Všechny živé organismy si vyvinuly způsoby ochrany proti abiotickým a biotickým útokům. Například mikrobi využívají restrikční/modifikační systémy DNA na ochranu proti cizí DNA; obsahují také systémy na detoxikaci a/nebo vytěsnění xenobiotik nebo nadměrných reaktivních forem kyslíku (ROS). Mnohobuněčné organismy využívají další systémy a často se na nich podílí jedna nebo více úrovní imunity. Nejlépe prozkoumaný a nejvíce oceňovaný je u čelistnatých obratlovců získaný/adaptivní imunitní systém s dobře známými B a T buňkami a antigenně specifickými protilátkami. Tato úroveň imunity je nadřazena mnohem základnějšímu, evolučně starobylému vrozenému imunitnímu systému, který je přítomen nejen u savců, ale i u jiných živočichů a rostlin. Teprve v posledních několika desetiletích se začíná oceňovat význam vrozené imunity pro přežití mnohobuněčných organismů. Chrání člověka, ostatní živočichy a rostliny před tisíci potenciálně škodlivých mikrobů, se kterými se denně setkává. Vývoj vrozené imunity u mnohobuněčných organismů vyžadoval evoluci povrchových buněčných receptorů, které dokázaly rozpoznat/navázat molekuly, jejichž chemická struktura/vzor je obecně zachována v rámci různých tříd cizích organismů, ale chybí u „vlastních“ molekul. Tyto konzervované cizorodé (nesamostatné) molekuly se označují jako molekulární vzory spojené s mikroby (Microbe-Associated Molecular Patterns – MAMPs), označované také jako molekulární vzory spojené s patogeny (Pathogen-Associated Molecular Patterns – PAMPs), a jejich přítomnost detekují členové velké rodiny receptorů rozpoznávání vzorů (pattern recognition receptors – PRR). PRR aktivují jednu nebo více signálních drah, často s pomocí ko-receptorů, a vyvolávají tak následné obranné reakce. Příklady MAMPs zahrnují bakteriální lipopolysacharid, flagellin, EF-Tu, DNA, lipoproteiny, peptidoglykany a plísňový chitin. K dispozici je několik vynikajících přehledů MAMPs .
Kromě biotického napadení se organismy musí vyrovnávat s různými abiotickými útoky, jako je mechanické nebo buněčné poškození, a také se stresy prostředí, jako je sucho a zasolení. Některé endogenní molekuly aktivují vrozený imunitní systém, když se v důsledku poškození (traumatu) uvolní do extracelulárního prostoru (včetně rostlinného apoplastu) ze svého normálního umístění; tyto molekuly se označují jako Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs ). DAMPs jsou pasivně uvolňovány z odumírajících buněk v důsledku poškození, traumatu, ischemie nebo nekrózy vyvolané infekcí. Kromě toho mohou být aktivně vylučovány některými imunitními buňkami nebo silně stresovanými buňkami (např. některými nádorovými buňkami). Zatímco MAMPs pocházejí z mikroorganismů a aktivují vrozený imunitní systém, DAMPs pocházejí z hostitelských buněk a iniciují i udržují vrozené imunitní reakce. Obecně se má za to, že tyto obranné mechanismy pomáhají chránit poškozenou tkáň, která je náchylná k infekci v důsledku narušení fyzikálních bariér, které by jinak zabránily průniku mikrobů. U savců je zánět další složkou vrozené imunitní odpovědi; pomáhá nejen předcházet/potlačovat infekci, ale také napomáhá hojení.
Tento přehled se zaměří na DAMPs, zejména na ty rostlinné. DAMPs budou porovnány s MAMPs a s nově identifikovanou třídou aktivátorů vrozené imunity označovanou jako Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMPs ), protože všechny tři třídy vyvolávají mnoho stejných obranných reakcí a sdílejí některé komponenty přenosu signálu.
Živočišné DAMPs
Začneme naši diskusi s živočišnými DAMPs, protože byly poprvé rozpoznány a nejrozsáhleji studovány. Termín DAMPs zavedli Seong a Matzinger v roce 2004 . Tabulka 1 uvádí 26 DAMPs, včetně purinů, pyrimidinů, DNA (nemetylované CpG), oxidovaných lipoproteinů s nízkou hustotou, N-formylpeptidů a různých proteinů. Pro většinu z nich byly identifikovány příbuzné receptory (tabulka 1). Některé DAMP navíc tvoří komplexy s partnerskými molekulami/interaktory, které zesilují nebo usnadňují signalizaci. Mezi ně patří High Mobility Group Box 1 (HMGB1), který je jedním z prvních identifikovaných a nejlépe charakterizovaných DAMP. HMGB1 je vysoce hojný protein asociovaný s chromatinem, který je přítomen ve všech živočišných buňkách . Skládá se ze dvou základních DNA vazebných domén, označovaných jako HMG boxy A a B, a vysoce kyselého C-koncového ocasu, který se podílí na specifických vnitromolekulárních interakcích . V jádře se HMGB1 váže na minoritní drážku DNA a usnadňuje tak kondenzaci DNA, tvorbu nukleozomů a vazbu transkripčních faktorů . Když se uvolňuje do extracelulárního prostředí z nekrotických, poškozených nebo silně stresovaných buněk, funguje jako DAMP s chemo-atraktantní a cytokin-indukční aktivitou .
Extracelulární HMGB1 zprostředkovává řadu biologických odpovědí ve spojení s mnoha receptory, jako je receptor pro produkty pokročilé glykace (RAGE), receptor podobný Toll 2 (TLR2), TLR4, TLR9, C-X-C chemokinový receptor typu 4 (CXCR4), Siglec-10 a T-buněčný imunoglobulinový mucinový receptor 3 (TIM3) . Specifická tvorba heterokomplexů mezi HMGB1 a různými interaktory, jako je adaptor MD-2 nebo prozánětlivé ligandy lipopolysacharidy a CpG oligodeoxynukleutidy, zvyšuje nebo usnadňuje signalizaci a v některých případech je rozhodující pro rozpoznání HMGB1 různými receptory (tabulka 1). Zdá se, že specifická tvorba heterokomplexu je alespoň částečně regulována různými redoxními stavy HMGB1, které částečně závisí na reverzibilní vnitromolekulární disulfidové vazbě vytvořené mezi cysteinovými zbytky 23 a 45 . Nedávné studie ukázaly, že redukovaný HMGB1 tvoří heterokomplex s CXCL12, který podporuje nábor zánětlivých buněk do poškozené tkáně prostřednictvím rozpoznání receptorem CXCR4 . HMGB1 obsahující disulfidovou vazbu specificky váže MD-2, který usnadňuje rozpoznání TLR4, což vede k indukci transkripční aktivace prozánětlivých cytokinů zprostředkované NF-κB . HMGB1 také interaguje s několika dalšími receptory, včetně RAGE a TLR2; v současné době není jasné, zda jsou pro jeho rozpoznání těmito receptory nutné specifické redoxní stavy . Různorodé aktivity HMGB1, partnerské molekuly a receptory pravděpodobně vysvětlují jeho mnohostrannou roli v mnoha rozšířených, devastujících lidských onemocněních.
Nedávno jsme zjistili, že HMGB1 váže kyselinu salicylovou (SA); to potlačuje jak chemoatrakční aktivitu redukovaného HMGB1, tak schopnost HMGB1 obsahujícího disulfidovou vazbu indukovat expresi prozánětlivých cytokinových genů a COX-2 . Místa vázající SA na HMGB1 byla identifikována v HMG-box doménách pomocí NMR studií a potvrzena mutační analýzou. Protein HMGB1 mutovaný v jednom z vazebných míst SA si zachoval chemo-atrakční aktivitu, ale ztratil vazbu a inhibici SA, čímž bylo pevně stanoveno, že vazba SA na HMGB1 přímo potlačuje jeho prozánětlivé aktivity. Byly také identifikovány přírodní a syntetické deriváty SA s mnohem vyšší účinností inhibice HMGB1, čímž byl poskytnut důkaz, že lze dosáhnout nových molekul na bázi SA s vysokou účinností.
Rostlinné DAMP
Na rozdíl od živočichů bylo u rostlin dosud identifikováno mnohem méně DAMP (tabulka 2). Největší a pravděpodobně nejlépe charakterizovanou třídou jsou polypeptidy/peptidy vznikající z větších prekurzorových proteinů. Patří k nim tři rodiny, které objevil Ryan se svými kolegy během studií zaměřených na identifikaci systeminů – termín „používaný pro popis polypeptidových obranných signálů, které jsou produkovány rostlinou v reakci na fyzikální poškození a které indukují obranné geny, a to buď lokálně, nebo systémově“ . Z 60 lb semenáčků rajčat byl izolován polypeptid o 18 aminokyselinách (aa), u něhož bylo prokázáno, že indukuje syntézu proteinů inhibitorů proteináz indukovaných ranami . Tento systemin rajčete vzniká zpracováním ránou indukovaného prohormonu prosysteminu o velikosti 200 aa, který se nachází v cytoplazmě buněk floémového parenchymu cév. Systemin podněcuje sousední doprovodné buňky a sítkovité elementy cévního svazku k syntéze kyseliny jasmonové (JA), která následně systémově aktivuje expresi genů inhibitorů proteináz .
Ačkoli je systemin přítomen u mnoha dalších druhů Solanaceous, včetně brambor, papriky a nočních plodů , v tabáku se nevyskytuje. Toto zjištění přimělo Ryanovu skupinu k hledání jiného typu systeminu. Nakonec byly identifikovány dva polypeptidy bohaté na hydroxyprolin o velikosti 18 aa, které jsou zpracovány z preproproteinu o velikosti 165 aa, ale nesdílejí žádnou sekvenční homologii se systeminem z rajčat .
Třetí rodina DAMP na bázi peptidů byla objevena u Arabidopsis . Tyto 23 aa rostlinné elicitorové peptidy (Peps) jsou odvozeny z 92 aa prekurzoru. Pro AtPepl byly identifikovány dva receptory, PEPR1 a PEPR2 . AtPep vyvolávají různé vrozené imunitní reakce a zvýšenou odolnost a nedávno bylo prokázáno, že forma prekurzoru ProPep3 se uvolňuje do extracelulárního prostoru při infekci Arabidopsis hemi-biotrofním Pseudomonas syringae . Následně byl identifikován ortolog kukuřice (Zea mays), ZmPep1, u něhož bylo prokázáno, že stejně jako AtPepl zvyšuje odolnost vůči mikrobiálním patogenům . Podrobnější pojednání o endogenních peptidových elicitorech viz Yamaguchi a Huffaker .
Další třída DAMP, která se vyskytuje u rostlin i živočichů, pochází z extracelulární matrix. U obratlovců fragmenty hyaluronanu, jednoduchého lineárního polysacharidu sestávajícího z opakující se kyseliny D-glukuronové a D-N-acetylglukosaminu, vyvolávají vrozenou imunitu, pokud jsou uvolněny mechanickým poškozením nebo hydrolytickými enzymy . Tyto fragmenty jsou vnímány receptory TLR2 a TLR4 obsahujícími leucinové repetice . Podobně rostliny obsahují pektinový polysacharid homogalakturonan, lineární polymer 1, 4-vázané kyseliny α-D galakturonové, který pomáhá udržovat integritu buněčné stěny. Fragmenty tohoto polymeru, nazývané oligogalakturonidy (OGs), mohou být uvolňovány mechanicky nebo častěji hydrolytickými enzymy kódovanými patogeny. OGs vyvolávají vrozené imunitní reakce, včetně aktivace MAPK, ukládání kalózy, produkce ROS, zvýšeného cytosolického Ca2+ a aktivace obranných genů . Jako pravděpodobný receptor pro OG byla identifikována kináza 1 asociovaná se stěnou (WAK1) .
Extracelulární ATP (eATP) zahrnuje další třídu rostlinných DAMP, které se vyskytují jak u rostlin, tak u živočichů. Navzdory desítkám let přibývajících důkazů o tom, že eATP působí jako signální molekula, byla tato funkce do značné míry odmítána/diskreditována, pravděpodobně kvůli všudypřítomnosti ATP a jeho ústřední roli univerzální energetické měny ve všech živých organismech od bakterií po člověka . Teprve s identifikací jeho receptorů lokalizovaných na plazmatické membráně, nejprve u živočichů (viz ) a poté u rostlin , byla jeho signální funkce přijata v obou říších. U živočichů působí eATP jako neurotransmiter a signální molekula, která se podílí na svalové kontrakci, buněčné smrti a zánětu . Podílejí se na něm dva typy receptorů: receptor P2Y spřažený s G proteinem a receptor P2X s iontovým kanálem řízeným ligandem. U rostlin byla signální úloha eATP nedávno potvrzena identifikací jeho receptoru Does not Respond to Nucleotides 1 (DORN1 ). Označení eATP jako rostlinné DAMP je založeno na kombinaci pozorování, že i) mutant dorn1 vykazuje potlačenou transkripční odpověď nejen na ATP, ale také na poranění, ii) většina genů indukovaných aplikací eATP je také indukovatelná na poranění a iii) působení eATP vyvolává typické reakce vrozené imunity, včetně přítoku cytosolického Ca2+ , aktivace MAPK a indukce genů asociovaných s denzitou, včetně některých zapojených do biosyntézy JA a ethylenu . Zatím však není známo, zda přispívá k odolnosti vůči patogenům.
Nedávno jsme identifikovali čtvrtou třídu rostlinných DAMP, protein Arabidopsis HMGB AtHMGB3 . Všechny eukaryotické buňky včetně rostlin mají proteiny příbuzné HMGB1. V Arabidopsis 15 genů kóduje proteiny obsahující HMG-box doménu. Byly rozděleny do čtyř skupin: (i) proteiny typu HMGB, (ii) A/T-rich interaction domain (ARID)-HMG proteiny, (iii) 3xHMG proteiny, které obsahují tři HMG boxy, a (iv) strukturně specifický rozpoznávací protein 1 (SSRP1) . Na základě jejich jaderného umístění a struktury domén se předpokládá, že osm proteinů typu HMGB (HMGB1/2/3/4/5/6/12/14) funguje jako architektonické chromozomální proteiny, podobně jako HMGB1 u savců. Pozoruhodné je, že AtHMGB2/3/4 jsou přítomny jak v cytoplazmě, tak v jádře . Cytoplazmatická funkce těchto proteinů není známa. Cytoplazmatické subpopulace by však měly mít po poškození buňky lepší přístup do extracelulárního prostoru (apoplastu) ve srovnání s AtHMGB umístěnými výhradně v jádře , protože nejsou vázány na DNA a ke vstupu do apoplastu jim stačí překonat plazmatickou membránu. Vzhledem k dobře zavedené úloze HMGB1 savců jako prototypu DAMP přítomnost cytoplazmatické subpopulace AtHMGB3 vyvolala možnost, že tento protein plní podobnou funkci. Když byl rekombinantní AtHMGB3 infiltrován do listů Arabidopsis, skutečně vykazoval aktivity podobné DAMP jako AtPep1. Ošetření oběma proteiny vyvolalo aktivaci MAPK, ukládání kalózy, expresi genů souvisejících s obranou a zvýšenou odolnost vůči nekrotrofní Botrytis cinerea .
Na rozdíl od savčího HMGB1, který může být aktivně vylučován po posttranslační modifikaci, neexistuje žádný důkaz o vylučování AtHMGB3. Do extracelulárního prostoru se pravděpodobně dostává pasivně při mechanickém poškození buněk, například hmyzem, nebo při infekci nekrotrofními patogeny. Infekce B. cinerea skutečně způsobila uvolnění AtHMGB3 do apoplastu během 24 h po inokulaci. Takové rychlé uvolnění během časné fáze buněčné nekrózy vyvolané nekrotrofy by mohlo zvýšit odolnost aktivací imunitních reakcí .
Další analýzy odhalily, že AtHMGB3, stejně jako HMGB1, váže SA a že tato interakce, která je zprostředkována konzervovanými zbytky Arg a Lys v jediném HMG boxu AtHMGB3, inhibuje jeho DAMP aktivitu . Toto zjištění se zdá být v rozporu s dobře známou úlohou SA jako pozitivního regulátoru imunitních reakcí . Avšak zatímco obranné reakce vyvolané SA jsou rozhodující pro odolnost vůči biotrofním a hemi-biotrofním patogenům, hlavním hormonem zodpovědným za aktivaci obranných reakcí proti nekrotrofním patogenům a hmyzu je JA . Obranné signální dráhy JA a SA jsou obecně vzájemně antagonistické . Inhibice DAMP aktivity AtHMGB3 zprostředkovaná SA proto může představovat jeden z mechanismů, kterým se tyto dráhy vzájemně ovlivňují. V tomto scénáři by poškození buněk způsobené infekcí nekrotrofními patogeny vedlo k uvolnění AtHMGB3 do extracelulárních prostor; to by aktivovalo obranné mechanismy spojené s JA/ethylenem, které by pomohly tuto hrozbu neutralizovat. Naproti tomu infekce biotrofními patogeny indukuje biosyntézu SA . Zvýšená hladina SA by pak mohla antagonizovat aktivaci obranných mechanismů spojených s JA potlačením aktivity DAMP AtHMGB3 a také podpořit aktivaci obranných mechanismů spojených se SA, které jsou proti tomuto typu patogenu účinnější .
Zjištění, že extracelulární AtHMGB3 je rostlinný DAMP, jehož aktivita vyvolávající imunitní odpověď je inhibována vazbou SA, poskytuje mezidruhový důkaz, že proteiny HMGB fungují extracelulárně jako DAMP u rostlin i živočichů. Navíc poukazuje na existenci společných cílů a společných mechanismů působení SA u rostlin a lidí. Je zajímavé, že většina dosud identifikovaných rostlinných DAMPs má své protějšky u živočichů. Naše studie dále ukázaly, že rostliny a živočichové mají společné cíle SA i mimo HMGB . Například glykolytický enzym glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (GAPDH) u rostlin i lidí váže SA a v důsledku toho má změněnou aktivitu. SA potlačuje úlohu GAPDH při replikaci viru Tomato Bushy Stunt u rostlin a může mít podobné účinky na replikaci viru hepatitidy C u lidí . Potlačuje také GAPDH zprostředkovanou smrt neuronálních buněk u zvířat . Předběžné analýzy vysoce výkonných obrazovek naznačují existenci mnoha dalších cílů SA v rostlinách i u lidí. Přítomnost více cílů SA u živočichů se možná vyvinula v reakci buď na příjem nízkých hladin SA, které jsou přirozeně přítomny v rostlinném materiálu, nebo na endogenní syntézu SA z benzoátů . Budoucí studie budou nutné k posouzení, zda tyto nové rostlinné a živočišné proteiny interagující se SA fungují jako DAMPs.
NAMPs
Nematody, jedni z nejhojnějších živočichů v přírodě, parazitují jak na rostlinách, tak na živočiších. Několik studií naznačilo, že rostliny mohou vnímat infekci hlísticemi , ale identita vnímaného signálu pocházejícího z hlístic nebyla známa. Nedávno jsme identifikovali skupinu obranných signálních molekul z několika rodů rostlinných parazitických háďátek, včetně háďátek kořenových i cystových . Jedná se o evolučně konzervovanou rodinu feromonů háďátek zvaných askarosidy. Ascr#18, nejrozšířenější askarosid u rostlinných parazitických hlístic, vyvolává charakteristické vrozené imunitní reakce včetně aktivace i) MAPK, ii) obranných genů a iii) obranných signálních drah SA a JA, jakož i zvýšenou odolnost vůči virovým, bakteriálním, houbovým a oomycetním patogenům a kořenovým hlísticím u několika dvouděložných a jednoděložných druhů rostlin.
MAMPs, DAMPs a NAMPs
Ačkoli zdroje indukujících signálů jsou velmi odlišné, přičemž MAMPs pocházejí z mikrobů, NAMPs z hlístic a DAMPs jsou aberantně umístěné endogenní molekuly, studie na Arabidopsis naznačují, že většina příslušníků těchto tří tříd imunitu indukujících molekul aktivuje vrozenou imunitní signalizaci prostřednictvím drah, které sdílejí stejné leucin-rich repeat receptor-like kinázy BRI1-Associated Kinase1 (BAK1) a BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, pro NAMP nepublikovaný výsledek M. Manohar, F.C. Schroeder a D.F. Klessig). Tyto molekuly navíc vyvolávají mnoho stejných reakcí vrozené imunitní obrany, včetně přílivu Ca+2 do cytosolu, ukládání kalózy, aktivace MAPK MPK3 a MPK6 spojených s obranou, produkce ROS a zvýšené exprese mnoha genů souvisejících s obranou (tabulka 3). Byly identifikovány rostlinné receptory pro několik MAMP, například FLS2 pro flagellin/flg22 a EFR pro EF-Tu/elf18 . Byly také objeveny receptory pro většinu rostlinných DAMPs, včetně Arabidopsis PEPR1/2 pro Peps , Arabidopsis WAK1 pro OGs a Arabidopsis DORN1 pro eATP . Zatímco rajče SR160 bylo původně uváděno jako receptor pro systemin , dvě nedávné studie tvrdí, že tomu tak není . Rostlinné receptory pro AtHMGB3 a askrosid NAMP ascr#18 zůstávají neznámé (tab. 2). Není také známo, zda je signalizace DAMP AtHMGB3 zesílena nebo usnadněna interagujícími molekulami, jak bylo prokázáno u savčího HMGB1.
.