Net wanneer je denkt dat je het perfecte fixeermiddel voor je weefsel hebt gevonden, is er nog iets anders om rekening mee te houden: je fixeermiddel heeft misschien net alle antigeenplaatsen gemaskeerd waaraan je mooie nieuwe antilichaam zou gaan binden!
Heb je net je antigeen gemaskeerd?
Zoals ik in een van mijn vorige artikelen heb vermeld, creëert de fixeertechniek die je hebt gekozen meestal cross-links binnen eiwitten; dit is een van de manieren waarop weefsel wordt gestabiliseerd. Dit kan de biochemie van het eiwit zodanig veranderen dat het antigeen van belang wordt gemaskeerd en niet langer door uw primaire antilichaam zal worden herkend.
Maak u geen zorgen- er is hulp bij de hand!
Antigeen maskering kan niet alleen worden veroorzaakt door cross-linking van de aminozuren binnen de epitoop, maar ook door cross-linking van niet-gerelateerde peptiden op of nabij een epitoop, door wijziging van de conformatie van een epitoop, of door wijziging van de elektrostatische lading van het antigeen. Omdat de herkenning van antigeen en antilichaam afhangt van de structuur van het eiwit, is het belangrijk te proberen de natuurlijke 3D-structuur te herstellen. Maak u geen zorgen- er zijn een aantal technieken beschikbaar om dit te omzeilen.
Haal uw masker af!
Sommige antilichamen vereisen geen enkele vorm van ontmaskering, maar als de uwe dat wel doet, geen paniek- het is slechts een korte toevoeging aan uw gebruikelijke protocol. De term antigeen retrieval verwijst naar elke techniek waarbij de maskering van een epitoop wordt teruggedraaid en de binding tussen epitoop en antilichaam wordt hersteld. Het type antigeen retrieval hangt af van vele variabelen, waaronder het doelantigeen, het gebruikte antilichaam, het weefseltype en de fixatiemethode die wordt gebruikt om uw weefsel te preserveren. Als u bijvoorbeeld een polyklonaal antilichaam gebruikt, dat meerdere epitopen herkent, is het minder waarschijnlijk dat antigeen retrieval nodig is, maar het is ook waarschijnlijk dat het een beetje extra achtergrond heeft. Als u een fixatietechniek zoals ethanol hebt gebruikt, is antigeen retrieval niet aan te bevelen omdat de fixatie mogelijk niet sterk genoeg is om de retrieval-condities aan te kunnen.
Warmte of enzymen- u kiest
Er zijn meerdere technieken om de immunoreactiviteit van een epitoop te herstellen en deze vallen in het algemeen in twee hoofdcategorieën uiteen; (a) enzyme-geïnduceerde antigeen retrieval en (b) warmte-geïnduceerde antigeen retrieval. Ook binnen elke categorie zijn er een aantal verschillende manieren om het terughalen uit te voeren.
Enzyme-geïnduceerde methoden
Bij de enzyme-geïnduceerde methoden kunnen enzymen, waaronder Proteinase K, Trypsine en Pepsine, worden gebruikt om de binding van een antilichaam aan zijn epitoop te herstellen. Aangenomen wordt dat het werkingsmechanisme bestaat in de splitsing van peptiden die het epitoop zouden kunnen maskeren. De voornaamste enzym-geïnduceerde methoden, die een incubatie van 10-20 minuten bij 37°C vereisen, zijn:
- Proteïnase K (20 g/ml in TE-buffer, pH 8)
- Trypsine (0,5% in dH20)
- Pepsine (0,1% in 10 mM HCl)
- Pronase (0,5 of 0.1% in dH20)
- Protease (0,5% in dH20)
Afhankelijk van welke methode u ook kiest, elk moet worden geoptimaliseerd voor verschillende weefseltypen en antilichamen, maar elk van deze methoden slot in vóór het blokkeren en na de ontwaxing stappen. De nadelen van deze methoden zijn de lage slagingskans voor herstel van immunoreactiviteit en het potentieel voor het vernietigen van zowel weefselmorfologie en het antigeen van belang.
Als je vindt het enzym-geïnduceerde manier een beetje te hard, of dat het gewoon niet werkt voor u, dan kunt u proberen de warmte-geïnduceerde methode. Bij deze methode worden sommige cross-links ongedaan gemaakt en kan de secundaire of tertiaire structuur van het epitoop worden hersteld. Het is in wezen een herverzadiging van de structuur van vaste eiwitten door een reeks conformatieveranderingen.
Warmte-geïnduceerde methoden
Dit kan de mogelijke hydrolyse (verbreking) van door formaline geïnduceerde crosslinks omvatten, waarbij het gehele proces wordt aangedreven door thermische energie van de warmtebron. Evenals de door enzymen geïnduceerde methoden moeten de door warmte geïnduceerde methoden worden geoptimaliseerd. Deze methoden, die 10-40 minuten in een stoomoven, magnetron (stappen van vijf minuten) of waterbad bij 95-100 °C vereisen, gevolgd door 20 minuten afkoeling bij kamertemperatuur, zijn:
- Citraatbuffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citraat-EDTA-buffer (10 mM natriumcitraat, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycine-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.01% EDTA, pH 3.5)
In het algemeen worden de warmte-geïnduceerde methoden meer gebruikt, waarschijnlijk omdat ze succesvoller zijn. Als u net begint met antigeen retrieval, is de beproefde methode van citraatbuffer retrieval een goede plaats om mee te beginnen. Natuurlijk, als het niet werkt, dan heb je genoeg om daarna te proberen.
Heeft dit u geholpen? Deel het dan met uw netwerk.