Właśnie kiedy myślisz, że znalazłeś idealny utrwalacz dla swojej tkanki, jest coś innego do rozważenia – twój utrwalacz mógł właśnie zamaskować wszystkie miejsca antygenowe, do których twoje piękne nowe przeciwciało miało się związać!
Czy właśnie zamaskowałeś swój antygen?
Jak wspomniałem w jednym z moich poprzednich artykułów, technika utrwalania, którą wybrałeś zazwyczaj tworzy wiązania krzyżowe w białkach; jest to jeden ze sposobów, w jaki tkanka jest stabilizowana. Może to zmienić biochemię białka w taki sposób, że antygen zainteresowania jest maskowany i nie będzie już rozpoznawany przez podstawowe przeciwciało.
Nie martw się – pomoc jest w zasięgu ręki!
Maskowanie antygenu może być spowodowane nie tylko przez sieciowanie aminokwasów w obrębie epitopu, ale również przez sieciowanie niezwiązanych peptydów przy lub w pobliżu epitopu, zmianę konformacji epitopu lub zmianę ładunku elektrostatycznego antygenu. Ponieważ rozpoznawanie antygen-przeciwciało zależy od struktury białka, ważne jest, aby spróbować przywrócić naturalną trójwymiarową strukturę. Nie martw się – istnieje wiele technik pozwalających ominąć ten problem.
Zdejmij swoją maskę!
Niektóre przeciwciała nie wymagają żadnego rodzaju demaskowania, ale jeśli Twoje wymaga, nie panikuj – to tylko krótki dodatek do zwykłego protokołu. Termin odzyskiwanie antygenu odnosi się do każdej techniki, w której maskowanie epitopu jest odwrócone i przywracane jest wiązanie epitop-przeciwciało. Rodzaj metody odzyskiwania antygenu zależy od wielu zmiennych, takich jak antygen docelowy, stosowane przeciwciało, typ tkanki i metoda utrwalania stosowana w celu zachowania tkanki. Na przykład, jeśli używa się przeciwciała poliklonalnego, które rozpoznaje wiele epitopów, jest mniej prawdopodobne, że będzie ono wymagało pobrania antygenu, ale prawdopodobnie będzie też miało nieco dodatkowe tło. Jeśli użyto techniki utrwalania, takiej jak etanol, to pobieranie antygenu nie jest zalecane, ponieważ utrwalenie może nie być wystarczająco silne, aby poradzić sobie z warunkami pobierania.
Ciepło lub enzymy – Ty wybierasz
Istnieje wiele technik przywracania immunoreaktywności epitopu i generalnie dzielą się one na dwie główne kategorie; (a) pobieranie antygenu indukowane enzymami i (b) pobieranie antygenu indukowane ciepłem. Ponadto, w ramach każdej kategorii istnieje wiele różnych sposobów odzyskiwania.
Metody indukowane enzymami
W metodach indukowanych enzymami, enzymy, w tym Proteinaza K, Trypsyna i Pepsyna mogą być używane do przywrócenia wiązania przeciwciała z jego epitopem. Uważa się, że mechanizm działania polega na rozszczepieniu peptydów, które mogą maskować epitop. Główne metody indukowane enzymami, które wymagają 10-20 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C, to:
- Proteinaza K (20 g/ml w buforze TE, pH 8)
- Trypsyna (0,5% w dH20)
- Pepsyna (0,1% w 10 mM HCl)
- Pronaza (0,5 lub 0.1% w dH20)
- Proteaza (0,5% w dH20)
Zależnie od wybranej metody, każda z nich musi być zoptymalizowana dla różnych typów tkanek i przeciwciał, ale każda z tych metod stanowi szczelinę przed blokowaniem i po etapie odparafinowania. Wadą tych metod jest niski wskaźnik sukcesu w przywracaniu immunoreaktywności i potencjał niszczenia zarówno morfologii tkanki, jak i antygenu zainteresowania.
Jeśli znajdziesz sposób indukowany enzymami trochę zbyt ostry, lub że po prostu nie działa dla ciebie, to możesz spróbować metody indukowanej ciepłem. Uważa się, że ta metoda odwraca niektóre wiązania krzyżowe i pozwala na przywrócenie drugorzędowej lub trzeciorzędowej struktury epitopu. Jest to w istocie ponowne nasycenie struktury utrwalonych białek poprzez serię zmian konformacyjnych.
Metody indukowane ciepłem
Mogą one obejmować możliwą hydrolizę (zerwanie) wiązań krzyżowych wywołanych formaliną, przy czym cały proces jest napędzany energią cieplną ze źródła ciepła. Podobnie jak w przypadku metod indukowanych enzymami, metody indukowane ciepłem wymagają optymalizacji. Metody te, które wymagają 10-40 minut w parowarze, mikrofalówce (co pięć minut) lub łaźni wodnej w temperaturze 95-100?C, a następnie 20 minut chłodzenia w temperaturze pokojowej to:
- Bufor cytrynianowy (10 mM cytrynian sodu, 0.05% Tween 20, pH 6)
- Bufor cytrynianowo-EDTA (10 mM cytrynian sodu, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.2)
- Bufor EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8)
- Bufor Tris-EDTA (10 mM Baza Tris, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9)
- Bufor Glicyna-EDTA (50 mM Glicyna-HCl, 0.01% EDTA, pH 3.5)
Ogólnie, metody indukowane ciepłem są szerzej stosowane, prawdopodobnie dlatego, że są bardziej skuteczne. Jeśli dopiero zaczynasz pobieranie antygenów, dobrym miejscem na początek będzie wypróbowana i przetestowana metoda pobierania w buforze cytrynianowym. Oczywiście, jeśli to nie zadziała, to masz wiele do wypróbowania później.
Czy to Ci pomogło? Następnie proszę podzielić się z siecią.
.