Juste quand vous pensez avoir trouvé le fixateur parfait pour votre tissu, il y a autre chose à prendre en compte – votre fixateur vient peut-être de masquer tous les sites antigéniques auxquels votre charmant nouvel anticorps allait se lier !
Vous venez de masquer votre antigène ?
Comme je l’ai mentionné dans l’un de mes précédents articles, la technique de fixation que vous avez choisie crée généralement des liaisons croisées au sein des protéines ; c’est l’une des façons dont le tissu est stabilisé. Cela peut altérer la biochimie de la protéine de telle sorte que l’antigène d’intérêt est masqué et ne sera plus reconnu par votre anticorps primaire.
Ne vous inquiétez pas- l’aide est à portée de main!
Le masquage de l’antigène peut être causé non seulement par la réticulation des acides aminés à l’intérieur de l’épitope, mais aussi par la réticulation de peptides non liés à un épitope ou à proximité, la modification de la conformation d’un épitope ou la modification de la charge électrostatique de l’antigène. Étant donné que la reconnaissance antigène-anticorps repose sur la structure des protéines, il est important d’essayer de restaurer la structure naturelle en 3 D. Ne vous inquiétez pas- il existe un certain nombre de techniques pour passer outre.
Démasquez vous !
Certains anticorps ne nécessitent aucune sorte de démasquage mais si le vôtre le fait, pas de panique- ce n’est qu’un court ajout à votre protocole habituel. Le terme récupération d’antigène désigne toute technique dans laquelle le masquage d’un épitope est inversé et la liaison épitope-anticorps est restaurée. Le type de récupération de l’antigène dépend de nombreuses variables, dont l’antigène cible, l’anticorps utilisé, le type de tissu et la méthode de fixation utilisée pour préserver votre tissu. Par exemple, si vous utilisez un anticorps polyclonal, qui reconnaît plusieurs épitopes, il est moins probable qu’il faille récupérer l’antigène, mais il est également probable qu’il y ait un peu plus de bruit de fond. Si vous avez utilisé une technique de fixation comme l’éthanol, alors la récupération d’antigène n’est pas recommandée car la fixation peut ne pas être assez forte pour gérer les conditions de récupération.
Chaleur ou enzymes- vous choisissez
Il existe de multiples techniques pour restaurer l’immunoréactivité d’un épitope et celles-ci se répartissent généralement en deux catégories principales ; (a) la récupération d’antigène induite par les enzymes et (b) la récupération d’antigène induite par la chaleur. En outre, au sein de chaque catégorie, il existe un certain nombre de façons différentes de procéder à la récupération.
Méthodes induites par des enzymes
Dans les méthodes induites par des enzymes, des enzymes, notamment la protéinase K, la trypsine et la pepsine, peuvent être utilisées pour restaurer la liaison d’un anticorps à son épitope. On pense que le mécanisme d’action est le clivage des peptides qui peuvent masquer l’épitope. Les principales méthodes d’induction enzymatique, qui nécessitent une incubation de 10 à 20 minutes à 37?C, sont :
- Protéinase K (20 g/ml dans le tampon TE, pH 8)
- Trypsine (0,5% dans dH20)
- Pepsine (0,1% dans 10 mM HCl)
- Pronase (0,5 ou 0.1% dans dH20)
- Protéase (0,5% dans dH20)
Selon la méthode que vous choisissez, chacune doit être optimisée pour différents types de tissus et d’anticorps, mais chacune de ces méthodes se faufile avant le blocage et après les étapes de déparaffinage. Les inconvénients de ces méthodes sont le faible taux de réussite pour restaurer l’immunoréactivité et le potentiel de destruction à la fois de la morphologie des tissus et de l’antigène d’intérêt.
Si vous trouvez la méthode induite par les enzymes un peu trop dure, ou qu’elle ne fonctionne tout simplement pas pour vous, alors vous pouvez essayer la méthode induite par la chaleur. Cette méthode est censée inverser certaines liaisons croisées et permet de restaurer la structure secondaire ou tertiaire de l’épitope. Il s’agit, en substance, d’une re-naturation de la structure des protéines fixées par une série de changements conformationnels.
Méthodes induites par la chaleur
Cela peut inclure l’hydrolyse (rupture) possible des liaisons croisées induites par le formol, l’ensemble du processus étant piloté par l’énergie thermique de la source de chaleur. Comme pour les méthodes induites par les enzymes, les méthodes induites par la chaleur nécessitent une optimisation. Ces méthodes, qui nécessitent 10 à 40 minutes dans un cuiseur à vapeur, un four à micro-ondes (incréments de cinq minutes) ou un bain-marie à 95-100 ?C, suivies de 20 minutes de refroidissement à température ambiante sont :
- Tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium, 0,05% de Tween 20, pH 6)
- Tampon de citrate-EDTA (10 mM de citrate de sodium, 2 mM d’EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycine-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
En général, les méthodes induites par la chaleur sont plus largement utilisées, probablement parce qu’elles sont plus réussies. Si vous débutez la récupération d’antigènes, alors un bon point de départ serait la méthode éprouvée de récupération par tampon citrate. Bien sûr, si cela ne fonctionne pas, alors vous avez beaucoup à essayer par la suite.
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