Antigen-Retrieval-Techniken für die Immunhistochemie: Demaskieren Sie das Antigen!

Gerade wenn Sie denken, dass Sie das perfekte Fixiermittel für Ihr Gewebe gefunden haben, gibt es etwas anderes zu bedenken – Ihr Fixiermittel hat vielleicht gerade alle Antigenstellen maskiert, an die Ihr schöner neuer Antikörper binden sollte!

Haben Sie gerade Ihr Antigen maskiert?

Wie ich in einem meiner früheren Artikel erwähnt habe, erzeugt die von Ihnen gewählte Fixierungstechnik normalerweise Querverbindungen innerhalb der Proteine; dies ist eine der Möglichkeiten, wie das Gewebe stabilisiert wird. Dies kann die Biochemie des Proteins so verändern, dass das Antigen von Interesse maskiert wird und von Ihrem primären Antikörper nicht mehr erkannt werden kann.

Keine Sorge – Hilfe ist zur Stelle!

Antigenmaskierung kann nicht nur durch die Vernetzung der Aminosäuren innerhalb des Epitops verursacht werden, sondern auch durch die Vernetzung nicht verwandter Peptide an oder in der Nähe eines Epitops, die Veränderung der Konformation eines Epitops oder die Veränderung der elektrostatischen Ladung des Antigens. Da die Antigen-Antikörper-Erkennung von der Proteinstruktur abhängt, ist es wichtig zu versuchen, die natürliche 3-D-Struktur wiederherzustellen. Keine Sorge – es gibt eine Reihe von Techniken, um dieses Problem zu lösen.

Entfernen Sie Ihre Maske!

Für einige Antikörper ist keine Demaskierung erforderlich, aber wenn dies bei Ihrem Antikörper der Fall ist, keine Panik – es ist nur ein kurzer Zusatz zu Ihrem üblichen Protokoll. Der Begriff Antigenrückgewinnung bezieht sich auf jede Technik, bei der die Maskierung eines Epitops aufgehoben und die Epitop-Antikörper-Bindung wiederhergestellt wird. Die Art der Antigenrückgewinnung hängt von vielen Variablen ab, darunter das Zielantigen, der verwendete Antikörper, der Gewebetyp und die Fixierungsmethode, mit der Ihr Gewebe konserviert wird. Wenn Sie z. B. einen polyklonalen Antikörper verwenden, der mehrere Epitope erkennt, ist es weniger wahrscheinlich, dass eine Antigenrückgewinnung erforderlich ist, aber es ist auch wahrscheinlich, dass ein wenig mehr Hintergrund vorhanden ist. Wenn Sie eine Fixierungstechnik wie Ethanol verwendet haben, wird ein Antigen-Retrieval nicht empfohlen, da die Fixierung möglicherweise nicht stark genug ist, um die Retrieval-Bedingungen zu bewältigen.

Wärme oder Enzyme – Sie haben die Wahl

Es gibt mehrere Techniken, um die Immunreaktivität eines Epitops wiederherzustellen, und diese fallen im Allgemeinen in zwei Hauptkategorien: (a) enzyminduzierter Antigen-Retrieval und (b) hitzeinduzierter Antigen-Retrieval. Auch innerhalb jeder Kategorie gibt es eine Reihe von verschiedenen Methoden, um den Antigenrückruf durchzuführen.

Enzyminduzierte Methoden

Bei den enzyminduzierten Methoden können Enzyme wie Proteinase K, Trypsin und Pepsin verwendet werden, um die Bindung eines Antikörpers an sein Epitop wiederherzustellen. Man geht davon aus, dass der Wirkmechanismus in der Spaltung von Peptiden besteht, die das Epitop möglicherweise maskieren. Die wichtigsten enzyminduzierten Methoden, die eine 10-20-minütige Inkubation bei 37°C erfordern, sind:

• Proteinase K (20 g/ml in TE-Puffer, pH 8)
• Trypsin (0,5% in dH20)
• Pepsin (0,1% in 10 mM HCl)
• Pronase (0,5 oder 0.1% in dH20)
• Protease (0,5% in dH20)

Abhängig davon, welche Methode man wählt, muss jede für verschiedene Gewebetypen und Antikörper optimiert werden, aber jede dieser Methoden fügt sich vor dem Blockieren und nach den Entparaffinierungsschritten ein. Die Nachteile dieser Methoden sind die geringe Erfolgsquote bei der Wiederherstellung der Immunreaktivität und die Möglichkeit, sowohl die Gewebemorphologie als auch das gewünschte Antigen zu zerstören.

Wenn Ihnen die enzyminduzierte Methode etwas zu hart erscheint oder einfach nicht funktioniert, können Sie es mit der hitzeinduzierten Methode versuchen. Es wird angenommen, dass diese Methode einige Querverbindungen aufhebt und die Wiederherstellung der Sekundär- oder Tertiärstruktur des Epitops ermöglicht. Es handelt sich im Wesentlichen um eine Renaturierung der Struktur fixierter Proteine durch eine Reihe von Konformationsänderungen.

Wärmeinduzierte Methoden

Dies kann die mögliche Hydrolyse (Aufbrechen) von Formalin-induzierten Querverbindungen einschließen, wobei der gesamte Prozess durch die thermische Energie der Wärmequelle angetrieben wird. Wie die enzyminduzierten Methoden bedürfen auch die wärmeinduzierten Methoden der Optimierung. Diese Methoden, die 10-40 Minuten in einem Dampfer, einer Mikrowelle (in Fünf-Minuten-Schritten) oder einem Wasserbad bei 95-100°C und anschließendem 20-minütigen Abkühlen bei Raumtemperatur erfordern, sind:

• Citratpuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6)
• Citrat-EDTA-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
• EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
• Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
• Glycin-EDTA (50 mM Glycin-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)

Im Allgemeinen werden die hitzeinduzierten Methoden häufiger verwendet, wahrscheinlich weil sie erfolgreicher sind. Wenn Sie gerade erst mit dem Antigenabruf beginnen, wäre die bewährte Methode des Citratpufferabrufs ein guter Anfang. Wenn das nicht funktioniert, können Sie natürlich auch danach noch einiges ausprobieren.