2 Life History
Le cercarie della FBF sono minute, sono difficili da identificare morfologicamente, e tipicamente hanno una prevalenza estremamente bassa di infezione tra le popolazioni di invertebrati ospiti intermedi (Cribb et al., 2011). Forse come risultato di questi attributi, l’ospite intermedio (o gli ospiti) è sconosciuto per tutte le specie FBF tranne che per alcune: diverse specie del genere d’acqua dolce Sanguinicola (vedi Bullard e Overstreet, 2008) e le specie marine Aporocotyle simplex (vedi Køie, 1982; Køie e Petersen, 1988, infezioni sperimentali; nessun marcatore molecolare applicato), Paracardicoloides yamagutii (vedi Nolan e Cribb, 2004a; vedi testo successivo), C. forsteri (vedi Cribb et al, 2011; vedi testo successivo), e Cardicola opisthorchis (vedi Sugihara et al., 2014; vedi testo successivo). Le sequenze ITS2 rDNA sono state utilizzate per abbinare esemplari larvali FBF morfologicamente indeterminati, cioè cercarie, sporocisti e redie, raccolti da ospiti invertebrati con esemplari adulti morfologicamente distinti da ospiti simpatrici di pesci. In modo rapido e poco costoso, i marcatori molecolari permettono la rapida individuazione delle infezioni; l’identificazione dell’agente infettivo, per inferenza filogenetica o per omologia di sequenza ad un taxon già sequenziato; e l’identificazione di ospiti intermedi, collegando così le fasi della storia della vita di FBF potenzialmente patogeni. Certamente, determinare l’identità degli ospiti intermedi e definitivi comprende un primo passo critico nella comprensione del ciclo di vita dei FBF. Al di là degli approcci diagnostici, tuttavia, resta ancora molto da imparare sui dettagli specifici della relazione ospite-parassita tra le FBF e i loro ospiti intermedi policheti, gasteropodi e bivalvi. Dopo tutto, la loro storia evolutiva potrebbe essere influenzata tanto, o più, da questi ospiti intermedi quanto dai loro ospiti definitivi. Come tale, sosteniamo che gli studi molecolari non dovrebbero soppiantare completamente i classici studi sperimentali che fanno osservazioni dirette al microscopio delle FBF larvali e adulte nei tessuti dell’ospite dopo l’esposizione di invertebrati ingenui e ospiti definitivi dei pesci (Køie, 1982).
Molte delle informazioni riguardanti i cicli di vita delle FBF provengono da programmi sanitari per animali acquatici legati all’acquacoltura commerciale: 17 su 109 (16%) delle sequenze FBF disponibili in GenBank derivano da infezioni in acquacoltura marina (Tabella 1.1). Gli FBF comprendono uno dei pochi gruppi di trematodi i cui membri possono danneggiare l’ospite definitivo del pesce come adulti che occludono i vasi sanguigni e causano asfissia, come uova che danneggiano o ostruiscono gli epiteli branchiali e i vasi branchiali, e come miracidi che si schiudono dalle uova incorporate nell’epitelio branchiale e forano il pesce (Bullard e Overstreet, 2002, 2008). Come tali, i loro cicli di vita sono motivo di preoccupazione per le operazioni di acquacoltura commerciale perché gli FBF possono uccidere o debilitare i pesci e causare perdite economiche nei laghetti d’acqua dolce, nei raceway e nelle gabbie marine in mare aperto. Le sequenze provenienti da FBF non adulti che infettano ospiti gasteropodi, bivalvi e policheti, che ospitano gli stadi riproduttivi asessuati dei FBF – corocisti, rediaci e cercarie – sono molto meno numerose (4 su 109) (Tabella 1.1) di quelle provenienti da esemplari adulti che infettano ospiti pesci.
Nel primo studio pubblicato sul ciclo vitale di FBF determinato dall’applicazione di un metodo molecolare, Nolan e Cribb (2004a) hanno documentato due morfotipi cercarici (“tipo A” e “tipo B”) che infettano 80 di 11.314 (0,7%) esemplari del gasteropode idrobiide Posticobia brazieri nelle insenature di marea del Queensland, Australia. Le sequenze ITS2 rDNA delle cercarie di tipo A si sono allineate (100% di accordo) con esemplari adulti di P. yamagutii che sono stati raccolti dal sangue (aorta dorsale, atrio, ventricolo, branchie, rene e vasi sanguigni dell’intestino e della vescica natatoria) di anguille a pinna lunga maculate Anguilla reinhardtii. In un altro studio, rispondendo alle preoccupazioni sulle malattie associate alle infezioni di C. forsteri che infettano il tonno rosso meridionale in coltura T. maccoyii al largo dell’Australia meridionale, Cribb et al. (2011) hanno esaminato 9351 individui di 11 bivalvi, 2 gasteropodi e 24 famiglie di policheti per infezioni da FBF. I dati di sequenza ITS2 rDNA derivati da cercari che hanno infettato Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) si sono allineati con il 100% di accordo con esemplari adulti di C. forsteri dal cuore del vicino tonno rosso meridionale in un recinto di rete a Port Lincoln, Australia. Hanno anche sequenziato il frammento 28S rDNA (721 bp nella regione D1-D2) da cercarie di C. forsteri che hanno infettato L. modestus. Seguendo l’approccio di Cribb et al. (2011), Sugihara et al. (2014) si sono concentrati sui policheti mentre esaminavano 744 invertebrati per le infezioni FBF in un sito di cultura del tonno rosso del Pacifico Thunnus orientalis, al largo del Giappone meridionale. Sporocisti e cercari di FBF sono stati trovati in cinque individui di un policheta terebellide (Terebella) raccolti dall’interno del guscio di cirripedi morti presi dal substrato e da corde e galleggianti sotto la gabbia marina. Le sequenze ITS2 e 28S delle sporocisti erano identiche (100%) a quelle degli adulti di C. opisthorchis dal cuore del tonno rosso del Pacifico in coltura.
Shirakashi et al. (2012) hanno studiato le infezioni simultanee di Cardicola orientalis e C. opisthorchis nel tonno rosso del Pacifico. Hanno usato i dati di sequenza ITS2 rDNA per differenziare le uova a forma di mezzaluna di C. opisthorchis nell’arteria del filamento afferente dalle uova ovoidali di C. orientalis che infettano le lamelle delle branchie. Hanno affermato che i primer PCR specie-specifici applicati a campioni di tessuto branchiale potrebbero integrare l’istopatologia e aiutare a diagnosticare le infezioni prima che le uova e gli adulti siano abbastanza numerosi da essere facilmente osservati con la microscopia ottica. Yong et al. (2013) hanno utilizzato dati di sequenza completa ITS2 rDNA per identificare le uova FBF alloggiate nella branchia di cinque specie di pesci farfalla (Perciformes: Chaetodontidae) dalla Grande Barriera Corallina come una singola specie Cardicola chaetodontis (una differenza di una singola coppia di basi in due campioni). Le uova di FBF non sono infrequentemente osservate nell’epitelio branchiale e nelle arteriole branchiali dei pesci durante le necroscopie di routine dei pesci (SAB, osservazioni personali), ma in molti casi, i corrispondenti esemplari adulti che infettano il sangue del singolo pesce non vengono recuperati. Le tecniche molecolari che estraggono e amplificano efficacemente il DNA dalle uova di FBF, che sono minuscole, per esempio, le uova di C. chaetodontis hanno una lunghezza totale di 40-60 μm, promettono di rivelare la presenza di specie non nominate di FBF e di ospiti finora non documentati se le sequenze risultanti sono collocate in un contesto filogenetico con sequenze di specie nominate. Lo stesso si può dire per le sequenze derivate dalle cercarie (vedi testo successivo). Usando la reazione quantitativa a catena della polimerasi (qPCR), Norte Do Santos et al. (2012) hanno identificato le uova di C. forsteri aggregate nella branchia del tonno rosso meridionale allevato. Allo stesso modo, Kirchhoff et al. (2012) hanno applicato questo metodo per diagnosticare le uova di C. forsteri che infettano T. maccoyii. Polinski et al. (2013) hanno fatto un ulteriore passo avanti sviluppando una tecnica di PCR in tempo reale sensibile e accurata che può essere utilizzata anche per l’identificazione di C. forsteri, C. orientalis e C. opisthorchis in campioni non letali. Nessuna specie incrociata o amplificazione genomica dell’ospite è stata rilevata in entrambi i metodi testati, cioè, SYBR-based qPCR e un comune saggio TaqMan reporter; tuttavia, la loro applicazione combinata ha migliorato l’affidabilità per differenziare le specie. Questi metodi hanno confermato le infezioni concomitanti di C. forsteri e C. orientalis in T. maccoyii, indicando anche la maggiore prevalenza e distribuzione di C. orientalis nell’ospite.
Di recente, l’utilità di entrambe le tecniche sviluppate è stata sostenuta per valutare le conseguenze patologiche delle infezioni FBF. Polinski et al. (2014) hanno combinato la qPCR con la trascrizione immunitaria dei geni dell’ospite per quantificare le quantità di DNA dai tessuti infettati da C. opisthorchis e C. orientalis. Hanno anche quantificato la risposta immunitaria temporale dell’ospite a queste infezioni nel tonno rosso del Pacifico in gabbia. Dati precedenti hanno documentato adulti e uova di C. orientalis nelle branchie (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), mentre adulti e uova di C. opisthorchis hanno infettato il cuore e le arterie branchiali afferenti, rispettivamente (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). I risultati di Polinski et al. (2014), tuttavia, hanno rivelato una correlazione della trascrizione IgM alle alte quantità di infezioni “solo C. orientalis” nei tessuti branchiali ma non al DNA di C. opisthorchis, suggerendo che tale risposta immunitaria in questo organo potrebbe essere innescata dalla presenza di adulti piuttosto che di uova. Inoltre, gli alti livelli di DNA di C. orientalis nel cuore sono stati attribuiti alla presenza di distomi giovanili. Anche se questi metodi non possono identificare gli stadi della storia della vita di FBF o se i vermi sono vivi o morti, questo approccio quantitativo permette di fare congetture sull’intensità dell’infezione e sullo stato dell’infezione, che è di per sé uno strumento promettente per futuri studi epidemiologici che coinvolgono pesci selvatici o in coltura.
Brant et al. (2006) hanno usato l’inferenza filogenetica (28S, 18S, e COI) nel trattare diverse cercarie FBF putative non identificate isolate da gasteropodi (Planorbidae e Thiaridae) in Uganda, Kenya e Australia. Hanno caratterizzato morfologicamente le cercarie con fotomicrografie e basandosi sulla presenza/assenza di ocelli, pieghe delle pinne sulla coda e sul corpo del cercario e sulla forma della coda. Anche se manca una definizione coerente e filogeneticamente coerente, basata sulla morfologia (diagnosi) delle cercarie FBF, queste cercarie sono tipicamente distintive: minute, con la coda a forcella, senza una ventosa ventrale, con un organo penetrante distintivo che probabilmente comprende una ventosa anteriore specializzata (Truong e Bullard, 2013), una piega a pinna sul corpo del cercario, e una piega a pinna presente o assente sulla coda furcae (Cribb et al., 2011). Uno di questi cercari (W5004) era particolarmente bizzarro morfologicamente, cioè descritto come afaringeo e furcocercoso ma con “stravaganti membrane laterali della coda e una forma del corpo a punta”, e nessuno di questi cercari aveva tutte le caratteristiche tipiche dei cercari FBF (vedi testo precedente). Tuttavia, l’analisi combinata 18S e 28S di queste cercarie le ha raggruppate con altre sequenze FBF (presumiamo che “Sanguinicolid sp.” sia quella di “Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Per questa ragione e perché erano morfologicamente bizzarri rispetto alle cercarie FBF conosciute, questi autori hanno postulato che esiste una diversità morfologica di cercarie FBF molto più grande di quanto sia stato riconosciuto nella letteratura fino ad oggi. L’identità tassonomica e il significato filogenetico di queste sequenze sono discussi più avanti nel testo.