Når du tror, at du har fundet det perfekte fiksationsmiddel til dit væv, er der noget andet at overveje – dit fiksationsmiddel har måske lige maskeret alle de antigenpladser, som dit dejlige nye antistof skulle binde til!
Har du lige maskeret dit antigen?
Som jeg nævnte i en af mine tidligere artikler, skaber den fiksationsteknik, du har valgt, normalt tværbindinger i proteinerne; dette er en af de måder, hvorpå vævet stabiliseres. Dette kan ændre proteinets biokemi, således at det pågældende antigen maskeres og ikke længere vil blive genkendt af dit primære antistof.
Bekymr dig ikke – der er hjælp at hente!
Antigenmaskering kan ikke kun forårsages af tværbinding af aminosyrerne inden for epitopen, men også af tværbinding af ikke-relaterede peptider på eller i nærheden af en epitop, ændring af epitopens konformation eller ændring af antigenets elektrostatiske ladning. Da antigen-antistofgenkendelse er afhængig af proteinstrukturen, er det vigtigt at forsøge at genskabe den naturlige 3D-struktur. Bare rolig- der findes en række teknikker til at komme forbi dette.
Fjern din maske!
Nogle antistoffer kræver ikke nogen form for afmaskering, men hvis dit gør, skal du ikke gå i panik- det er kun en kort tilføjelse til din sædvanlige protokol. Udtrykket antigenretrieval henviser til enhver teknik, hvor maskering af en epitop ophæves, og bindingen mellem epitop og antistof genoprettes. Hvilken type antigenretrieval der anvendes afhænger af mange variabler, herunder målantigenet, det anvendte antistof, vævstypen og den metode til fiksering, der anvendes til at bevare vævet. Hvis du f.eks. bruger et polyklonalt antistof, som genkender flere epitoper, er det mindre sandsynligt, at det vil kræve antigenretrieval, men det er også sandsynligt, at der vil være lidt ekstra baggrund. Hvis du har brugt en fikseringsteknik som f.eks. ethanol, anbefales antigenretrieval ikke, da fikseringen måske ikke er stærk nok til at håndtere retrievalforholdene.
Varme eller enzymer – du vælger
Der findes flere teknikker til at genoprette immunoreaktiviteten af en epitop, og disse falder generelt i to hovedkategorier; (a) enzyminduceret antigenretrieval og (b) varmeinduceret antigenretrieval. Inden for hver kategori er der også en række forskellige måder at foretage genfinding på.
Enzyminducerede metoder
I de enzyminducerede metoder kan enzymer, herunder proteinase K, trypsin og pepsin, anvendes til at genoprette et antistofs binding til dets epitop. Virkningsmekanismen menes at være spaltning af peptider, der muligvis skjuler epitopen. De vigtigste enzyminducerede metoder, som kræver en inkubation på 10-20 minutter ved 37?C, er:
- Proteinase K (20 g/ml i TE-buffer, pH 8)
- Trypsin (0,5 % i dH20)
- Pepsin (0,1 % i 10 mM HCl)
- Pronase (0,5 eller 0.1% i dH20)
- Protease (0,5% i dH20)
Afhængigt af hvilken metode du vælger, skal hver enkelt metode optimeres til forskellige vævstyper og antistoffer, men hver af disse metoder slot i før blokering og efter afvoksningstrinene. Ulemperne ved disse metoder er den lave succesrate for genoprettelse af immunoreaktivitet og muligheden for at ødelægge både vævsmorfologi og det pågældende antigen.
Hvis du finder den enzyminducerede metode lidt for hård, eller at den simpelthen ikke virker for dig, kan du prøve den varmeinducerede metode. Denne metode menes at kunne vende nogle krydsforbindelser og giver mulighed for at genoprette epitopets sekundære eller tertiære struktur. Det er i det væsentlige en re-naturering af strukturen af faste proteiner gennem en række konformationsændringer.
Varmeinducerede metoder
Dette kan omfatte den mulige hydrolyse (opbrydning) af formalininducerede tværbindinger, hvor hele processen drives af termisk energi fra varmekilden. Ligesom de enzyminducerede metoder kræver de varmeinducerede metoder optimering. Disse metoder, som kræver 10-40 minutter i en dampovn, mikrobølgeovn (intervaller på fem minutter) eller vandbad ved 95-100?C efterfulgt af 20 minutters afkøling ved stuetemperatur, er:
- Citratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citrat-EDTA-buffer (10 mM natriumcitrat, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citrat-EDTA-buffer (10 mM natriumcitrat, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6).05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycin-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
Generelt er de varmeinducerede metoder mere udbredte, sandsynligvis fordi de er mere vellykkede. Hvis man først lige er begyndt med antigenretrieval, vil et godt sted at starte være den gennemprøvede metode med citratbufferretrieval. Hvis den ikke virker, har du selvfølgelig masser at prøve bagefter.
Har dette hjulpet dig? Så del gerne med dit netværk.