Materiály
4′-Hydroxyazobenzen-2-karboxylová kyselina (HABA), biotin, N-(2-aminoethyl)maleimidová trifluoroacetátová sůl (amino-maleimid), kyselina octová, octan sodný, kyselina fosforečná, chlorid hořečnatý, Tween 20, Tween 80, hovězí sérový albumin (BSA), dimethyl sulfoxid (DMSO), dextran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; před použitím lyofilizován), 4-nitrofenylchlorformiát (PNC; (před použitím sublimovaný), LiCl (před použitím vysušený při 110 °C), tyramin (TA), bezvodý pyridin, bezvodý N,N-dimethylformamid (DMF), N,N-diisopropylethylamin (DIPEA), piperidin, aminokyseliny, acetanhydrid, triisopropylsilan, kyselina trifluoroctová (TFA), hydroxid sodný (NaOH), N-Boc-1,4-butandiamin (NH2-Boc), hydrogenuhličitan sodný (NaHCO3), biotin-atto565, biotin-4-fluorescein (biotin-FITC), 6-aminofluorescein, křenová peroxidáza (HRP, typ VI), biotin-HRP, peroxid vodíku (H2O2; s inhibitorem), fetální hovězí sérum (FBS), kalcein AM, ethidium homodimer-1 (EthD-1), thiazolylmodrá tetrazoliová modř (MTT) a všechna ostatní rozpouštědla, pokud není uvedeno jinak, byla zakoupena od společnosti Sigma-Aldrich. Předloha ve tvaru kosti byla zakoupena od společnosti LEGO. Polydimethylsiloxan (PDMS; Sylgard 184) byl zakoupen od společnosti Dow Corning. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) byl zakoupen od společnosti Lonza. Rekombinantní lidský BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) a H2SO4 byly zakoupeny od společnosti R&D Systems. Pryskyřice Fmoc-Rink 4-methylbenzhydrylamin (MBHA) (měřítko 50 mg, substituce 0,52 mmol g-1) a N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorofosfát (HBTU) byly zakoupeny od společnosti MultiSynTech. Chloroform a 1-methyl-2-pyrrolidinon (NMP) byly zakoupeny od společnosti WR Chemicals. VHH protilátka proti BMP7 (Q32c-lab, klon G7) a polyklonální králičí protilátka proti VHH (K1216) byly zakoupeny od společnosti QVQ. Biotinylovaná protilátka proti IL-1β (508301, klon JK1B2, RRID:AB_315512) byla zakoupena od společnosti Biolegend. Biotinylované IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) bylo zakoupeno od společnosti Jackson Immunoresearch. HRP-konjugovaná sekundární kozí protilátka proti králíkovi (P0448) byla zakoupena od společnosti Dako. Biotinylované nanočástice zlata (20 nm) byly zakoupeny od společnosti Cytodiagnostics. Biotinylovaný peptid s aminokyselinovou sekvencí KGLPLGNSH byl zakoupen od společnosti Pepscan. Sukcinimidyl 6-(biotinamido)hexanoát (biotin-LC-NHS) byl zakoupen od společnosti ApexBio. Neutravidin, N-hydroxysukcinimid-desthiobiotin (EZ-Link NHS-desthiobiotin), 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) a sada pro barvení 3,3′-diaminobenzidinem (DAB) byly zakoupeny od společnosti ThermoFisher Scientific. Předaktivované senzory pro aminovou vazbu (G-type easy2spot) byly zakoupeny od společnosti Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penicilin a streptomycin a trypsin-EDTA byly zakoupeny od společnosti Gibco. Reporterový lyzační pufr (E397A), činidlo pro stanovení luciferázy (E1483) a systém QuantiFluor dsDNA byly zakoupeny od společnosti Promega. Buňky C2C12-BRE-Luc laskavě poskytl prof. Daniel B. Rifkin.
Multivalenční analýza neutravidinu
Spektrofotometrická analýza HABA byla použita k analýze počtu biotin-vázajících kapes neutravidinu. Konkrétně se HABA může specificky vázat na (neutr)avidin podobně jako biotin, ale s nižší vazebnou afinitou. Komplex HABA/neutravidin má absorpční pík kolem 500 nm. Nenavázaná HABA má absorpční pík kolem 350 nm. Vytěsnění HABA biotinem lze tedy vyhodnotit měřením absorbance při 350 a 500 nm. Pro stanovení počtu kapes pro vazbu biotinu byl neutravidin nejprve inkubován s přebytkem HABA, takže se vytvořily plně nasycené komplexy HABA/neutravidin. K těmto komplexům byl přidán biotin v molárním poměru neutravidin/biotin 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 a 1:6. Biotin byl přidán k neutravidinu a biotinu. Pro každý poměr neutravidin/biotin bylo stanoveno množství komplexu HABA/neutravidin a volného HABA měřením absorbance při 500, resp. 350 nm pomocí spektrofotometru ND1000 (ThermoFisher scientific). Plošina při 3,2 biotin/neutravidin udávala počet biotinových vazebných kapes, což bylo v souladu se specifikačním listem výrobce (3,1 biotin/neutravidin).
Měření SPRi
Biotinylovaný IL-1B byl imobilizován na senzory easy2spot typu G pomocí kontinuálního průtokového spotteru (Wasatch Microfluidics). Gelové senzory byly použity pro jejich zvýšenou vazebnou kapacitu a účinnější využití evanescentního pole ve srovnání s planárním povrchovým senzorem. Imobilizační reakce byla provedena v 50 mM pufru kyseliny octové (150 µl na místo) s koncentracemi protilátek 5, 2,5, 1,25 a 0,625 µg ml-1. Jako kontrola byla použita BSA v koncentraci 5 µg/ml. Imobilizační pufr (pH 4,6) poskytl spojení protilátek s nejvyšší zachovanou aktivitou, a proto byl použit pro všechny experimenty. Pro snížení nespecifických interakcí byl senzor deaktivován 1% (w/v) BSA v 50 mM acetátovém pufru (pH 4,6) po dobu 7 min a následně 0,2 M ethanolaminem (pH 8,5) po dobu dalších 7 min. SPRi byla provedena pomocí systému MX96 s operačním softwarem SUIT (IBIS). Neutravidin, D-@BMP7, B-@BMP7 a BMP7 byly rozpuštěny v systémovém pufru sestávajícím z PBS s 0,5 % (w/v) BSA a 0,075 % (v/v) Tween80 v koncentraci 250, 100, 100 a 100 nM. Biotin byl rozpuštěn v koncentraci 400 µM v systémovém pufru doplněném 0,1 % (v/v) DMSO. Zpětný tok byl nastaven na 10 µl min-1 v průtokové cele obsahující 12 µl vzorku. Software Sprint byl použit pro sběr dat a referenci z celkem šesti skvrn na podmínku. Data byla následně exportována do programu Matlab R2015a pro další analýzu a kontrolu kvality pomocí vlastních skriptů (k dispozici na vyžádání). Disociační konstanty supramolekulárních komplexů byly stanoveny následujícím způsobem: nejprve byl senzor promyt třemi slepými nástřiky (tj. systémovým pufrem), aby bylo zajištěno pozadí pro interakční signály. Poté byl použit kaskádový přístup ke stanovení afinity mezi složkami komplexu. Za tímto účelem byl senzor inkubován s pufrem, po kterém následoval neutravidin, D-@BMP7 nebo B-@BMP7, BMP7 a nakonec roztok biotinu. Doba asociace kaskádových interakcí byla 30 min, po níž následovala 15 min disociace. Mezi jednotlivými nástřiky byl senzor promyt systémovým pufrem. Doba asociace vytěsňovací interakce s biotinem byla 180 min a byla provedena dvakrát. Kinetika mohla být popsána jednoduchou Langmuirovou interakcí 1:1, kterou lze zachytit pomocí exponenciální rovnice (3).
V této rovnici je Rmax vazebná kapacita ligandu (RU), kon je rychlost asociace (M-1 s-1), koff je rychlost disociace (s-1), c je koncentrace analytu (M) a t je čas od začátku interakce (s). Disociační konstanta Kd je definována jako koff/kon. K analýze afinitních dat pomocí fitování Langmuirovy interakce byl použit software Matlab s vlastními skripty. Stručně řečeno, slepé vzorky byly odečteny a signál byl vynulován k první interakci. Pro určení afinity konkrétní interakce byla nejprve stanovena rychlost koff v disociační fázi. Následně byla stanovena rychlost kon za použití pevného koff. Pro vytěsnění s biotinem byla rychlost koff stanovena v asociační fázi.
Syntéza a charakterizace Dex-TAB
Dextran reagoval s p-nitrofenylchlorformiátem (PNC) za vzniku p-nitrofenylkarbonátových konjugátů, které byly následně ošetřeny sloučeninami obsahujícími primární amin (doplňkový obr. 2). Konjugáty dextran-p-nitrofenylkarbonátu (Dex-PNC) byly syntetizovány následujícím způsobem. V typickém experimentu byl dextran (3,0 g, 56,3 mmol OH skupin) rozpuštěn v DMF (200 ml, obsahující 2,4 g LiCl) při 90 °C v atmosféře dusíku. Po rozpuštění dextranu byla směs ochlazena na 0 °C. Za míchání a udržování teploty 0 °C byl k roztoku po malých dávkách přidán pyridin (1,5 ml, 18,6 mmol) a následně PNC (2,8 g, 13,9 mmol). Reakce se nechala probíhat jednu hodinu a produkt se vysrážel ve studeném ethanolu. Sraženina byla zfiltrována a promyta ethanolem a následně diethyletherem a poté vysušena ve vakuové sušárně. Dextran-tyramin-butylamin (Dex-TA-NH2) byl syntetizován následujícím způsobem. Dex-PNC nejprve reagoval s N-Boc-1,4-diaminobutanem a poté s tyraminem. Ochranná t-butyloxykarbonylová skupina byla odstraněna reakcí s TFA. V typickém experimentu byl Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC skupin) rozpuštěn v 16 ml DMF. N-Boc-1,4-diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) byl přidán za průtoku dusíku a reakce probíhala 15 min. Poté byl přidán tyramin (0,20 g, 1,46 mmol) a reakce probíhala 1 hodinu. Produkt byl vysrážen ve studeném ethanolu, sraženina byla zfiltrována a promyta ethanolem a diethyletherem a poté vysušena ve vakuové sušárně. Dex-TA-NH chráněný Boc (0,85 g, 0,47 mmol) byl rozpuštěn v 10 ml deionizované vody. V atmosféře dusíku byla přidána kyselina trifluoroctová (TFA) (1 ml, 13,06 mmol) a mícháno přes noc. Reakční směs byla neutralizována 2 M roztokem NaOH a přečištěna dialýzou (mezní molekulová hmotnost 1000 Da) proti 150 mM roztoku NaCl po dobu 48 h a deionizované vodě po dobu 24 h a poté izolována lyofilizací. Dex-TA-NH2 byl dále funkcionalizován biotinem reakcí 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 s 20násobným molárním přebytkem biotin-LC-NHS po dobu nejméně 1 h v 0,1 M bikarbonátovém pufru (pH 8,5) (doplňkový obr. 3). Dex-TAB byl poté přečištěn a zahuštěn pomocí spinové filtrační kolony s mezní molekulovou hmotností 3 kDa. Úspěšné syntézy Dex-PNC, Dex-TA-NH2 a Dex-TAB byly potvrzeny pomocí 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) v DMSO-d6 nebo D2O. Počet konjugovaných tyraminových a butylaminových částí na 100 dextranových anhydroglukosových kruhů byl stanoven výpočtem poměrů integrovaných signálů z dextranových (δ 4,0-5,8 ppm) a tyraminových skupin (δ 6,66 a δ 6,98 ppm), resp. dextranových a butylaminových skupin (δ 1,4-1,5 ppm). Počet konjugovaných biotinových částí na 100 dextranových anhydroglukosových kruhů byl stanoven výpočtem poměru integrovaných signálů z tyraminových skupin (δ 6,66 ppm a δ 6,98 ppm) a spojeného 6-aminokaproového spaceru (δ 2,5 ppm).13).
Síťování Dex-TAB a ortogonální postfunkcionalizace
Dex-TAB hydrogelové konstrukty byly připraveny smícháním 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 křenové peroxidázy a 0,05% (w/v) H2O2. Pro ortogonální postfunkcionalizaci byly hydrogely Dex-TAB postupně inkubovány s 1 µM neutravidinu v promývacím pufru, který se skládal z 1% (w/v) BSA v PBS, promyty promývacím pufrem k odstranění nenavázaného neutravidinu, inkubovány s 1 µM biotinylované nebo desthiobiotinylované molekuly zájmu v promývacím pufru a znovu promyty promývacím pufrem k odstranění nenavázaných molekul. Dex-TAB/neutravidin/desthiobiotin konstrukty mohou být následně vystaveny biotinylovaným molekulám zájmu, aby se vytvořil protisměrný biochemický gradient. Pro fluorescenční mikroskopii (EVOS FL), fluorescenční konfokální mikroskopii (Zeiss LSM 510 a Nikon A1+) a obnovu fluorescence po fotobleachingu (FRAP; Zeiss LSM 510) byly mikrogely přímo funkcionalizovány streptavidinem-FITC nebo po výše popsané funkcionalizaci neutravidinem funkcionalizovány biotinem-atto565, biotinem-FITC a/nebo desthiobiotinem-FITC, který byl vyroben vlastními silami spojením desthiobiotinu-NHS s 6-aminofluoresceinem v 1 M bikarbonátovém pufru (pH 8). Křivky FRAP byly získány tak, že se jako funkce času vynesla intenzita fluorescence bělicí skvrny minus pozadí normalizované na průměrnou intenzitu korigovanou na rychlost bělení před bělením, kde rychlost bělení byla určena normalizací intenzity fluorescence vzorku vedle bělicí skvrny normalizované na její průměrnou intenzitu před bělením. Pro charakterizaci posunu desthiobiotinu/biotinu byly hydrogelové konstrukty Dex-TAB postupně funkcionalizovány neutravidinem, promyty PBS, funkcionalizovány desthiobiotinem-FITC, promyty PBS a funkcionalizovány biotinem-atto565, přičemž byly zobrazeny pomocí fluorescenční konfokální mikroskopie. Nakonec byly hydrogely několikrát důkladně promyty PBS, aby se odstranil nenavázaný B-ATTO, a zobrazeny pomocí fluorescenční konfokální mikroskopie, aby se kvantifikovalo relativní množství D-FITC, které bylo nahrazeno B-ATTO. Experiment byl opakován s jinými biotinovými sloučeninami, aby se prokázala univerzálnost tohoto přístupu. Konkrétně byly neutravidinem/D-FITC funkcionalizované hydrogely Dex-TAB inkubovány a průběžně sledovány po dobu 8 dnů v přítomnosti 1 µM biotinu, biotinylovaného peptidu (tj. peptidu B; aminokyselinová sekvence KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), imunoglobulinu G (B-IgG) nebo zlatých nanočástic (B-GNP) v PBS. Vzorky byly před analýzou intenzity D-FITC důkladně promývány PBS po dobu nejméně jednoho dne, aby se odstranily nenavázané části. Biologická funkce supramolekulárně komplexovaného B-HRP byla hodnocena pomocí soupravy pro barvení DAB podle protokolu výrobce. 3D biotinylované hydrogely ve tvaru kosti byly vytvořeny vstřikováním Dex-TAB do polydimethylsiloxanové (PDMS) formy, která byla vyrobena pomocí miniaturní předlohy ve tvaru kosti. Hydrogelové kosti byly homogenním způsobem funkcionalizovány FITC následnou inkubací přes noc s 1 µM neutravidinem, PBS a 1 µM roztokem D-FITC. Po důkladném promytí PBS byly horní části hydrogelů ve tvaru kosti inkubovány s 1 µM B-ATTO pomocí časovaného ponoření a následně promyty PBS k odstranění nenavázaných fluoroforů a analyzovány pomocí fluorescenční mikroskopie. Pro studium dlouhodobé stability supramolekulární komplexace byly dva hydrogely Dex-TAB o rozměrech přibližně 5 × 5 × 5 mm označeny výhradně D-FITC a B-FITC, důkladně promyty PBS a kovalentně spojeny pomocí meziproduktu z původního (tj. neoznačeného) Dex-TA prostřednictvím enzymatického zesíťování tyraminových částí. Kombinované hydrogelové konstrukty byly poté inkubovány v PBS a průběžně zobrazovány pomocí konfokální fluorescenční mikroskopie po dobu 2 týdnů za účelem zkoumání stability desthiobiotinylovaných a biotinylovaných vzorů. Průřezové intenzity všech fluorescenčních snímků byly stanoveny pomocí softwaru ImageJ.
Analýza hydrogelové sítě
Difuzní analýza byla provedena za účelem analýzy vlivu postfunkcionalizace hydrogelových konstruktů Dex-TAB multivalentním neutravidinem na vlastnosti hydrogelové sítě. Za tímto účelem byly kombinovány nedotčené hydrogelové konstrukty Dex-TAB a konstrukty, které byly homogenně postfunkcionalizovány pomocí nadměrného množství neutravidinu, s FITC značeným dextranem s hydrodynamickými poloměry RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) a RH = 27 nm (2000 kDa). Hydrogelové konstrukty ve fluorescenčních roztocích byly poté analyzovány pomocí fluorescenčního konfokálního zobrazování (Zeiss LSM 510) a intenzita fluorescence uvnitř a vně konstruktů byla kvantifikována pomocí softwaru ImageJ. Relativní prostup fluorescenčně značených molekul dextranu do Dex-TAB byl stanoven normalizací intenzity s intenzitou fluorescence mimo hydrogely. Stejný přístup byl použit ke kvantifikaci a porovnání relativní propustnosti 5% (w/v) Dex-TAB pro konvenční protilátky IgG značené FITC a VHH.
Modifikace a charakterizace VHH
Desthiobiotin konjugovaný s maleimidem byl syntetizován reakcí amino-maleimidu a desthiobiotinu-NHS po dobu 2 h v hydrogenuhličitanovém pufru (pH 8). Desthiobiotin-maleimid byl přečištěn pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie na modulu 2545 Quaternary Gradient Module (Waters) z 90 %/10 % voda/acetonitril (0,1 % kyselina trifluoroctová (TFA)) na 100 % acetonitril (0,1 % TFA). Získaný produkt byl charakterizován hmotnostní spektrometrií; MS(ESI): m/z = 336,96 (vypočteno m/z = 337,18 pro C16H24N4O4). Rozpouštědla byla odpařena pomocí rotační vakuové odparky, poté byl desthiobiotin-maleimid resuspendován v miliQ vodě, zmrazen v tekutém dusíku a přes noc lyofilizován. Desthiobiotinylované a biotinylované VHH byly syntetizovány pomocí QVQ BV reakcí nemodifikovaného cysteinu VHH s desthiobiotinem konjugovaným s maleimidem a biotinem konjugovaným s maleimidem. K posouzení afinity vůči BMP7 nemodifikovaných VHH oproti desthiobiotinylovaným (D-@BMP7) a biotinylovaným (B-@BMP7) jsme použili metodu ELISA. Za tímto účelem byla 96jamková destička Maxisorp potažena přes noc při 4 °C 0,5 µg ml-1 lidského BMP7 v PBS. Destičky byly blokovány 4% odstředěným mlékem v PBS a byly přidány různé koncentrace (0-5 µM) VHH v 1% odstředěném mléce. Detekce VHH byla provedena pomocí polyklonální králičí protilátky proti VHH a sekundární kozí protilátky konjugované s HRP proti králíkovi. Přídavek H2O2 spolu s TMB identifikoval množství HRP přeměnou na barevný produkt. K zastavení reakce byl přidán H2SO4. Spektrofotometrická absorpční měření byla provedena při 450 nm pomocí destičkové čtečky (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Křivky dávka-odezva byly získány fitováním logistické funkce na naměřená data pomocí rovnice (4).
Buněčná kultura
C2C12-BRE-Luc buňky byly kultivovány v kultivačním médiu složeném z 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml penicilinu a 100 µg/ml streptomycinu v DMEM. Buňky byly kultivovány při 5 % CO2 při 37 °C a médium bylo vyměňováno 2krát týdně. Když buněčná kultura dosáhla téměř konfluence, byly buňky odděleny pomocí 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA při 37 °C a následně subkultivovány nebo použity pro experimenty. Životaschopnost buněk zapouzdřených v enzymaticky zesíťovaném 5% (w/v) Dex-TAB byla analyzována ihned po zapouzdření (tj. den 0) a po čtyřech a sedmi dnech kultivace in vitro inkubací buněk po dobu 30 minut s 2 µM kalceinem AM (živé) a 4 µM EthD-1 (mrtvé) v PBS a vizualizací označených buněk pomocí fluorescenční mikroskopie. Analýza živých/mrtvých buněk byla rovněž provedena po modifikaci hydrogelů Dex-TAB s buňkami pomocí neutravidinu, D-@BMP7 a B-@BMP7 za použití stejného protokolu postprodukční funkcionalizace, který je popsán v předchozí části metod „Zesíťování Dex-TAB a ortogonální postfunkcionalizace“. Metabolická aktivita buněk byla analyzována barvením buněk pomocí 0,5 g l-1 MTT v kultivačním médiu a následnou vizualizací pomocí mikroskopie v jasném poli. Pro experimenty s indukcí BMP7 byly buňky nasazeny v množství 10 000 buněk cm-2 na plastovou tkáňovou kulturu a kultivovány přes noc. Buňky byly vyhladověny pomocí kultivačního média obsahujícího 0,5 % (v/v) FBS po dobu 12 hodin. Po vyhladovění byly do buněčné kultury přidány prefabrikované hydrogelové konstrukty Dex-TAB/neutravidin, Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidin/B-@BMP7 nebo Dex-TAB/neutravidin/D-@BMP7 ošetřené biotinem, které byly následně vystaveny působení 100 ng ml-1 BMP7 po dobu 10 až 15 h (doplňkový obr. 12). Následně byly buňky lyzovány pomocí reportérového lyzačního pufru a jednoho cyklu zmrazení a rozmrazení. Exprese luciferázy byla stanovena pomocí luciferázového testu podle protokolu výrobce a luminometru (Victor X3, Perkin Elmer). Exprese luciferázy byla normalizována na celkový obsah DNA, který byl kvantifikován pomocí systému QuantiFluor dsDNA podle protokolu výrobce a fluorometru (Victor X3).
Zobrazení údajů a statistika
Spektrofotometrická měření absorpce HABA byla provedena na šesti vzorcích za každé podmínky a uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka. Měření SPRi byla provedena na šesti skvrnách za každé podmínky a uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka (světle podbarvené čáry). Odečty SPRi jednotlivých skvrn byly normalizovány vůči Rmax vazebných křivek neutravidinu, aby se korigovaly rozdíly v hustotě skvrn (doplňkový obr. 1). Kon, koff a Kd supramolekulárních interakcí byly stanoveny z nejméně tří SPRi experimentů a uvedeny jako průměr ± směrodatná odchylka nebo překrytí jednotlivých datových bodů. Měření FRAP fluorescenčně značeného streptavidinu byla provedena na nejméně čtyřech hydrogelových konstrukcích za každé podmínky a uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka normalizovaná na průměrnou intenzitu před vybělením. Měření intenzity fluorescence (konfokální) (včetně časosběrných experimentů) byla provedena na nejméně čtyřech hydrogelových konstruktech za každé podmínky a uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka nebo překrytí jednotlivých datových bodů, vše normalizováno na nejvyšší průměrnou intenzitu. Lineární regresní analýza byla provedena pomocí softwaru OriginPro 2016. Vytěsnění D-FITC biotinylovanými molekulami bylo měřeno pomocí fluorescenční mikroskopie na deseti vzorcích za každé podmínky. Významnost rozdílů byla studována pomocí jednocestné ANOVA s Tukeyho post-hoc testem (data byla normálně rozdělena, jak ukazuje Shapiro-Wilkův test: p > 0,1). Průnik fluorescenčně značených molekul dextranu, VHH a IgG do Dex-TAB byl měřen na čtyřech hydrogelových konstrukcích pro každou podmínku a uváděn jako průměr ± směrodatná odchylka. Významnost rozdílů mezi propustností VHH a IgG byla stanovena pomocí Mannova-Whitneyho testu. Kvantifikace živých/neživých buněk byla provedena na třech hydrogelech s buňkami pro každou podmínku a uvedena jako průměr překrývající jednotlivé datové body. Významnost rozdílů byla stanovena pomocí Kruskal-Wallisova testu ANOVA. Analýza odezvy na dávku byla provedena na třech vzorcích pro každou koncentraci a uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka a překrytí přizpůsobené logistické funkce na základě rovnice (4). Intervaly spolehlivosti křivek odezvy na dávku byly automaticky generovány softwarem pro vykreslování grafů. Relativní indukce buněk C2C12-BRE-Luc byla měřena na třech vzorcích in vitro pro každou podmínku a uváděna jako průměr ± směrodatná odchylka. Významnost rozdílů byla stanovena pomocí Kruskal-Wallisova testu ANOVA.
Schémata
Všechny grafy byly vytvořeny pomocí softwaru OriginPro 2016. Všechna schémata byla vytvořena pomocí softwaru ChemDraw Professional 16.0 a softwaru CorelDRAW X7.
Souhrn zpráv
Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici v Souhrnu zpráv o výzkumu v časopise Nature, který je propojen s tímto článkem.
.