Buněčná kultura
Buňky lidské embryonální ledviny 293FT (HEK293) byly pěstovány v DMEM doplněném 10% FBS a 1% penicilinem/streptomycinem (100 iU na ml; 100 μg na ml). Buněčné linie nebyly ověřeny. Buňky byly prosté mykoplazmy. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 při 37 °C. Pro stabilní buněčné linie byly transfekované buňky selektovány v přítomnosti puromycinu (3 μg na ml). Pro studie tranzientní transfekce byly buňky HEK293 nasazeny do 6jamkových destiček v přítomnosti vektorů pomocí přípravku Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Buněčné linie podocytů byly založeny z lidské moči42 a genotypizace APOL1 byla provedena po získání informovaného souhlasu podle výzkumných protokolů (94-DK-0127, 94-DK-0133) předem schválených Institucionální revizní komisí NIDDK. Případ A je G0/G0 muž s FSGS, případ B je G0/G0 muž s FSGS asociovanou s HIV, případ C je G0/G0 muž s FSGS (HP55-345O-1), případ D je G1/G2 muž s FSGS a případ E je G1/G2 muž s FSGS asociovanou s HIV. Buňky byly pěstovány v RPMI1640 doplněném 10% FBS, ITS a 1% penicilinem/streptomycinem (100 iU na ml; 100 μg na ml). Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 při 33 °C a diferencovány při 37 °C po dobu 7-10 dnů. Buněčné linie nebyly ověřovány. Buňky byly prosté mykoplazmy. Před odběrem buněčných lyzátů byly buňky ošetřeny 103 U na ml IFNα (Abcam) po dobu 24-72 h a 100 mM kalikulinem A (LC Laboratories) po dobu 30 min. Pro experimenty s inhibicí PKR byly buňky ošetřeny 1 μM imidazolo-oxindolového inhibitoru PKR C16 (Sigma Aldrich) po dobu 1 h43.
Lidská tkáň
Deidentifikované tkáně z biopsie lidské ledviny byly získány od Dr. Preeti Chandra, University of Maryland. Výzkum byl předem schválen institucionálními revizními komisemi na University of Maryland a NIDDK, NIH.
Informace o plazmidech
Expresní vektor APOL1 G0 se skládá z lidské cDNA APOL1 odvozené od promotoru CMV (NM_001136540: 298-1453). Pro APOL1 G1 (rs73885319 A→G a/nebo rs60910145 T→G) a G2 (rs71785313 del) byla provedena mutageneze řízená místem. Pro expresní vektor APOL1 bez exprese proteinu byl vytvořen vložením stop kodonu a frameshift sekvence (TAATAGATGA) za 138. kodon. U vektoru mutací sekundární struktury byly původní sekvence změněny osmi synonymními změnami (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G a 1242T→C). U stabilního dsRNA vektoru G0 jsou původní sekvence změněny 5 mutacemi v 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Pro doprovodnou RNA kolem alel APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453) byl jako podkladový vektor použit pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript). Schémata vektorových map jsou na doplňkovém obrázku 1.
Imnoblotování
Buňky byly lyzovány v pufru RIPA obsahujícím koktejl inhibitorů proteáz a inhibitorů fosfatáz. Lyzáty byly separovány elektroforézou v SDS-polyakrylamidovém gelu a proteiny byly podrobeny western blotu a blokovány po dobu 30 min v blokovacím pufru Odyssey (LI-COR). Bloty byly inkubovány s primárními protilátkami proti APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), fosfo-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), fosfo-GCN (Abcam ab75836) a GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) a p62 (Cell signaling #5114). Bloty byly inkubovány s protilátkou proti králíkům značenou barvivem (LI-COR). Všechny bloty byly zobrazeny pomocí infračerveného skeneru Odyssey (LI-COR). Nezpracované snímky gelu jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 13.
Reverzní transkriptázová PCR a kvantitativní PCR v reálném čase
Buňky nebo celková ledvina byly odebrány do činidla TRIzol a byla izolována celková RNA. Před syntézou cDNA pomocí oligo (dT) byla celková RNA ošetřena DNázou. Pro syntézu cDNA pomocí reverzní transkriptázy Superscript II byl použit jeden 5μg alikvot RNA. Vzorky byly analyzovány pomocí PCR (RT) nebo kvantitativní RT-PCR (qRT-PCR) s použitím master mixu Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). Relativní exprese v každém vzorku byla vypočtena jako poměr (specifický gen attamoles na β-aktin). Páry primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.
Test syntézy proteinů
Transfekované buňky HEK293 nebo lidské buněčné linie podocytů byly pěstovány v 96jamkových destičkách a byly ošetřeny 103 U na ml IFNα (Abcam) pro kvantifikaci nebo komůrkovým sklíčkem pro vizualizaci. Test syntézy (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, katalogové číslo. C10289, Invitrogen) byl proveden podle pokynů výrobce. Nukleární protibarvení bylo provedeno pomocí Hoechstu. Jako negativní kontrola pro tento test byly použity buňky HEK293 bez vektoru ošetřené 1 μM puromycinu (InvivoGen, San Diego, CA) s pozadím nastaveným na 0 % intenzity signálu. Buňky HEK293 s vektorem APOL1 G0 byly nastaveny jako 100 % intenzita signálu.
Buňková životaschopnost
Buňkové testy životaschopnosti byly provedeny pomocí testů ATP. Ke kvantifikaci ATP generovaného metabolicky aktivními buňkami jsme použili luminiscenční test životaschopnosti buněk CellTiter-Glo (Promega) podle pokynů výrobce. Buňky byly kultivovány ve sterilních 96jamkových destičkách v přítomnosti 103 U na ml IFNα (Abcam) po dobu 72 h a poté bylo přidáno 100 μl činidla CellTiter-Glo k lyzi buněk. Po 10minutové inkubaci při pokojové teplotě byla luminiscence detekována pomocí luminometru s integrační dobou 1 s na jamku. Signály luminiscence buněk byly normalizovány počtem buněk.
Test rychlosti proliferace buněk
Buňky byly nasazeny v množství 5,0 × 103 buněk na 150 µl kultivačního média do každé jamky 96jamkové destičky a byl přidán inhibitor PKR C16 v uvedené koncentraci. Po 0, 24, 48 a 50 µl byl změřen počet buněk pomocí soupravy Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Míra spotřeby kyslíku v kultivovaných lidských podocytech
K hodnocení míry spotřeby kyslíku v buňkách (OCR) byl použit analyzátor extracelulárního toku XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) podle pokynů společnosti. Stručně řečeno, kultivované lidské podocyty byly nasazeny do jamkových destiček XF24 zakoupených od společnosti Seahorse Bioscience v hustotě 2,0 × 104 buněk na jamku (plocha povrchu 0,33 cm2) ve 100 μl kultivačního média a byly inkubovány přes noc při 37 °C. Následující den byly buňky ošetřeny IFNα (1 × 103 U na ml) s/bez inhibitoru PKR C16 (100 nM) po dobu 72 h, poté následovalo 24 h ošetření na jamkových destičkách XF24. Před měřením OCR byla experimentální destička XF24 obsahující buňky promyta testovacím médiem DMEM bez bikarbonátu (Seahorse Bioscience) obsahujícím 25 mM glukózu a 1 mM pyruvát sodný a buňky byly předinkubovány po dobu 1 h při 37 °C bez přívodu CO2 v 625 μl testovacího média. Před měřením OCR byl přístroj XF24 kalibrován pomocí kalibrační kazety podle pokynů společnosti. Po kalibraci byla provedena základní měření OCR na zkušební destičce po dobu 4 min.
RNA-imunoprecipitace (RNA-IP)
Stabilní buňky HEK293 nesoucí variantu APOL1-G0, G1 nebo G2 byly ošetřeny následujícím způsobem: (a) 103 U na ml IFNα po dobu 24-72 h a 100 μM kyseliny palmitové (Sigma) po dobu 2 h, nebo (b) 100 mM 103 U na ml IFNα po dobu 24-72 h a kalikulinem A po dobu 30 min. Kyselina palmitová se váže přímo na PKR a inhibuje vazbu dsRNA na PKR44 , a proto byla kyselina palmitová použita jako negativní kontrola. Buňky byly ozářeny UV světlem o intenzitě 200 mJ na cm2. Deset procent každého buněčného lyzátu bylo uloženo jako vstupní vzorek pro RT-qPCR. Imunoprecipitace byla provedena pomocí soupravy pro imunoprecipitaci proteinů vázajících RNA (EMD Millipore) na základě předchozí zprávy s použitím PKR45. Pro RNA-IP byla použita protilátka fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) nebo kontrolní králičí IgG. RNA byla extrahována pomocí TRIzolu, následovalo ošetření DNázou a srážení etanolem. cDNA byly generovány pomocí náhodných hexamerových primerů a SuperScript Reverse transcriptase II. Vzorky byly analyzovány pomocí PCR (RT) nebo qRT-PCR s použitím master mixu Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). Obohacení bylo vypočteno jako poměr (IP vzorek na vstupní vzorek). Páry primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. V negativních kontrolách, buňkách ošetřených mockem s IP protilátkou fosfo-PKR a buňkách ošetřených interferonem-α + kalikulinem A s kontrolní IP králičího IgG nebyl zjištěn žádný signál SYBR
Exprese a purifikace proteinu PKR
Rekombinantní PKR byl purifikován, jak bylo uvedeno dříve46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) byl transformován do buněk BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Buňky byly kultivovány v LB médiu při 37 °C do A600 nm ~ 0,7 a exprese proteinu byla indukována 1 mM IPTG po dobu 3 h při ~ 20 °C. Pro purifikaci PKR byly buňky resuspendovány v pufru A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoethanol, 10 % glycerol) doplněném koktejlem inhibitorů proteáz (Sigma). Buňky byly lyzovány inkubací s 5 mg lysozymu na ml po dobu 30 min a následnou sonikací po dobu 3 min. Lyzát byl centrifugován 20 min při 20 000 g. Supernatant byl nanesen na heparinovou sefarozovou kolonu (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) ekvilibrovanou v pufru A a PKR byl eluován pomocí gradientu NaCl. Frakce s píkem byly dvakrát zředěny pufrem A a naneseny na poly(I:C) agarosovou kolonu (Amersham) ekvilibrovanou v pufru A. PKR byl eluován při 1,1 M NaCl, koncentrován na ~10 mg na ml a uložen při -80 °C.
Aktivační test PKR
Aktivační testy PKR byly provedeny podle dřívějších zpráv47. PKR byla defosforylována λ-proteinfosfatázou po dobu 1 h při 30 °C a poté inhibována 2 mM ortovanadanem sodným. PKR (4 μM) byl inkubován s dlouhou RNA (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng na ml)/krátkou RNA (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng na ml)/poly(I:C) 20 μg na ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT a 100 μM ATP (Ambion). Reakční směsi byly inkubovány při 30 °C po uvedenou dobu a ochlazeny 1× SDS nakládacím pufrem. Fosforylované PKR byly detekovány pomocí protilátky fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
Příprava RNA pro experimenty s migrací na gelu a SHAPE
Truncated APOL1 RNAs with various 3′ structure cassettes were prepared by in vitro transcription using the MegaShortScript kit (ThermoFisher) according to manufacturers‘ recommendations. Transkripční templáty byly vytvořeny ve dvou semi-nested PCR reakcích z plazmidů obsahujících alely APOL1 (G0, G1, G2) nebo jejich mutantní varianty (mG0, mG1, mG2). Pro první reakci byly použity přímé a reverzní primery k přidání 5′ promotoru T7 a 45 nt 3′ SC ke zkráceným sekvencím APOL1 (doplňková tabulka 1). Tento druhý prvek byl zaveden, aby poskytl hybridizační místo pro reverzní transkripci pro SHAPE. Část každé reakce byla reamplifikována pomocí původního dopředného primeru a kratšího reverzního primeru, aby byly konečné transkripční templáty homogennější. Transkripční reakce byly ošetřeny Turbo DNázou I po dobu 5 min při 37 °C, inkubovány při 85 °C po dobu 2 min a frakcionovány na denaturačním gelu (5 % polyakrylamid-19:1, 1× TBE, 7 M močovina) při konstantní teplotě (45 °C, max. 30 W). Požadované produkty RNA byly detekovány pomocí UV stínování, vyříznuty z gelu, elektroeluovány při 200 V po dobu 2 h při 4 °C, vysráženy ethanolem a před použitím uloženy při -20 °C v 10 mM Tris, pH 7,0. Zásobní roztoky RNA byly kvantifikovány spektrofotometricky.
Gelový migrační test
Každá zkrácená RNA APOL1 byla zředěna na 1 μM ve 20 μl RNA renaturačního pufru (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% glycerol (w per v)), denaturována zahříváním na 85 °C po dobu 2 min a renaturována pomalým ochlazováním (0,1 °C za s) na 25 °C. Poté byl přidán MgCl2 na konečnou koncentraci 0, 1 nebo 3 mM a směsi byly inkubovány dalších 30 min při 37 °C, aby se podpořila tvorba Mg-dependentních a/nebo jiných terciárních interakcí RNA. Konformery RNA byly stabilizovány bleskovým ochlazením na 4 °C, poté byly frakcionovány na 5 % nedenaturačním polyakrylamidovém gelu (5 % akrylamid, 19:1) po dobu 16-18 h při 4 °C. Gel i pracovní pufr obsahovaly 1× TBE a 1 mM MgCl2 a gely byly před zatížením připravovány po dobu ~ 1 hodiny. Gely byly vystaveny působení barviva SybrGreen (ThermoFisher) v souladu s pokyny výrobce a migrační pozice konformerů RNA byly detekovány pomocí zobrazovacího zařízení Typhoon Trio+ s variabilním režimem (GE Healthcare).
SHAPE a generování sekundárních strukturních modelů RNA
Experimentální metody SHAPE byly popsány již dříve48,49 . Stručně řečeno, zkrácená RNA APOL1 s SC RNA byla složena stejně jako v testu migrace na gelu s tím rozdílem, že objem směsi byl 150 μl, konečná koncentrace MgCl2 byla 1 mM a glycerol byl vyloučen. Roztoky RNA byly rozděleny na kontrolní (1M7-) a experimentální (1M7+) alikvoty (po 72 μl) a bylo přidáno 8 μl DMSO, resp. 8 μl 30 mM 1M7 v DMSO. Modifikační reakce byly inkubovány při 37 °C po dobu 5 minut, ochlazeny na 4 °C, vysráženy ethanolem a znovu suspendovány v 10 μl vody bez nukleázy. Upravené RNA byly reverzně transkribovány z různě značených primerů komplementárních k 3′ strukturní kazetě (1M7- primer, Cy5,5; 1M7+ primer, Cy5) a hydrolyzovány alkalickou úpravou. Výsledné knihovny cDNA byly vysráženy ethanolem a znovu rozpuštěny v Sample Loading Solution (Genome Lab), poté byly spojeny s ddA a ddG sekvenačními žebříčky značenými pomocí WellRED D2 (Beckman Coulter), respektive IRDye 800RS (LI-COR). Kombinované vzorky byly frakcionovány kapilární elektroforézou (CE) pomocí genetického analyzátoru Beckman Coulter CEQ 8000. Pro každou RNA byly z elektroforeogramů CE vygenerovány profily reaktivity pomocí softwaru SHAPEfinder50 a poté zadány do softwaru RNAstructure verze 5.751,52 spolu se sekvencemi RNA pro vytvoření sekundárních strukturních modelů. Výchozí parametry slope (1,8 kcal na mol) a intercept (-0,6 kcal na mol) byly použity k transformaci hodnot reaktivity na pseudoenergetická omezení, která modulují algoritmus skládání RNA. RNAstructure automaticky vygeneruje několik strukturních modelů, které nejlépe odpovídají profilům reaktivity odvozeným ze SHAPE, a seřadí je podle Gibbsovy volné energie. Takto vytvořené strukturní modely s nejnižší energií jsou znázorněny na obr. 3a, b a na doplňkovém obr. 4.
In vitro knock down
Provedli jsme knock down experimenty s použitím podmíněně imortalizovaných lidských buněčných linií vytvořených z lidské moči42. Tyto buňky jsme transfekovali buď Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher), nebo předem navrženou stealth siRNA proti APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) pomocí Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo bylo ko-transfekováno a použito pro kontrolu transfekce. Účinnost knock down byla 52,4-75,4 % (hladiny RNA) nebo 31,1 % (hladiny proteinů).
Myši
Použili jsme transgenní myši s lidským lokusem genu APOL1 (myši BAC-APOL1), vytvořené pomocí bakteriálního umělého chromozomu, který obsahuje lokus pro APLOL-G0 nebo APOL1-G1 nebo APOL1-G2. Z lidského klonu BAC (ENST00000397278, který odpovídá NM_003661) byla izolována a subklonována lidská DNA o velikosti ~47 kb zahrnující pouze gen APOL1 s 5′ a 3′ doprovodnými oblastmi (včetně exonů 1 a 2 genu APOL2 a 3′ oblasti zahrnující exony 39-41 části genu MYH9). Jednotlivé subklony G0, G1 a G2 BAC byly injektovány do embryí 129SvJ/B6N F1 a zakladatelé byli následně zpětně zkříženi s 129SvJ. Subklon byl sekvenován, aby bylo zajištěno, že odpovídá referenční sekvenci genomu z NCBI a Ensembl. Jedinými rozdíly byly polymorfismy v intronických oblastech. Při pokusech s podmíněnými transgenními myšmi jsme použili podocytově specifické transgenní myši se zkrácenou RNA APOL1 na pozadí FVB. Tyto myši jsme vytvořili pomocí podmíněného transgenního systému s použitím zkrácené RNA sekvence řízené promotorem nefrinu (NPHS1) (NM_001136540, 1031-1453). Vytvořili jsme dva kmeny: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA s rs73885319 A a rs60910145 G a NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA s rs73885319 G a rs60910145 G.
Izolace glomerulů
Myším BAC/APOL1 (ve věku 8 až 12 týdnů) byl podáván IFNγ (106 U na kg tělesné hmotnosti IP) denně po dobu 3 dnů před odběrem vzorků tkání. Protokol izolace glomerulů byl podrobně popsán53. Myši byly stručně anestetizovány intraperitoneální injekcí Avertinu (2,2,2-tribromoethyl a terciární amylalkohol; 17 μl na g) a perfundovány 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04) zředěnými ve 20 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku přes srdce. Ledviny byly tráveny kolagenázou A a DNázou I při 37 °C po dobu 10 minut. Kolagenázou natrávená tkáň byla jemně protlačena přes 100 μm buněčné sítko a promyta HBSS. Vzorky byly promyty a resuspendovány pomocí magnetického stojanu. Glomeruly byly odebrány a inkubovány v RPMI1640 doplněném 10% FBS, ITS, 1% penicilinem/streptomycinem (100 iU na ml; 100 μg na ml) a 100 mM kalikulinem A (LC Laboratories) po dobu 30 min a použity pro Western blot analýzu.
Immunohistochemie (myší vzorky)
Myším BAC/APOL1 (ve věku 8 až 12 týdnů) byl podáván IFNγ (106 U na kg tělesné hmotnosti IP) denně po dobu 3 dnů. Myši byly před odběrem vzorků tkání perfundovány 100 mM kalikulinem A obsaženým v PBS. Poté byly ledviny nakrájeny na malé kousky a inkubovány v RPMI1640 doplněném 10 % FBS, ITS a 100 mM kalikulinem A po dobu 30 minut. Poté byly tkáně okamžitě fixovány 10% pufrovaným formalínem. Myším BAC/APOL1 (ve věku 8 až 12 týdnů) byl podáván IFNγ (106 U na kg tělesné hmotnosti IP) denně po dobu 3 dnů. Myším NPHS1-APOL1-ΔRNA byl podáván IFNγ (106 U na kg tělesné hmotnosti IP) denně po dobu 3 dnů před odběrem vzorků tkání. Použili jsme tkáňové řezy fixované v parafínu o velikosti 4-5 μm. Řezy byly deparafinovány/sušeny a antigen byl získán zahřátím v citrátem pufrovaném médiu po dobu 5 minut v mikrovlnné troubě. Tkáně byly blokovány 1% BSA a 0,1% saponinem. Řezy byly inkubovány s primárními protilátkami, včetně následujících: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) a podokalyxin (R&D Systems AF1556). Pro imunofluorescenci jsme použili sekundární protilátky Alexa Fluor (ThermoFisher) a vizualizovali pomocí konfokální mikroskopie. Pro barvení ABC byla použita sekundární protilátka konjugovaná s biotinem a Avidin-HRP (Vector). Pro vizualizaci byla použita sada DAB (Vector). Při pokusech na myších byly myši (staré 8 až 12 týdnů) léčeny IFNγ (106 U na kg tělesné hmotnosti IP), který byl podáván 3 dny před odběrem vzorků tkání. Pro kvantifikaci signálu byl u pokusů na myších detekován signál fosfo-PKR podocytů pomocí protibarvení pro WT1.
Immunohistochemie (lidské vzorky)
Tato studie byla předem schválena IRB na University of Maryland a NIDDK, NIH. Základní charakteristiky případů jsou uvedeny na doplňkovém obr. 5b. Barvení bylo provedeno pomocí 5 μm silných řezů tkání fixovaných formalínem a zalitých do parafínu. Po deparafinizaci byla provedena tepelně indukovaná retrievalce antigenu po dobu 20 min v pufru o pH 6,0 pomocí tlakového vařiče (Pascal, Agilent Technologies Dako). Řezy byly inkubovány s primárními protilátkami včetně následujících: fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) a WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Použili jsme sekundární protilátky Alexa Fluor (ThermoFisher) a vizualizovali pomocí konfokální mikroskopie.
Immunohistochemie a zobrazování živých buněk
Buňky byly inkubovány s 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) a 200 nM TMRE (Invitrogen) po dobu 20 min před detekcí signálu, po ošetření 20 μM FCCP a vizualizovány pomocí konfokální mikroskopie.
Kvantifikace signálu mikroskopických snímků
U lidské tkáně jsme počítali glomeruly bez globální sklerózy (6 případů bez rizikového genotypu: 5, 6, 7, 10, 5 a 9 glomerulů pro každý případ; 6 případů s rizikovým genotypem: 13, 6, 4, 5, 10 a 5 glomerulů). U myších a lidských tkání byl výkon laseru upraven tak, aby nedošlo k nasycení maximálního signálu. Zpracování obrazu a kolokalizační analýzy byly provedeny pomocí softwaru Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Německo)54. Vážený kolokalizační koeficient a průměrná intenzita u WT-1 pozitivních buněk byly vypočteny, jak bylo uvedeno dříve54. Pro průměrnou intenzitu jsme standardizovali intenzitu signálu podocytů pomocí signálů z WT1 negativních intraglomerulárních buněk pro každý glomerulus. Hodnoty byly relativní skóre s intenzitou signálu APOL1-G0 jako 100 %. Kvantifikace byla provedena zaslepeným způsobem.
Hybridizace in situ
Detekce chromogenů in situ byla provedena na tkáňových řezech z myších bloků fixovaných formalínem a zalitých parafínem (FFPE) pomocí hybridizace in situ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Stručně řečeno, tkáňové řezy FFPE o velikosti 5 μm byly deparafinizovány, 15 minut vařeny s činidlem pro předběžnou úpravu a poté 30 minut tráveny proteázou při 40 °C, následovala hybridizace po dobu 2 hodin při 40 °C se sondou-Hs-APOL1-01 (katalogové číslo 439871, Advanced Cell Diagnostics). Kromě toho byly pro pozitivní a negativní kontrolu použity sondy Probe-Mm-PPIB (katalogové číslo 313911) a Probe-DapB (katalogové číslo 310043). Detekce specifických vazebných míst sondy byla vizualizována pomocí sady RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (katalogové číslo 310035).
Model proteinurie myší
Všechny experimenty byly provedeny v souladu s Příručkou pro péči o laboratorní zvířata a jejich použití Národního institutu zdraví a byly předem schváleny Výborem pro péči o zvířata a jejich použití NIDDK (návrh studie na zvířatech (K097-KDB-14)). Použili jsme myší samce i samice ve věku 8-15 týdnů. Myši v každém experimentu odpovídaly pohlaví, věku a tělesné hmotnosti. Randomizace byla provedena s ohledem na tělesnou hmotnost. Velikost vzorků pro experimenty byla stanovena bez formálních výpočtů síly. Kritériem pro vyloučení byl úbytek hmotnosti větší než 20 % během experimentálního období. Pro indukci proteinurie byly myším (ve věku 8 až 12 týdnů) aplikovány bFGF a aminonukleosid puromycinu, jak bylo popsáno dříve30. U myší kmene NPHS1-APOL1-deltaRNA byl puromycin aminonukleosid (Sigma-Aldrich) aplikován subkutánně v den 0 (200 mg na kg tělesné hmotnosti) a bFGF (Kaken Pharmaceutical) byl aplikován intravenózně ve dnech 0 a 2 (5 μg na zvíře). Pro experimenty s inhibitory PKR byl podáván inhibitor PKR C16 (10 μg na kg IP) denně od 0. do 1055. dne. U myší kmene BAC-APOL1 byl interferon γ (Prospec) aplikován v den -1 a 1 (106 U na kg tělesné hmotnosti), puromycin aminonukleosid byl aplikován subkutánně v den 0 (300 mg na kg tělesné hmotnosti) a bFGF (Kaken Pharmaceutical) byl aplikován intravenózně v den 0 a 2 (5 μg na zvíře). Při pokusech s inhibitory PKR byl denně od 0. do 1055. dne podáván inhibitor PKR C16 (10 μg na kg IP).
Měření močového albuminu a kreatininu
Hladinu močového albuminu jsme stanovili metodou ELISA pomocí soupravy ELISA pro myší mikroalbuminurii (Exocell). Koncentraci kreatininu v moči jsme měřili pomocí soupravy pro stanovení kreatininu (Exocell). Všechna měření byla provedena duplicitně. Albuminurii jsme stanovili jako poměr močového albuminu a kreatininu. Všechny postupy byly provedeny v souladu s protokoly výrobců. Vyšetřovatelé nebyli zaslepeni ohledně rozdělení do skupin, ale byli zaslepeni při hodnocení výsledků.
Statistická analýza
Data z nejméně tří jednotlivých experimentů byla analyzována a prezentována jako bodový graf a průměr. Metody statistické analýzy byly zapsány v legendách jednotlivých obrázků. Neprováděli jsme úpravu pro vícenásobná srovnání. Hodnoty P < 0,05 byly považovány za statisticky významné
.