisce un’utile illustrazione di questi concetti in combinazione con una riorganizzazione strutturale dipendente dalla temperatura. Limbach ha osservato diagrammi di Arrhenius convessi (comunicazione personale di risultati non pubblicati) per il trasferimento protonico intramolecolare catalizzato dalla base nell’1,3-bis-(4-fluorofenil)-triazene sciolto in etere etilico. Il coefficiente di tasso rappresenta una media su diverse forme di legame a idrogeno del reagente, in particolare la molecola libera e il complesso con la base. Il trasferimento di protoni avviene nel complesso. La curvatura convessa di Arrhenius deriva dal fatto che la molecola cambia ad alta temperatura nella forma non complessa dove la barriera al trasferimento di protoni è maggiore (rif. 55 e H. H. Limbach, comunicazione personale). Quindi l’interpretazione di Tolman non è strettamente applicabile perché il coefficiente di velocità non rappresenta un singolo passo elementare. Il grafico di Arrhenius della reazione da una delle due forme separatamente sarebbe presumibilmente quasilineare o concavo. Se, tuttavia, le diverse forme con legame a idrogeno sono considerate come conformatori di un singolo reagente, l’interpretazione di Tolman può essere applicata, e fornisce un’illustrazione di una molecola che reagisce più lentamente ad alta energia perché esplora una regione più ampia dello spazio di fase che include conformatori essenzialmente non reattivi. Allo stesso modo, Massey et al. (23) suggeriscono una possibile spiegazione del loro grafico convesso di Arrhenius che coinvolge due forme enzimatiche concorrenti, ciascuna dominante in un diverso intervallo di temperatura. Questo modello è un esempio particolare di un modello che potrebbe essere coerente con il risultato indipendente dal modello presentato qui. Per le reazioni non biologiche ci aspettiamo che le configurazioni particolarmente reattive siano spesso specie ad alta energia. È possibile che i diagrammi di Arrhenius convessi siano più comuni nei sistemi biologici perché un enzima può essersi evoluto specificamente in modo tale che gli stati a più bassa energia (cioè quelli più accessibili a T ambiente) siano quelli reattivi, portando così a un basso E̿ anche se la T viene aumentata.

I diagrammi di Arrhenius convessi sono stati osservati anche per la diffusione in liquidi e vetri super raffreddati. Questi casi, come il problema della permeazione della pelle menzionato sopra, possono essere complicati da percorsi paralleli multipli, ma hanno comunque reso possibile un’analisi dettagliata. Una spiegazione ampiamente citata è che le molecole nei liquidi a bassa temperatura si diffondono attraversando barriere di potenziale apprezzabili, mentre ad alta temperatura i movimenti diffusivi sono quasi liberi (24, 56). Questo modello riconosce che con l’aumentare della temperatura, le energie termiche diventeranno più grandi rispetto alle altezze delle barriere; ciò che è richiesto per un grafico Arrhenius convesso è che l’energia media delle molecole che fanno transizioni (in questo caso, salti diffusivi da un minimo locale a un altro) aumenta più lentamente dell’energia media di tutte le molecole. Ci sono molte teorie dettagliate del comportamento non-Arhenius nei fluidi metastabili e nei vetri che non affrontano esplicitamente la dipendenza dalla temperatura dell’energia di attivazione in termini di interpretazione di Tolman (58), ma qualsiasi spiegazione coerente di un grafico convesso di Arrhenius in termini di coefficienti di velocità elementari di equilibrio locale deve essere coerente con il risultato di Tolman a qualche livello sottostante, anche se questo non è esplicito o nemmeno riconosciuto.

In sintesi, il presente articolo ha evidenziato l’informazione microcanonica fondamentale che viene fornita da un’osservazione della convessità del grafico di Arrhenius, ma che apparentemente non è stata interpretata in precedenza. L’analisi ha un’ampia applicabilità e fa una previsione definitiva indipendente dal modello sulle energie medie dei sistemi che fanno transizioni. Il risultato è rilevante per tutti i campi della cinetica (negli enzimi, nella chimica atmosferica, nelle reazioni di cluster, ecc.) dove si possono osservare trame di Arrhenius convesse, e abbiamo quindi mantenuto la presentazione il più generale possibile, pur citando recenti esperimenti con catalizzatori deidrogenasi e ossidasi termostabili e mesostabili come esempi specifici che mostrano il fenomeno. Abbiamo anche fatto una connessione con la teoria della diffusione. Speriamo che il punto di vista sposato in questo articolo stimoli nuovi modi di pensare ai tassi di reazione, alla catalisi e alla diffusione.

• Ricevuto il 12 settembre 2000.