2 Life History
Cerkárie FFB jsou drobné, morfologicky obtížně identifikovatelné a obvykle mají extrémně nízkou prevalenci infekce mezi populacemi bezobratlých mezihostitelů (Cribb et al., 2011). Snad v důsledku těchto vlastností je mezihostitel(é) neznámý(í) u všech druhů FBF kromě několika málo: několik druhů sladkovodního rodu Sanguinicola (viz Bullard a Overstreet, 2008) a mořské druhy Aporocotyle simplex (viz Køie, 1982; Køie a Petersen, 1988, experimentální infekce; nebyly použity žádné molekulární markery), Paracardicoloides yamagutii (viz Nolan a Cribb, 2004a; viz následující text), C. forsteri (viz Cribb et al., 2011; viz následující text) a Cardicola opisthorchis (viz Sugihara et al., 2014; viz následující text). Sekvence ITS2 rDNA byly použity k porovnání morfologicky neurčitých larválních exemplářů FBF, tj. cerkarií, sporocyst a redií, odebraných z bezobratlých hostitelů s morfologicky odlišnými dospělými exempláři ze sympatrických rybích hostitelů. Molekulární markery umožňují rychlou a levnou detekci infekcí, identifikaci infekčního agens na základě fylogenetické inference nebo sekvenční homologie s již sekvenovaným taxonem a identifikaci mezihostitelů, a tím propojení životních fází potenciálně patogenních FBF. Určení identity mezihostitelů a definitivních hostitelů je jistě prvním kritickým krokem k pochopení životního cyklu FBF. Kromě diagnostických přístupů je však třeba se ještě mnoho dozvědět o specifických detailech vztahu mezi hostitelem a parazitem mezi FBF a jejich mezihostiteli z řad mnohonožek, plžů a mlžů. Koneckonců jejich evoluční historie může být ovlivněna stejně nebo více těmito mezihostiteli než jejich definitivními hostiteli. Proto tvrdíme, že molekulární studie by neměly zcela nahradit klasické experimentální studie, které provádějí přímá mikroskopická pozorování larev a dospělců FBF v hostitelských tkáních po expozici naivních bezobratlých a definitivních hostitelů ryb (Køie, 1982).
Většina informací týkajících se životních cyklů FBF pochází z programů pro zdraví vodních živočichů spojených s komerční akvakulturou: 17 ze 109 (16 %) dostupných sekvencí FBF v GenBank pochází z infekcí v mořské akvakultuře (tabulka 1.1). FBF tvoří jednu z mála skupin trematodů, jejichž příslušníci mohou poškodit definitivního hostitele ryby jako dospělci, kteří ucpávají krevní cévy a způsobují asfyxii, jako vajíčka, která poškozují nebo ucpávají žaberní epitel a branchiální cévy, a jako miracidie, které se líhnou z vajíček usazených v žaberním epitelu a vyvrhují se z ryby (Bullard a Overstreet, 2002, 2008). Jejich životní cykly jsou proto předmětem zájmu komerčních akvakulturních provozů, protože FBF mohou usmrtit nebo oslabit ryby a způsobit ekonomické ztráty ve sladkovodních rybnících, závodních dráhách a mořských sádkách na moři. Sekvence pocházející z nedospělých jedinců FBF infikujících hostitele z řad plžů, mlžů a mnohonožek, v nichž se nacházejí asexuální reprodukční stadia FBF – sporocysty, redie a cerkárie – jsou mnohem méně početné (4 ze 109) (tabulka 1.1) než sekvence z dospělých jedinců infikujících hostitele z řad ryb.
V první publikované studii životního cyklu FBF určeného aplikací molekulární metody zdokumentovali Nolan a Cribb (2004a) dva cerkáriové morfotypy („typ A“ a „typ B“) infikující 80 z 11 314 (0,7 %) exemplářů hydrobiálního plže Posticobia brazieri v přílivových potocích Queenslandu v Austrálii. Sekvence ITS2 rDNA cerkárií typu A se shodovaly (100% shoda) s dospělými jedinci P. yamagutii, kteří byli odebráni z krve (hřbetní aorty, síně, komory, žaber, ledvin a cév střeva a plovacího měchýře) dlouhoploutvého úhoře skvrnitého Anguilla reinhardtii. V jiné studii, která reagovala na obavy z onemocnění spojených s infekcí C. forsteri infikující chovaného tuňáka jižního T. maccoyii u jižní Austrálie, Cribb et al. (2011) vyšetřili 9351 jedinců z 11 čeledí mlžů, 2 čeledí plžů a 24 čeledí mnohonožek na infekci FBF. Data sekvence ITS2 rDNA získaná z cerkárií, které infikovaly Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae), se 100% shodovala s dospělými jedinci C. forsteri ze srdce nedalekého tuňáka jižního v síťové ohradě v Port Lincolnu v Austrálii. Rovněž sekvenovali fragment 28S rDNA (721 bp v oblasti D1-D2) z cerkárií C. forsteri, které infikovaly L. modestus. V návaznosti na přístup Cribba et al. (2011) se Sugihara et al. (2014) zaměřili na mnohoštětinatce při zkoumání 744 bezobratlých na infekce FBF v místě chovu pacifického tuňáka obecného Thunnus orientalis u jižního Japonska. Sporocysty a cerkárie FBF byly nalezeny u pěti jedinců terebellidního mnohoštětinatce (Terebella) sebraných uvnitř schránek mrtvých sudokopytníků odebraných ze substrátu a z lan a plováků pod mořskou klecí. Sekvence ITS2 a 28S ze sporocyst byly identické (100 %) se sekvencemi dospělců C. opisthorchis ze srdce kultivovaného pacifického tuňáka.
Shirakashi et al. (2012) studovali souběžné infekce Cardicola orientalis a C. opisthorchis u pacifického tuňáka. Použili údaje o sekvenci ITS2 rDNA k odlišení půlměsícovitých vajíček C. opisthorchis v aferentní vláknové tepně od vejčitých vajíček C. orientalis infikujících žaberní lamely. Uvedli, že druhově specifické PCR primery aplikované na vzorky žaberní tkáně by mohly doplnit histopatologii a pomoci diagnostikovat infekce dříve, než jsou vajíčka a dospělci dostatečně početní, aby je bylo možné snadno pozorovat světelnou mikroskopií. Yong et al. (2013) použili kompletní data sekvence ITS2 rDNA k identifikaci vajíček FBF uložených v žábrách pěti druhů motýlkovitých ryb (Perciformes: Chaetodontidae) z Velkého bariérového útesu jako jediného druhu Cardicola chaetodontis (rozdíl jednoho páru bází u dvou vzorků). Vajíčka FBF jsou nezřídka pozorována v žaberním epitelu a branchiálních arteriolách ryb během rutinních nekropsií ryb (SAB, osobní pozorování), ale v mnoha případech nejsou nalezeny odpovídající dospělé exempláře, které infikují krev jednotlivých ryb. Molekulární techniky, které účinně extrahují a amplifikují DNA z vajíček FBF, která jsou nepatrná, např. vajíčka C. chaetodontis mají celkovou délku 40-60 μm, slibují odhalit přítomnost nepojmenovaných druhů FBF a dosud nedokumentovaných hostitelů, pokud budou výsledné sekvence zařazeny do fylogenetického kontextu se sekvencemi pojmenovaných druhů. Totéž lze říci o sekvencích získaných z cerkárií (viz následující text). Norte Do Santos et al. (2012) pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) identifikovali vajíčka C. forsteri agregovaná v žábrách chovaných tuňáků jižních. Podobně Kirchhoff et al. (2012) použili tuto metodu k diagnostice vajíček C. forsteri infikujících T. maccoyii. Polinski et al. (2013) posunuli tento přístup o krok dále tím, že vyvinuli citlivou a přesnou techniku PCR v reálném čase, kterou lze použít i pro identifikaci C. forsteri, C. orientalis a C. opisthorchis v neletálních vzorcích. U žádné z testovaných metod, tj. qPCR na bázi SYBR a běžného reportérového testu TaqMan, nebyla zjištěna mezidruhová nebo hostitelská genomová amplifikace; jejich kombinované použití však zvýšilo spolehlivost rozlišení druhů. Tyto metody potvrdily souběžné infekce C. forsteri a C. orientalis u T. maccoyii, což rovněž naznačuje vyšší prevalenci a rozšíření C. orientalis v hostiteli.
Nejnověji byla podpořena užitečnost obou vyvinutých technik pro posouzení patologických důsledků infekcí FBF. Polinski et al. (2014) zkombinovali qPCR s imunitní transkripcí hostitelských genů za účelem kvantifikace množství DNA z tkání infikovaných C. opisthorchis a C. orientalis. Kvantifikovali také časovou imunitní odpověď hostitele na tyto infekce u pacifického tuňáka obecného v kleci. Předchozí údaje dokumentovaly dospělce a vajíčka C. orientalis v žábrách (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), zatímco dospělci a vajíčka C. opisthorchis infikovali srdce a aferentní branchiální arterie (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Výsledky Polinski et al. (2014) však odhalily korelaci transkripce IgM s vysokým množstvím infekcí „pouze C. orientalis“ v žaberních tkáních, ale ne s DNA C. opisthorchis, což naznačuje, že taková imunitní odpověď v tomto orgánu může být vyvolána spíše přítomností dospělců než vajíček. Kromě toho byly vysoké hladiny DNA C. orientalis v srdci přisuzovány přítomnosti juvenilních motolic. Ačkoli tyto metody nemohou určit životní stádia FBF ani to, zda jsou motolice živé nebo mrtvé, umožňuje tento kvantitativní přístup domýšlet intenzitu infekce a její stav, což je samo o sobě slibným nástrojem pro budoucí epidemiologické studie zahrnující volně žijící nebo chované ryby.
Brant et al. (2006) použili fylogenetickou inferenci (28S, 18S a COI) při zpracování několika neidentifikovaných domnělých cerkárií FBF izolovaných z plžů (Planorbidae a Thiaridae) v Ugandě, Keni a Austrálii. Morfologicky charakterizovali cerkárie pomocí fotomikrofotografií a na základě přítomnosti/nepřítomnosti očních bodů, ploutevních záhybů na ocase a těle cerkárie a tvaru ocasu. Přestože chybí konzistentní a fylogeneticky ucelená, na morfologii založená definice (diagnóza) cerkárií FBF, jsou tyto cerkárie typicky charakteristické: drobné, vidlicovité, bez ventrálního sosáku, s výrazným penetračním orgánem, který pravděpodobně zahrnuje specializovaný přední sosák (Truong a Bullard, 2013), ploutevní záhyb na těle cerkárií a přítomný nebo nepřítomný ploutevní záhyb na ocasní furce (Cribb et al., 2011). Jedna z těchto cerkarií (W5004) byla obzvláště morfologicky bizarní, tj. byla popsána jako afaryngeální a furkocerkoidní, ale s „extravagantními postranními ocasními blánami a špičatým tvarem těla“, přičemž žádná z těchto cerkarií neměla všechny typické znaky cerkarií FBF (viz předchozí text). Kombinovaná analýza 18S a 28S těchto cerkarií je však shlukovala s jinými sekvencemi FBF (předpokládáme, že „Sanguinicolid sp.“ je sekvence „Sanguinicola cf. inermis“ (AY222180)). Z tohoto důvodu a proto, že byly morfologicky bizarní vzhledem ke známým cerkáriím FBF, vyslovili tito autoři domněnku, že existuje mnohem větší morfologická diverzita cerkárií FBF, než jaká byla dosud v literatuře rozpoznána. Taxonomická identita a fylogenetický význam těchto sekvencí jsou dále diskutovány níže v textu.
.