Materialien
4′-Hydroxyazobenzol-2-carbonsäure (HABA), Biotin, N-(2-Aminoethyl)maleimid-Trifluoracetat-Salz (Amino-Maleimid), Essigsäure, Natriumacetat, Phosphorsäure, Magnesiumchlorid, Tween 20, Tween 80, Rinderserumalbumin (BSA), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dextran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; vor der Verwendung lyophilisiert), 4-Nitrophenylchlorameisensäureester (PNC; vor Gebrauch sublimiert), LiCl (vor Gebrauch bei 110 °C getrocknet), Tyramin (TA), wasserfreies Pyridin, wasserfreies N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA), Piperidin, Aminosäuren, Essigsäureanhydrid, Triisopropylsilan, Trifluoressigsäure (TFA), Natriumhydroxid (NaOH), N-Boc-1,4-Butandiamin (NH2-Boc), Natriumbicarbonat (NaHCO3), Biotin-atto565, Biotin-4-Fluorescein (Biotin-FITC), 6-Aminofluorescein, Meerrettichperoxidase (HRP, Typ VI), Biotin-HRP, Wasserstoffperoxid (H2O2; mit Inhibitor), fötales Rinderserum (FBS), Calcein AM, Ethidium-Homodimer-1 (EthD-1), Thiazolylblau-Tetrazolium-Blau (MTT) und alle anderen Lösungsmittel wurden, sofern nicht anders angegeben, von Sigma-Aldrich bezogen. Die knochenförmige Vorlage wurde von LEGO erworben. Polydimethylsiloxan (PDMS; Sylgard 184) wurde von Dow Corning bezogen. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde von Lonza bezogen. Rekombinantes menschliches BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) und H2SO4 wurden von R&D Systems erworben. Fmoc-Rink 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA) Harz (50 mg Maßstab, Substitution 0,52 mmol g-1) und N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorophosphat (HBTU) wurden von MultiSynTech erworben. Chloroform und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon (NMP) wurden von WR Chemicals bezogen. VHH-Antikörper gegen BMP7 (Q32c-lab, Klon G7) und polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen VHH (K1216) wurden von QVQ erworben. Der biotinylierte IL-1β-Antikörper (508301, Klon JK1B2, RRID:AB_315512) wurde von Biolegend erworben. Biotinyliertes IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) wurde von Jackson Immunoresearch erworben. HRP-konjugierter sekundärer Ziegenantikörper gegen Kaninchen (P0448) wurde von Dako erworben. Biotinylierte Goldnanopartikel (20 nm) wurden von Cytodiagnostics erworben. Das biotinylierte Peptid mit der Aminosäuresequenz KGLPLGNSH wurde von Pepscan bezogen. Succinimidyl 6-(Biotinamido)hexanoat (Biotin-LC-NHS) wurde von ApexBio erworben. Neutravidin, N-Hydroxysuccinimid-Desthiobiotin (EZ-Link NHS-Desthiobiotin), 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) und 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Färbekit wurden von ThermoFisher Scientific erworben. Voraktivierte Sensoren für die Aminkopplung (G-Typ easy2spot) wurden von Ssens BV erworben. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Penicillin und Streptomycin sowie Trypsin-EDTA wurden von Gibco bezogen. Reporter Lysis Buffer (E397A), Luciferase Assay Reagenz (E1483) und QuantiFluor dsDNA System wurden von Promega bezogen. C2C12-BRE-Luc-Zellen wurden freundlicherweise von Prof. Daniel B. Rifkin zur Verfügung gestellt.
Neutravidin-Multivalenzanalyse
Die spektrophotometrische Analyse von HABA wurde verwendet, um die Anzahl der Biotin-Bindungstaschen von Neutravidin zu analysieren. HABA kann spezifisch an (Neutravidin) in ähnlicher Weise wie Biotin binden, jedoch mit geringerer Bindungsaffinität. Der HABA/Neutravidin-Komplex hat einen Absorptionspeak um 500 nm. Ungebundenes HABA hat einen Absorptionspeak bei 350 nm. Die Verdrängung von HABA durch Biotin kann daher durch Messung der Absorption bei 350 und 500 nm bewertet werden. Um die Anzahl der Biotin-Bindungstaschen von Neutravidin zu bestimmen, wurde es zunächst mit einem Überschuss an HABA inkubiert, so dass sich vollständig gesättigte HABA/Neutravidin-Komplexe bildeten. Zu diesen Komplexen wurde Biotin in einem molaren Verhältnis von Neutravidin/Biotin von 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 und 1:6 hinzugefügt. Für jedes Neutravidin/Biotin-Verhältnis wurde die Menge sowohl des HABA/Neutravidin-Komplexes als auch des freien HABA durch Messung der Absorption bei 500 bzw. 350 nm mit einem ND1000-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific) bestimmt. Das Plateau bei 3,2 Biotin/Neutravidin zeigte die Anzahl der Biotin-Bindungstaschen an, die mit der Spezifikation des Herstellers (3,1 Biotin/Neutravidin) übereinstimmte.
SPRi-Messungen
Biotinyliertes IL-1B wurde auf G-Typ easy2spot-Sensoren mit Hilfe eines kontinuierlichen Fluss-Spotters (Wasatch Microfluidics) immobilisiert. Die Gel-Typ-Sensoren wurden aufgrund ihrer höheren Bindungskapazität und der effizienteren Nutzung des evaneszenten Feldes im Vergleich zu einem planaren Oberflächensensor verwendet. Die Immobilisierungsreaktion wurde in 50 mM Essigsäurepuffer (150 µl pro Spot) mit Antikörperkonzentrationen von 5, 2,5, 1,25 und 0,625 µg ml-1 durchgeführt. Als Kontrolle wurde BSA in einer Konzentration von 5 µg/ml aufgetragen. Ein Immobilisierungspuffer (pH 4,6) ermöglichte die Antikörperkopplung mit der höchsten erhaltenen Aktivität und wurde daher für alle Experimente verwendet. Um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren, wurde der Sensor 7 Minuten lang mit 1 % (w/v) BSA in 50 mM Acetatpuffer (pH 4,6) und anschließend weitere 7 Minuten lang mit 0,2 M Ethanolamin (pH 8,5) deaktiviert. SPRi wurde mit einem MX96-System mit SUIT-Betriebssoftware (IBIS) durchgeführt. Neutravidin, D-@BMP7, B-@BMP7 und BMP7 wurden in Systempuffer bestehend aus PBS mit 0,5 % (w/v) BSA und 0,075 % (v/v) Tween80 in einer Konzentration von 250, 100, 100 bzw. 100 nM gelöst. Biotin wurde in einer Konzentration von 400 µM in Systempuffer gelöst, der mit 0,1 % (v/v) DMSO ergänzt wurde. Der Rück- und Vorwärtsfluss wurde auf 10 µl min-1 in einer Durchflusszelle mit 12 µl Probe eingestellt. Die Sprint-Software wurde für die Datenerfassung und Referenzierung von insgesamt sechs Spots pro Bedingung verwendet. Die Daten wurden anschließend in Matlab R2015a zur weiteren Analyse und Qualitätskontrolle mithilfe von benutzerdefinierten Skripten (auf Anfrage erhältlich) exportiert. Die Dissoziationskonstanten der supramolekularen Komplexe wurden wie folgt bestimmt: Zunächst wurde der Sensor mit drei Leerwertinjektionen (d. h. Systempuffer) gewaschen, um den Hintergrund für Interaktionssignale zu ermitteln. Anschließend wurde in einem Kaskadenverfahren die Affinität zwischen den Komponenten des Komplexes bestimmt. Zu diesem Zweck wurde der Sensor mit Puffer inkubiert, gefolgt von Neutravidin, D-@BMP7 oder B-@BMP7, BMP7 und schließlich Biotinlösung. Die Assoziationszeit der Kaskadeninteraktionen betrug 30 Minuten, gefolgt von 15 Minuten Dissoziation. Zwischen den einzelnen Injektionen wurde der Sensor mit Systempuffer gewaschen. Die Assoziationszeit der Verdrängungswechselwirkung mit Biotin betrug 180 Minuten und wurde zweimal durchgeführt. Die Kinetik konnte mit einer einfachen 1:1 Langmuir-Wechselwirkung beschrieben werden, die mit einer exponentiellen Gleichung (3) erfasst werden kann.
In dieser Gleichung ist Rmax die Bindungskapazität des Liganden (RU), kon ist die Assoziationsrate (M-1 s-1), koff ist die Dissoziationsrate (s-1), c ist die Analytkonzentration (M) und t ist die Zeit ab Beginn der Wechselwirkung (s). Die Dissoziationskonstante Kd ist definiert als koff/kon. Matlab-Software mit benutzerdefinierten Skripten wurde zur Analyse der Affinitätsdaten durch Anpassung der Langmuir-Wechselwirkung verwendet. Kurz gesagt, die Leerwerte wurden subtrahiert und das Signal wurde auf die erste Wechselwirkung zurückgeführt. Um die Affinität einer bestimmten Wechselwirkung zu bestimmen, wurde zunächst die koff-Rate in der Dissoziationsphase ermittelt. Anschließend wurde die kon-Rate unter Verwendung eines festen koff-Wertes bestimmt. Für die Verdrängung mit Biotin wurde die koff-Rate in der Assoziationsphase bestimmt.
Dex-TAB Synthese und Charakterisierung
Dextran wurde mit p-Nitrophenylchlorformiat (PNC) zu p-Nitrophenylcarbonat-Konjugaten umgesetzt, die dann mit primären aminhaltigen Verbindungen behandelt wurden (Ergänzende Abb. 2). Die Dextran-p-Nitrophenylcarbonat-Konjugate (Dex-PNC) wurden wie folgt synthetisiert. In einem typischen Experiment wurde Dextran (3,0 g, 56,3 mmol OH-Gruppen) in DMF (200 mL, mit 2,4 g LiCl) bei 90 °C unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Nachdem das Dextran gelöst war, wurde die Mischung auf 0 °C abgekühlt. Pyridin (1,5 mL, 18,6 mmol) und anschließend PNC (2,8 g, 13,9 mmol) wurden unter Rühren in kleinen Portionen zugegeben und die Temperatur auf 0 °C gehalten. Die Reaktion wurde eine Stunde lang durchgeführt und das Produkt in kaltem Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde filtriert, mit Ethanol und anschließend mit Diethylether gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Dextran-Tyramin-Butylamin (Dex-TA-NH2) wurde wie folgt synthetisiert. Dex-PNC wurde zunächst mit N-Boc-1,4-Diaminobutan und dann mit Tyramin umgesetzt. Die t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe wurde durch Reaktion mit TFA entfernt. In einem typischen Versuch wurde Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC-Gruppen) in 16 mL DMF gelöst. N-Boc-1,4-Diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) wurde unter Stickstoffzufuhr zugegeben und die Reaktion 15 Minuten lang laufen gelassen. Danach wurde Tyramin (0,20 g, 1,46 mmol) zugegeben und die Reaktion eine Stunde lang weitergeführt. Das Produkt wurde in kaltem Ethanol ausgefällt, der Niederschlag wurde filtriert, mit Ethanol und Diethylether gewaschen und anschließend im Vakuumofen getrocknet. Boc-geschütztes Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) wurde in 10 mL entionisiertem Wasser aufgelöst. Trifluoressigsäure (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) wurde unter Stickstoffatmosphäre zugegeben und über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 2 M NaOH-Lösung neutralisiert und durch Dialyse (1000 Da Molekulargewichts-Cut-off) gegen eine 150 mM NaCl-Lösung für 48 h und deionisiertes Wasser für 24 h gereinigt und anschließend durch Lyophilisierung isoliert. Dex-TA-NH2 wurde weiter mit Biotin funktionalisiert, indem 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 mit einem 20-fachen molaren Überschuss an Biotin-LC-NHS für mindestens 1 h in 0,1 M Bicarbonatpuffer (pH 8,5) umgesetzt wurde (ergänzende Abb. 3). Dex-TAB wurde dann mit Hilfe einer Spinfilter-Säule mit 3 kDa Molekulargewichts-Cut-off gereinigt und konzentriert. Die erfolgreiche Synthese von Dex-PNC, Dex-TA-NH2 und Dex-TAB wurde mit 1H-NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) in DMSO-d6 oder D2O bestätigt. Die Anzahl der konjugierten Tyramin- und Butylamingruppen pro 100 Dextran-Anhydroglucoseringe wurde durch Berechnung der Verhältnisse der integrierten Signale von Dextran (δ 4,0-5,8 ppm) und Tyramingruppen (δ 6,66 und δ 6,98 ppm) bzw. von Dextran und Butylamingruppen (δ 1,4-1,5 ppm) bestimmt. Die Anzahl der konjugierten Biotin-Einheiten pro 100 Dextran-Anhydroglucoseringe wurde durch Berechnung des Verhältnisses der integrierten Signale der Tyramingruppen (δ 6,66 ppm und δ 6,98 ppm) und des gekoppelten 6-Aminocapronsäure-Spacers (δ 2.13).
Dex-TAB-Vernetzung und orthogonale Nachfunktionalisierung
Dex-TAB-Hydrogelkonstrukte wurden durch Mischen von 5% (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 Meerrettichperoxidase und 0,05% (w/v) H2O2 hergestellt. Zur orthogonalen Nachfunktionalisierung wurden die Dex-TAB-Hydrogele nacheinander mit 1 µM Neutravidin in Waschpuffer, der aus 1 % (w/v) BSA in PBS bestand, inkubiert, mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenes Neutravidin zu entfernen, mit 1 µM biotinyliertem oder desthiobiotinyliertem Molekül von Interesse in Waschpuffer inkubiert und erneut mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundene Moleküle zu entfernen. Dex-TAB/Neutravidin/Desthiobiotin-Konstrukte können anschließend mit biotinylierten Molekülen von Interesse exponiert werden, um einen gegenläufigen biochemischen Gradienten zu erzeugen. Für die Fluoreszenzmikroskopie (EVOS FL), die konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Zeiss LSM 510 und Nikon A1+) und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP; Zeiss LSM 510) wurden die Mikrogele direkt mit Streptavidin-FITC oder nach der oben beschriebenen Neutravidin-Funktionalisierung mit Biotin-atto565, Biotin-FITC und/oder Desthiobiotin-FITC funktionalisiert, das im Haus durch Kopplung von Desthiobiotin-NHS an 6-Aminofluorescein in 1 M Bicarbonatpuffer (pH 8) hergestellt wurde. Die FRAP-Kurven wurden durch Auftragen der Fluoreszenzintensität des Bleichflecks abzüglich des Hintergrunds als Funktion der Zeit, normalisiert auf die durch die Bleichrate korrigierte durchschnittliche Intensität vor dem Bleichen, ermittelt, wobei die Bleichrate durch Normalisierung der Fluoreszenzintensität der Probe neben dem Bleichfleck, normalisiert auf seine durchschnittliche Intensität vor dem Bleichen, bestimmt wurde. Zur Charakterisierung der Desthiobiotin/Biotin-Verschiebung wurden die Dex-TAB-Hydrogelkonstrukte nacheinander mit Neutravidin funktionalisiert, mit PBS gewaschen, mit Desthiobiotin-FITC funktionalisiert, mit PBS gewaschen und mit Biotin-atto565 funktionalisiert, während sie mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden. Schließlich wurden die Hydrogele mehrmals gründlich mit PBS gewaschen, um ungebundenes B-ATTO zu entfernen, und mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die relative Menge an D-FITC, die durch B-ATTO ersetzt worden war, zu quantifizieren. Das Experiment wurde mit anderen Biotinverbindungen wiederholt, um die Universalität des Ansatzes zu demonstrieren. Konkret wurden Neutravidin/D-FITC-funktionalisierte Dex-TAB-Hydrogele in Gegenwart von 1 µM Biotin, biotinyliertem Peptid (d. h. B-Peptid; Aminosäuresequenz KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), Immunglobulin G (B-IgG) oder Gold-Nanopartikeln (B-GNP) in PBS 8 Tage lang inkubiert und kontinuierlich überwacht. Die Proben wurden vor der Analyse der D-FITC-Intensität mindestens einen Tag lang gründlich mit PBS gewaschen, um ungebundene Anteile zu entfernen. Die biologische Funktion des supramolekular komplexierten B-HRP wurde mit einem DAB-Färbekit nach dem Protokoll des Herstellers bewertet. Biotinylierte 3D-Hydrogele in Knochenform wurden durch Spritzgießen von Dex-TAB in eine Form aus Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt, die mit einer Miniaturvorlage in Knochenform gefertigt wurde. Die Hydrogel-Knochen wurden durch eine anschließende Inkubation über Nacht mit 1 µM Neutravidin, PBS und 1 µM D-FITC-Lösungen homogen mit FITC funktionalisiert. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden die oberen Teile der knochenförmigen Hydrogele mit 1 µM B-ATTO im Tauchverfahren inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen, um ungebundene Fluorophore zu entfernen, und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Um die Langzeitstabilität der supramolekularen Komplexierung zu untersuchen, wurden zwei Dex-TAB-Hydrogele von etwa 5 × 5 × 5 mm ausschließlich mit D-FITC und B-FITC markiert, gründlich mit PBS gewaschen und unter Verwendung eines Zwischenprodukts aus reinem (d. h. nicht markiertem) Dex-TA durch enzymatische Vernetzung von Tyramin-Anteilen kovalent verbunden. Die kombinierten Hydrogelkonstrukte wurden dann in PBS inkubiert und 2 Wochen lang kontinuierlich mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Stabilität der desthiobiotinylierten und biotinylierten Muster zu untersuchen. Die Querschnittsintensitäten aller Fluoreszenzbilder wurden mit der Software ImageJ bestimmt.
Hydrogel-Netzwerkanalyse
Die Diffusionsanalyse wurde durchgeführt, um die Auswirkungen der Nachfunktionalisierung von Dex-TAB-Hydrogelkonstrukten mit multivalentem Neutravidin auf die Eigenschaften des Hydrogelnetzwerks zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden ursprüngliche Dex-TAB-Hydrogelkonstrukte und Konstrukte, die mit einer übermäßigen Menge an Neutravidin homogen nachfunktionalisiert wurden, mit FITC-markiertem Dextran mit den hydrodynamischen Radien RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) und RH = 27 nm (2000 kDa) kombiniert. Die Hydrogelkonstrukte in den fluoreszierenden Lösungen wurden dann mit konfokaler Fluoreszenz-Bildgebung (Zeiss LSM 510) analysiert und die Fluoreszenzintensität innerhalb und außerhalb der Konstrukte mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die relative Permeation von fluoreszenzmarkierten Dextranmolekülen in Dex-TAB wurde durch Normalisierung der Intensität mit der Fluoreszenzintensität außerhalb der Hydrogele bestimmt. Der gleiche Ansatz wurde verwendet, um die relative Permeabilität von 5% (w/v) Dex-TAB für FITC-markierte herkömmliche IgG-Antikörper und VHH zu quantifizieren und zu vergleichen.
VHH-Modifikation und Charakterisierung
Maleimid-konjugiertes Desthiobiotin wurde durch Reaktion von Amino-Maleimid und Desthiobiotin-NHS für 2 h in Bikarbonatpuffer (pH 8) synthetisiert. Desthiobiotin-Maleimid wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf einem 2545 Quaternary Gradient Module (Waters) von 90%/10% Wasser/Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure (TFA)) bis 100% Acetonitril (0,1% TFA) gereinigt. Das gesammelte Produkt wurde mit Massenspektrometrie charakterisiert; MS(ESI): m/z = 336.96 (berechnet m/z = 337.18 für C16H24N4O4). Die Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsvakuumverdampfer eingedampft, anschließend wurde das Desthiobiotin-Maleimid in milliQ-Wasser resuspendiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Desthiobiotinylierte und biotinylierte VHH wurden von QVQ BV durch Reaktion des unmodifizierten Cysteins der VHH mit Maleimid-konjugiertem Desthiobiotin bzw. Maleimid-konjugiertem Biotin synthetisiert. Mittels ELISA wurde die Affinität von nicht modifiziertem gegenüber desthiobiotinyliertem (D-@BMP7) und biotinyliertem (B-@BMP7) VHH gegenüber BMP7 untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine 96-Well-Maxisorp-Platte über Nacht bei 4 °C mit 0,5 µg ml-1 humanem BMP7 in PBS beschichtet. Die Platten wurden mit 4 % Magermilch in PBS blockiert, und verschiedene Konzentrationen (0-5 µM) von VHH wurden in 1 % Magermilch zugegeben. Der Nachweis von VHHs erfolgte mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen VHH und einem HRP-konjugierten sekundären Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen. Durch Zugabe von H2O2 zusammen mit TMB wurde die HRP-Menge durch Umwandlung in ein farbiges Produkt ermittelt. Zum Stoppen der Reaktion wurde H2SO4 zugegeben. Die spektrophotometrischen Absorptionsmessungen wurden bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Dosis-Wirkungs-Kurven wurden durch Anpassung einer logistischen Funktion an die gemessenen Daten unter Verwendung von Gleichung (4) ermittelt.
Zellkultur
C2C12-BRE-Luc-Zellen wurden in einem Kulturmedium bestehend aus 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin in DMEM kultiviert. Die Zellen wurden unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert, und das Medium wurde 2 Mal pro Woche ausgetauscht. Wenn die Zellkultur nahezu konfluiert war, wurden die Zellen mit 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA bei 37 °C abgelöst und anschließend subkultiviert oder für Experimente verwendet. Die Lebensfähigkeit von Zellen, die in enzymatisch vernetztem 5 %igem (w/v) Dex-TAB eingekapselt waren, wurde unmittelbar nach der Verkapselung (d. h. am Tag 0) sowie nach vier und sieben Tagen In-vitro-Kultur analysiert, indem die Zellen 30 Minuten lang mit 2 µM Calcein AM (lebend) und 4 µM EthD-1 (tot) in PBS inkubiert und die markierten Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wurden. Die Lebend-/Tot-Analyse wurde auch nach der Modifizierung der zellbeladenen Dex-TAB-Hydrogele mit Neutravidin, D-@BMP7 und B-@BMP7 unter Verwendung desselben Funktionalisierungsprotokolls nach der Herstellung durchgeführt, wie im vorherigen Methodenabschnitt „Dex-TAB-Vernetzung und orthogonale Nachfunktionalisierung“ beschrieben. Die Stoffwechselaktivität der Zellen wurde durch Färbung der Zellen mit 0,5 g l-1 MTT im Kulturmedium und anschließender Visualisierung mittels Hellfeldmikroskopie analysiert. Für Experimente zur BMP7-Induktion wurden die Zellen in einer Menge von 10.000 Zellen cm-2 auf Gewebekultur-Plastik ausgesät und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden 12 Stunden lang mit einem Kulturmedium mit 0,5 % (v/v) FBS ausgehungert. Nach dem Aushungern wurden vorgefertigte Dex-TAB/Neutravidin-, Dex-TAB/Neutravidin/D-@BMP7-, Dex-TAB/Neutravidin/B-@BMP7- oder Biotin-behandelte Dex-TAB/Neutravidin/D-@BMP7-Hydrogelkonstrukte in die Zellkultur gegeben, die anschließend 10 bis 15 Stunden lang 100 ng ml-1 BMP7 ausgesetzt wurden (ergänzende Abb. 12). Anschließend wurden die Zellen mit Reporter-Lysepuffer und einem einzigen Gefrier-Auftau-Zyklus lysiert. Die Luciferase-Expression wurde mit einem Luciferase-Assay nach dem Protokoll des Herstellers und einem Luminometer (Victor X3, Perkin Elmer) bestimmt. Die Luziferase-Expression wurde auf den Gesamt-DNA-Gehalt normiert, der mit dem QuantiFluor dsDNA System nach dem Protokoll des Herstellers und einem Fluorometer (Victor X3) quantifiziert wurde.
Datendarstellung und Statistik
Spektrophotometrische Absorptionsmessungen von HABA wurden an sechs Proben pro Bedingung durchgeführt und als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. SPRi-Messungen wurden an sechs Spots pro Bedingung durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben (helle Linien). Die SPRi-Messwerte der einzelnen Spots wurden gegen den Rmax-Wert der Neutravidin-Bindungskurven normalisiert, um Unterschiede in der Spotting-Dichte zu korrigieren (ergänzende Abb. 1). Die Kon-, Koff- und Kd-Werte der supramolekularen Wechselwirkungen wurden aus mindestens drei SPRi-Experimenten bestimmt und als Mittelwert ± Standardabweichung oder als Überlagerung der einzelnen Datenpunkte angegeben. FRAP-Messungen von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin wurden an mindestens vier Hydrogelkonstrukten pro Bedingung durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung, normalisiert auf die durchschnittliche Intensität vor dem Bleichen, angegeben. Die Messungen der (konfokalen) Fluoreszenzintensität (einschließlich der Zeitrafferexperimente) wurden an mindestens vier Hydrogelkonstrukten pro Bedingung durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung oder als Überlagerung einzelner Datenpunkte angegeben, die alle auf die höchste durchschnittliche Intensität normiert sind. Die lineare Regressionsanalyse wurde mit der Software OriginPro 2016 durchgeführt. Die Verdrängung von D-FITC durch biotinylierte Einheiten wurde mit Fluoreszenzmikroskopie an zehn Proben pro Bedingung gemessen. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit einer einseitigen ANOVA mit Tukeys Post-Hoc-Test untersucht (die Daten waren normal verteilt, wie der Shapiro-Wilk-Test zeigte: p > 0,1). Die Permeation von fluoreszenzmarkierten Dextranmolekülen, VHH und IgG in Dex-TAB wurde an vier Hydrogelkonstrukten pro Bedingung gemessen und als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen der VHH- und IgG-Permeabilität wurde mit einem Mann-Whitney-Test ermittelt. Die Quantifizierung der lebenden/toten Zellen wurde an drei zellbeladenen Hydrogelen pro Bedingung durchgeführt und als Durchschnittswert angegeben, der die einzelnen Datenpunkte überlagert. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit einem Kruskal-Wallis ANOVA-Test ermittelt. Dosis-Wirkungs-Analysen wurden unter Verwendung von drei Proben pro Konzentration durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung und eine überlagerte angepasste logistische Funktion auf der Grundlage von Gleichung (4) angegeben. Die Konfidenzintervalle der Dosis-Wirkungs-Kurven wurden automatisch von der Graph-Plotting-Software generiert. Die relative Induktion von C2C12-BRE-Luc-Zellen wurde an drei In-vitro-Proben pro Bedingung gemessen und als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit Kruskal-Wallis ANOVA-Tests bestimmt.
Schemata
Alle Diagramme wurden mit der Software OriginPro 2016 erstellt. Alle Diagramme wurden mit der Software ChemDraw Professional 16.0 und der Software CorelDRAW X7 erstellt.
Zusammenfassung der Berichterstattung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.