Zellkultur
Humane embryonale Nierenzellen 293FT (HEK293) wurden in DMEM gezüchtet, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (100 iU pro ml; 100 μg pro ml) ergänzt wurde. Die Zelllinien wurden nicht authentifiziert. Die Zellen waren frei von Mykoplasmen. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Für stabile Zelllinien wurden die transfizierten Zellen in Gegenwart von Puromycin (3 μg pro ml) selektiert. Für transiente Transfektionsstudien wurden HEK293-Zellen in Anwesenheit der Vektoren unter Verwendung von Lipofectamin2000 (ThermoFisher) in 6-Well-Platten ausgesät. Die Podozyten-Zelllinien wurden aus menschlichem Urin42 hergestellt, und die APOL1-Genotypisierung wurde nach Einholung einer informierten Zustimmung im Rahmen von Forschungsprotokollen (94-DK-0127, 94-DK-0133) durchgeführt, die zuvor vom NIDDK Institutional Review Board genehmigt worden waren. Fall A ist ein G0/G0-Mann mit FSGS, Fall B ist ein G0/G0-Mann mit HIV-assoziierter FSGS, Fall C ist ein G0/G0-Mann mit FSGS (HP55-345O-1), Fall D ist ein G1/G2-Mann mit FSGS und Fall E ist ein G1/G2-Mann mit HIV-assoziierter FSGS. Die Zellen wurden in RPMI1640 gezüchtet, das mit 10% FBS, ITS und 1% Penicillin/Streptomycin (100 iU pro ml; 100 μg pro ml) ergänzt wurde. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 33 °C inkubiert und bei 37 °C 7-10 Tage lang differenziert. Die Zelllinien wurden nicht authentifiziert. Die Zellen waren frei von Mykoplasmen. Vor der Gewinnung der Zelllysate wurden die Zellen mit 103 U pro ml IFNα (Abcam) für 24-72 h und 100 mM Calyculin A (LC Laboratories) für 30 min behandelt. Für PKR-Hemmexperimente wurden die Zellen 1 h lang mit 1 μM Imidazolo-Oxindol-PKR-Inhibitor C16 (Sigma Aldrich) behandelt.
Menschliches Gewebe
Deidentifiziertes menschliches Nierenbiopsiegewebe wurde von Dr. Preeti Chandra, University of Maryland, zur Verfügung gestellt. Die Forschung wurde im Voraus von den Institutional Review Boards der University of Maryland und des NIDDK, NIH, genehmigt.
Plasmidinformationen
Der APOL1 G0-Expressionsvektor besteht aus einer vom CMV-Promotor abgeleiteten menschlichen APOL1-cDNA (NM_001136540: 298-1453). Für APOL1 G1 (rs73885319 A→G und/oder rs60910145 T→G) und G2 (rs71785313 del) wurde eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um sie herzustellen. Für den APOL1-Expressionsvektor wurde durch Einfügen eines Stoppcodons und einer Frameshift-Sequenz (TAATAGATGA) nach dem 138. Codon eine fehlende Proteinexpression erzeugt. Für den Sekundärstruktur-Mutationsvektor wurden die ursprünglichen Sequenzen durch acht synonyme Änderungen verändert (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G und 1242T→C). Für den stabilen dsRNA-G0-Vektor sind die ursprünglichen Sequenzen durch 5 Mutationen in der 3′ UTR verändert (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Für flankierende RNA um die APOL1-Allele (NM_001136540.1, 1031-1453) wurde pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) als Hintergrundvektor verwendet. Schemata der Vektorkarten sind in der ergänzenden Abbildung 1 zu sehen.
Immunoblotting
Zellen wurden in einem RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitor/Phosphataseinhibitor-Cocktail lysiert. Die Lysate wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Proteine einem Western Blotting unterzogen und 30 Minuten lang in Odyssey-Blocking-Puffer (LI-COR) blockiert. Die Blots wurden mit primären Antikörpern gegen APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), und GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) und p62 (Cell Signaling #5114). Die Blots wurden mit farbstoffmarkierten Anti-Kaninchen-Antikörpern (LI-COR) inkubiert. Alle Blots wurden mit dem Odyssey-Infrarotscanner (LI-COR) abgebildet. Rohe Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung 13 dargestellt.
Reverse Transkriptase-PCR und quantitative Echtzeit-PCR
Zellen oder die gesamte Niere wurden in TRIzol-Reagenz geerntet und die gesamte RNA wurde isoliert. Die Gesamt-RNA wurde vor der Synthese von cDNA mit Oligo (dT) mit DNase behandelt. Ein 5-μg-Aliquot der RNA wurde für die cDNA-Synthese mit Superscript II Reverse Transkriptase verwendet. Die Proben wurden mittels PCR (RT) oder quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung des Power SYBR Green PCR Master Mix (ThermoFisher) analysiert. Die relative Expression in jeder Probe wurde als Verhältnis (attamoles spezifisches Gen pro β-Actin) berechnet. Primerpaare sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.
Proteinsynthese-Assay
Transfizierte HEK293-Zellen oder humane Podozyten-Zelllinien wurden in 96-Well-Platten gezüchtet und zur Quantifizierung mit 103 U pro ml IFNα (Abcam) oder zur Visualisierung mit einem Kammerschieber behandelt. Der Syntheseassay (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, Katalognr. C10289, Invitrogen) wurde gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die nukleäre Gegenfärbung wurde mit Hoechst durchgeführt. HEK293-Zellen ohne Vektor, die mit 1 μM Puromycin (InvivoGen, San Diego, CA) behandelt wurden, dienten als Negativkontrolle für diesen Assay, wobei der Hintergrund auf 0 % Signalintensität eingestellt wurde. HEK293-Zellen mit APOL1 G0-Vektorzellen wurden auf 100 % Signalintensität eingestellt.
Zelllebensfähigkeit
Zelllebensfähigkeitstests wurden mit ATP-Assays durchgeführt. Zur Quantifizierung von ATP, das von stoffwechselaktiven Zellen erzeugt wird, verwendeten wir einen CellTiter-Glo Lumineszenz-Zelllebensfähigkeitstest (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden in sterilen 96-Well-Platten in Gegenwart von 103 U pro ml IFNα (Abcam) 72 Stunden lang kultiviert, dann wurden 100 μl des CellTiter-Glo-Reagenz hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lumineszenz mit einem Luminometer mit einer Integrationszeit von 1 s pro Vertiefung gemessen. Die Lumineszenzsignale für die Zellen wurden durch die Zellzahl normalisiert.
Zellproliferationsgeschwindigkeitstest
Die Zellen wurden mit 5,0 × 103 Zellen pro 150 µL Kulturmedium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte gesät und der PKR-Inhibitor C16 wurde in der angegebenen Konzentration zugegeben. Nach 0, 24, 48, 50 µL wurde die Zellzahl mit dem Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich) gemessen.
Sauerstoffverbrauchsraten in kultivierten menschlichen Podozyten
Der XF24 extracellular flux analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) wurde zur Bewertung der zellulären Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) gemäß den Anweisungen des Unternehmens verwendet. Kurz gesagt, kultivierte menschliche Podozyten wurden in XF24-Well-Platten, die von Seahorse Bioscience erworben wurden, in einer Dichte von 2,0 × 104 Zellen pro Well (Oberfläche 0,33 cm2) in 100 μL Kulturmedium ausgesät und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen 72 Stunden lang mit IFNα (1 × 103 U pro ml) mit/ohne PKR-Inhibitor C16 (100 nM) behandelt, gefolgt von einer 24-stündigen Behandlung auf den XF24-Well-Platten. Vor den OCR-Messungen wurde die experimentelle XF24-Platte mit den Zellen mit bicarbonatfreiem DMEM-Assay-Medium (Seahorse Bioscience) mit 25 mM Glukose und 1 mM Natriumpyruvat gewaschen, und die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C ohne CO2-Zufuhr in 625 μL Assay-Medium vorinkubiert. Vor den OCR-Messungen wurde das XF24 mit einer Kalibrierungskassette gemäß den Anweisungen des Unternehmens kalibriert. Nach der Kalibrierung wurden 4 Minuten lang OCR-Basismessungen in der Testplatte durchgeführt.
RNA-Immunpräzipitation (RNA-IP)
Stabile HEK293-Zellen, die die APOL1-G0-, G1- oder G2-Variante trugen, wurden mit Folgendem als Scheinbehandlung behandelt: (a) 103 U pro ml IFNα für 24-72 h und 100 μM Palmitinsäure (Sigma) für 2 h, oder (b) 100 mM 103 U pro ml IFNα für 24-72 h und Calyculin A für 30 min. Palmitinsäure bindet direkt an PKR und hemmt die dsRNA-Bindung an PKR44, weshalb Palmitinsäure als Negativkontrolle verwendet wurde. Die Zellen wurden mit UV-Licht bei 200 mJ pro cm2 bestrahlt. Zehn Prozent jedes Zelllysats wurden aufbewahrt und dienten als Eingangsprobe für die RT-qPCR. Die Immunpräzipitation wurde mit dem RNA-Binding protein immunoprecipitation kit (EMD Millipore) auf der Grundlage eines früheren Berichts über PKR45 durchgeführt. Für die RNA-IP wurde der Phospho-PKR-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) oder Kontroll-Kaninchen-IgG verwendet. Die RNA wurde mit TRIzol extrahiert, anschließend mit DNase behandelt und mit Ethanol ausgefällt. cDNAs wurden mit Random-Hexamer-Primern und SuperScript Reverse transcriptase II erzeugt. Die Proben wurden mittels PCR (RT) oder qRT-PCR unter Verwendung von Power SYBR Green PCR Master Mix (ThermoFisher) analysiert. Die Anreicherung wurde als Verhältnis (IP-Probe pro Input-Probe) berechnet. Die Primerpaare sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. In den Negativkontrollen, mock-behandelten Zellen mit Phospho-PKR-Antikörper-IP und Interferon-α + Calyculin A-behandelten Zellen mit Kontroll-Kaninchen-IgG-IP
PKR-Proteinexpression und -Reinigung
Rekombinante PKR wurde wie zuvor berichtet46 gereinigt. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) wurde in BL21(DE3) Rosetta Zellen (Novagen) transformiert. Die Zellen wurden in LB-Medium bei 37 °C gezüchtet, bis A600 nm ~ 0,7 war, und die Proteinexpression wurde mit 1 mM IPTG für 3 h bei ~20 °C induziert. Für die PKR-Reinigung wurden die Zellen in Puffer A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin) resuspendiert und mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma) ergänzt. Die Zellen wurden durch 30-minütige Inkubation mit 5 mg pro ml Lysozym und anschließende 3-minütige Ultraschallbehandlung lysiert. Das Lysat wurde 20 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) aufgetragen, die in Puffer A äquilibriert war, und PKR wurde mithilfe eines NaCl-Gradienten eluiert. Die Peakfraktionen wurden zweifach mit Puffer A verdünnt und auf eine Poly(I:C)-Agarosesäule (Amersham) aufgetragen, die in Puffer A äquilibriert war. PKR wurde bei 1,1 M NaCl eluiert, auf ~10 mg pro ml konzentriert und bei -80 °C gelagert.
PKR-Aktivierungsassay
PKR-Aktivierungsassays wurden wie zuvor berichtet47 durchgeführt. PKR wurde durch λ-Proteinphosphatase für 1 h bei 30 °C dephosphoryliert und dann mit 2 mM Natriumorthovanadat inhibiert. PKR (4 μM) wurde mit langer RNA (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng pro ml)/kurzer RNA (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng pro ml)/Poly(I:C) 20 μg pro ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT und 100 μM ATP (Ambion). Die Reaktionsgemische wurden bei 30 °C für die angegebenen Zeiten inkubiert und mit 1× SDS-Ladepuffer gequencht. Phosphorylierte PKRs wurden mit dem Phospho-PKR-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) nachgewiesen.
RNA-Vorbereitung für Gelmigrationsexperimente und SHAPE
Trunkierte APOL1-RNAs mit verschiedenen 3′-Strukturkassetten wurden durch In-vitro-Transkription mit dem MegaShortScript-Kit (ThermoFisher) gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Die Transkriptionsvorlagen wurden in zwei semi-nested PCR-Reaktionen aus Plasmiden erzeugt, die APOL1-Allele (G0, G1, G2) oder deren mutierte Varianten (mG0, mG1, mG2) enthalten. Für die erste Reaktion wurden Vorwärts- und Rückwärtsprimer verwendet, um einen 5′ T7-Promotor bzw. ein 45 nt 3′ SC an die verkürzten APOL1-Sequenzen anzuhängen (ergänzende Tabelle 1). Das letztgenannte Element wurde eingeführt, um eine Hybridisierungsstelle für SHAPE bei der reversen Transkription zu schaffen. Ein Teil jeder Reaktion wurde mit dem ursprünglichen Vorwärtsprimer und einem kürzeren Rückwärtsprimer erneut amplifiziert, um die endgültigen Transkriptionsvorlagen homogener zu machen. Die Transkriptionsreaktionen wurden 5 Minuten lang bei 37 °C mit Turbo-DNase I behandelt, 2 Minuten lang bei 85 °C inkubiert und über ein denaturierendes Gel (5% Polyacrylamid-19:1, 1× TBE, 7 M Harnstoff) bei konstanter Temperatur (45 °C, 30 W max) fraktioniert. Die gewünschten RNA-Produkte wurden durch UV-Beschattung nachgewiesen, vom Gel abgetrennt, bei 200 V für 2 h bei 4 °C elektroeluiert, mit Ethanol ausgefällt und vor der Verwendung bei -20 °C in 10 mM Tris, pH 7,0 gelagert. RNA-Stammlösungen wurden spektrophotometrisch quantifiziert.
Gelmigrationsassay
Jede verkürzte APOL1-RNA wurde auf 1 μM in 20 μL RNA-Renaturierungspuffer (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerin (w per v)), durch Erhitzen auf 85 °C für 2 min denaturiert und durch langsames Abkühlen (0,1 °C pro s) auf 25 °C renaturiert. Anschließend wurde MgCl2 in einer Endkonzentration von 0, 1 oder 3 mM zugegeben, und die Mischungen wurden weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die Bildung von Mg-abhängigen und/oder anderen tertiären RNA-Interaktionen zu fördern. Die RNA-Konformer wurden durch Blitzabkühlung auf 4 °C stabilisiert und anschließend über ein 5%iges nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel (5% Acrylamid, 19:1) für 16-18 h bei 4 °C fraktioniert. Sowohl das Gel als auch der Laufpuffer enthielten 1× TBE und 1 mM MgCl2, und die Gele wurden vor dem Beladen ~1 h lang vorgelaufen. Die Gele wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Farbstoff SybrGreen (ThermoFisher) bestrahlt, und die Migrationspositionen der RNA-Konformer wurden mit einem Typhoon Trio+ Variable Mode Imager (GE Healthcare) ermittelt.
SHAPE und Erzeugung von RNA-Sekundärstrukturmodellen
SHAPE-Versuchsmethoden wurden bereits beschrieben48,49. Kurz gesagt, die verkürzte APOL1-RNA mit einer SC-RNA wurde wie im Gelmigrationsassay gefaltet, mit der Ausnahme, dass das Mischungsvolumen 150 μL betrug, die endgültige MgCl2-Konzentration 1 mM war und Glycerin ausgeschlossen wurde. Die RNA-Lösungen wurden in Kontroll- (1M7-) und experimentelle (1M7+) Aliquots (jeweils 72 μL) aufgeteilt, und es wurden 8 μL DMSO bzw. 8 μL 30 mM 1M7 in DMSO hinzugefügt. Die Modifikationsreaktionen wurden 5 Minuten bei 37 °C inkubiert, auf 4 °C abgekühlt, mit Ethanol ausgefällt und in 10 μL nukleasefreiem Wasser resuspendiert. Die behandelten RNAs wurden mit unterschiedlich markierten Primern, die komplementär zur 3′-Strukturkassette sind (1M7- Primer, Cy5.5; 1M7+ Primer, Cy5), revers transkribiert und durch Alkalibehandlung hydrolysiert. Die resultierenden cDNA-Bibliotheken wurden mit Ethanol ausgefällt und in Sample Loading Solution (Genome Lab) wieder aufgelöst, dann mit ddA- und ddG-Sequenzierleitern gepoolt, die mit WellRED D2 (Beckman Coulter) bzw. IRDye 800RS (LI-COR) markiert waren. Die kombinierten Proben wurden durch Kapillarelektrophorese (CE) mit einem Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer fraktioniert. Für jede RNA wurden Reaktivitätsprofile aus CE-Elektropherogrammen mit der SHAPEfinder-Software50 erstellt und dann zusammen mit den RNA-Sequenzen in die RNAstructure-Software Version 5.751,52 eingegeben, um Sekundärstrukturmodelle zu erstellen. Die Standardparameter für die Steigung (1,8 kcal pro mol) und den Achsenabschnitt (-0,6 kcal pro mol) wurden verwendet, um die Reaktivitätswerte in die Pseudoenergiebeschränkungen umzuwandeln, die den RNA-Faltungsalgorithmus modulieren. RNAstructure generiert automatisch mehrere Strukturmodelle, die den von SHAPE abgeleiteten Reaktivitätsprofilen am besten entsprechen, und ordnet sie nach der freien Gibbs-Energie ein. Die auf diese Weise erzeugten Strukturmodelle mit der niedrigsten Energie sind in Abb. 3a, b und in der ergänzenden Abb. 4 dargestellt.
In vitro knock down
Wir führten Knock down-Experimente mit konditionell immortalisierten menschlichen Zelllinien durch, die aus menschlichem Urin42 gewonnen wurden. Wir transfizierten diese Zellen entweder mit der Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) oder mit einer vordefinierten Stealth siRNA gegen APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo wurde mittransfiziert und als Transfektionskontrolle verwendet. Die Knockdown-Effizienzen betrugen 52,4-75,4 % (RNA-Spiegel) bzw. 31,1 % (Proteingehalt).
Mäuse
Wir verwendeten transgene Mäuse mit humanem APOL1-Genlocus (BAC-APOL1-Mäuse), die mit Hilfe eines bakteriellen künstlichen Chromosoms erzeugt wurden, das den Locus für APLOL-G0 oder APOL1-G1 oder APOL1-G2 enthält. Eine ~47 kb große menschliche DNA, die nur das APOL1-Gen mit 5′ und 3′ flankierenden Regionen umfasst (einschließlich der Exons 1 und 2 von APOL2 und der 3′-Region, die die Exons 39-41 eines Teils des MYH9-Gens enthält), wurde isoliert und aus dem menschlichen BAC-Klon (ENST00000397278, entspricht NM_003661) subkloniert. Einzelne G0-, G1- und G2-BAC-Subklone wurden in 129SvJ/B6N-F1-Embryonen injiziert, und die Stammzellen wurden anschließend in 129SvJ rückgekreuzt. Der Subklon wurde sequenziert, um sicherzustellen, dass er der Referenzgenomsequenz des NCBI und von Ensembl entspricht. Die einzigen Unterschiede waren Polymorphismen in den intronischen Regionen. In den Experimenten mit konditionalen transgenen Mäusen verwendeten wir podozytenspezifische transgene Mäuse mit verkürzter APOL1-RNA und FVB-Hintergrund. Wir erzeugten diese Mäuse mit Hilfe eines konditionalen transgenen Systems unter Verwendung einer Nephrin (NPHS1)-promotorgesteuerten trunkierten RNA-Sequenz (NM_001136540, 1031-1453). Wir haben zwei Stämme erzeugt: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA mit rs73885319 A und rs60910145 G und NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA mit rs73885319 G und rs60910145 G.
Isolierung von Glomeruli
BAC/APOL1-Mäuse (zwischen 8 und 12 Wochen alt) wurden vor der Gewebeentnahme täglich IFNγ (106 U pro kg Körpergewicht IP) für 3 Tage verabreicht. Über das Protokoll zur Isolierung der Glomerula wurde bereits ausführlich berichtet53. Kurz gesagt wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von Avertin (2,2,2-Tribromethyl- und tertiärer Amylalkohol; 17 μl pro g) betäubt und mit 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04), die in 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt waren, durch das Herz perfundiert. Die Nieren wurden mit Kollagenase A und DNase I bei 37 °C 10 Minuten lang verdaut. Das kollagenaseverdaute Gewebe wurde vorsichtig durch ein 100-μm-Zellsieb gepresst und mit HBSS gewaschen. Die Proben wurden gewaschen und mit einem Magnetständer resuspendiert. Glomeruli wurden gesammelt und in RPMI1640, ergänzt mit 10 % FBS, ITS, 1 % Penicillin/Streptomycin (100 iU pro ml; 100 μg pro ml) und 100 mM Calyculin A (LC Laboratories), 30 Minuten lang inkubiert und für die Western-Blot-Analyse verwendet.
Immunhistochemie (Mausproben)
BAC/APOL1-Mäuse (zwischen 8 und 12 Wochen alt) wurden 3 Tage lang täglich IFNγ (106 U pro kg Körpergewicht IP) verabreicht. Die Mäuse wurden vor der Gewebeentnahme mit 100 mM Calyculin A enthaltendem PBS perfundiert. Dann wurden die Nieren in kleine Stücke geschnitten und 30 Minuten lang in RPMI1640, ergänzt mit 10 % FBS, ITS und 100 mM Calyculin A, inkubiert. Anschließend wurde das Gewebe sofort mit 10% gepuffertem Formalin fixiert. BAC/APOL1-Mäusen (zwischen 8 und 12 Wochen alt) wurde 3 Tage lang täglich IFNγ (106 U pro kg Körpergewicht IP) verabreicht. NPHS1-APOL1-ΔRNA-Mäusen wurde vor der Gewebeentnahme 3 Tage lang täglich IFNγ (106 U pro kg Körpergewicht IP) verabreicht. Wir verwendeten paraffinfixierte 4-5 μm Gewebeschnitte. Die Schnitte wurden deparaffiniert/befeuchtet, die Antigengewinnung erfolgte durch Erhitzen in zitratgepuffertem Medium für 5 Minuten in der Mikrowelle. Die Gewebe wurden mit 1% BSA und 0,1% Saponin blockiert. Die Schnitte wurden mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) und Podocalyxin (R&D Systems AF1556). Für die Immunfluoreszenz wurden sekundäre Alexa-Fluor-Antikörper (ThermoFisher) verwendet und mit konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Für die ABC-Färbung wurden mit Biotin konjugierte Sekundärantikörper und Avidin-HRP (Vector) verwendet. Für die Visualisierung wurde ein DAB-Kit (Vector) verwendet. In Mausexperimenten wurden Mäuse (zwischen 8 und 12 Wochen alt) mit IFNγ (106 U pro kg Körpergewicht IP) behandelt, das 3 Tage lang vor der Gewebeentnahme injiziert wurde. Zur Quantifizierung des Signals wurde das Phospho-PKR-Signal der Podozyten durch eine Gegenfärbung für WT1 in den Mausexperimenten nachgewiesen.
Immunhistochemie (menschliche Proben)
Diese Studie wurde im Voraus vom IRB der University of Maryland und vom NIDDK, NIH, genehmigt. Die grundlegenden Merkmale der Fälle sind in der ergänzenden Abb. 5b aufgeführt. Die Färbung erfolgte an 5 μm dicken formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Nach der Entparaffinierung erfolgte die hitzeinduzierte Antigenrückgewinnung für 20 Minuten in einem Puffer mit pH 6,0 unter Verwendung eines Druckkochers (Pascal, Agilent Technologies Dako). Die Schnitte wurden mit folgenden primären Antikörpern inkubiert: phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) und WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Wir verwendeten sekundäre Alexa-Fluor-Antikörper (ThermoFisher) und visualisierten sie mit konfokaler Mikroskopie.
Immunhistochemie und Live-Zell-Imaging
Zellen wurden vor der Signaldetektion und nach der Behandlung mit 20 μM FCCP 20 Minuten lang mit 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) und 200 nM TMRE (Invitrogen) inkubiert und mit konfokaler Mikroskopie visualisiert.
Signalquantifizierung der mikroskopischen Bilder
Für das menschliche Gewebe zählten wir Glomeruli ohne globale Sklerose (6 Fälle ohne Risikogenotyp: 5, 6, 7, 10, 5 bzw. 9 Glomeruli für jeden Fall; 6 Fälle mit Risikogenotyp: 13, 6, 4, 5, 10 bzw. 5 Glomeruli). Für Maus- und menschliches Gewebe wurde die Laserleistung so eingestellt, dass das maximale Signal nicht gesättigt wurde. Bildverarbeitung und Kolokalisationsanalysen wurden mit der Zen-Software (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland)54 durchgeführt. Der gewichtete Kolokalisationskoeffizient und die mittlere Intensität in WT-1-positiven Zellen wurden wie bereits berichtet54 berechnet. Für die mittlere Intensität standardisierten wir die Podozyten-Signalintensität anhand der Signale von WT1-negativen intra-glomerulären Zellen für jeden Glomerulus. Bei den Werten handelte es sich um relative Werte, wobei die Signalintensität von APOL1-G0 mit 100 % angegeben wurde. Die Quantifizierungen wurden verblindet durchgeführt.
In-situ-Hybridisierung
Die chromogene In-situ-Detektion wurde an Gewebeschnitten aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Blöcken der Maus mit Hilfe der RNAscope-In-situ-Hybridisierung (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN) durchgeführt. Dazu wurden 5 μm große FFPE-Gewebeschnitte entparaffiniert, 15 Minuten lang mit einem Vorbehandlungsreagenz gekocht und anschließend 30 Minuten lang bei 40 °C proteaseverdaut, gefolgt von einer 2-stündigen Hybridisierung bei 40 °C mit der Sonde Hs-APOL1-01 (Katalognummer 439871, Advanced Cell Diagnostics). Zusätzlich wurden Sonde-Mm-PPIB (Katalognummer 313911) und Sonde-DapB (Katalognummer 310043) als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet. Der Nachweis spezifischer Sondenbindungsstellen wurde mit dem RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Braun) (Katalog Nr. 310035) visualisiert.
Maus-Proteinurie-Modell
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) durchgeführt und im Voraus vom NIDDK Animal Care and Use Committee (Tierversuchsantrag (K097-KDB-14)) genehmigt. Wir haben sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 8-15 Wochen verwendet. Die Mäuse in jedem Experiment waren hinsichtlich Geschlecht, Alter und Körpergewicht gleich. Die Randomisierung erfolgte im Hinblick auf das Körpergewicht. Die Stichprobengrößen für die Experimente wurden ohne formale Leistungsberechnungen festgelegt. Ausschlusskriterien waren Gewichtsverluste von mehr als 20 % während des Versuchszeitraums. Zur Induktion der Proteinurie wurden Mäusen (im Alter zwischen 8 und 12 Wochen) bFGF und Puromycin-Aminonukleosid injiziert, wie zuvor beschrieben30. Beim Mäusestamm NPHS1-APOL1-deltaRNA wurde Puromycin-Aminonukleosid (Sigma-Aldrich) am Tag 0 subkutan injiziert (200 mg pro kg Körpergewicht), und bFGF (Kaken Pharmaceutical) wurde am Tag 0 bzw. 2 intravenös injiziert (5 μg pro Tier). Für PKR-Inhibitor-Experimente wurde der PKR-Inhibitor C16 (10 μg pro kg IP) täglich von Tag 0 bis Tag 1055 verabreicht. Für den BAC-APOL1-Mäusestamm wurde Interferon γ (Prospec) an Tag -1 und Tag 1 (106 U pro kg Körpergewicht) injiziert, Puromycin-Aminonukleosid wurde an Tag 0 subkutan injiziert (300 mg pro kg Körpergewicht), und bFGF (Kaken Pharmaceutical) wurde an Tag 0 bzw. 2 intravenös injiziert (5 μg pro Tier). Für PKR-Inhibitor-Experimente wurde PKR-Inhibitor C16 (10 μg pro kg IP) täglich von Tag 0 bis Tag 1055 verabreicht.
Urin-Albumin- und Kreatinin-Messung
Wir bestimmten die Urin-Albumin-Werte mit ELISA unter Verwendung eines murinen Mikroalbuminurie-ELISA-Kits (Exocell). Die Kreatininkonzentration im Urin wurde mit einem Kreatinin-Kit (Exocell) gemessen. Alle Messungen wurden in zweifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Albuminurie wurde als das Verhältnis von Albumin zu Kreatinin im Urin bestimmt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Herstellerprotokollen durchgeführt. Die Prüfer waren nicht verblindet, was die Gruppenzuordnung betraf, aber sie waren verblindet, wenn es um die Bewertung der Ergebnisse ging.
Statistische Analyse
Daten aus mindestens drei einzelnen Experimenten wurden analysiert und als Punktdiagramm und Mittelwert dargestellt. Die statistischen Analysemethoden wurden in den Legenden der einzelnen Abbildungen beschrieben. Wir haben nicht für Mehrfachvergleiche angepasst. Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.