Wasserpflanze Azolla als universelles Ausgangsmaterial für die Biokraftstoffproduktion

Behandlung von synthetischem Abwasser mit Azolla filiculoides

Für das Bioremediationsexperiment wurde selenreiches synthetisches Abwasser (SeSW) durch Mischen einer hohen Konzentration von Phosphaten (PO4-P), 1.3 g/L mit einer moderaten Menge Ammoniak (NH4-N), 55 mg/L, und einer niedrigen Konzentration an Nitraten (NO3-N), 15 mg/L, gemischt wurde (Additional file 4: Table S3). Diese Zusammensetzung simuliert die Eigenschaften von Abwässern aus typischen Textilfärbe-, Ausrüstungs- und Waschmittelindustrien. Das Abwasser wurde mit 0,8 mg/L SeO2 angereichert. In diesem Versuch wurde das SeSW 5 Tage lang von A. filiculoides behandelt. Die Wachstumsraten einiger Wasserpflanzen, die auf Abwässern wachsen, steigen normalerweise exponentiell an, nachdem in den ersten 4-5 Tagen eine Verzögerungsphase zu beobachten ist, in der sich die Biomasse nicht wesentlich verändert. Dieser Zeitraum ist jedoch mit einer intensiven Aufnahme der Hauptnährstoffe aus dem Abwasser verbunden, die zu einem starken exponentiellen Wachstum der Wasserpflanzen nach der Verzögerungsphase führt. Die Entfernung von Nährstoffen im Seewasser während der ersten 5 Behandlungstage durch A. filiculoides führte nicht zu statistisch signifikanten Veränderungen (P ≤ 0,05) der Biomasseproduktion (0,3 ± 0,1 g dw). Sie führte jedoch zu einer bis zu 25,4 %igen Aufnahme von NH4-N, 69,5 %igen Aufnahme von NO3-N und 24,3 %igen Aufnahme von PO4-P aus 100 % SeSW (Tabelle 1; Abb. 1). Verdünnter (50 %) SeSW war für A. filiculoides weniger belastend, was sich in den höheren Raten der Nährstoffaufnahme widerspiegelt: 33,4, 93 und 39,8 % für NH4-N, NO3-N bzw. PO4-P. Die Absorptionsraten von Nährstoffen durch A. filiculoides wurden bereits von mehreren Forschungsgruppen berichtet.

Die Behandlung von SeSW mit A. filiculoides führte zu einer 40 %igen Aufnahme von Se aus 100 % SeSW und einer 76 %igen Aufnahme aus 50 % SeSW mit Absorptionsraten von 47,6 µg Se/L-Tag bzw. 39,9 µg Se/L-Tag (Abb. 2; Tabelle 2). Dies korrelierte mit Akkumulationsraten von 158,8 µg Se/g dw-day in A. filiculoides aus 100 % SeSW und 133,5 µg Se/g dw-day aus 50 % SeSW (Tab. 2). Diese Absorptionseffizienz entspricht 85 bzw. 83 % des theoretischen Absorptionsmaximums für 50 % SeSW bzw. 100 % SeSW. Eine annähernd ähnliche Absorptionsrate von Se wurde von einem anderen Azolla-Vertreter, Azolla caroliniana, gezeigt, der während einer zweiwöchigen Behandlung bis zu 1 mg Se/g dw aus 2,5 mg/L Se-Lösung absorbierte. Dies ist höher als bei anderen Wasserpflanzen, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) und Eichhornia (300 mg Se/g dw).

Die Überlebensrate von P. australiensis, die Verdünnungen von SeSW ausgesetzt war, ist in Zusatzdatei 5: Abbildung S2 dargestellt. Es gab keine Überlebensrate (0 %), wenn sie 96 Stunden lang 100 % unbehandeltem (Kontroll-)SeSW ausgesetzt waren. Es wurden auch keine lebenden Garnelen in 80 % oder 50 % SeSW beobachtet. Nach der Behandlung mit A. filiculoides wurde die Toxizität des SeSW um das 2,6-fache reduziert, wobei die LC50 von 11,22 auf 29,80 % anstieg. Dies deutet darauf hin, dass bei der Behandlung von 100 % SeSW mit A. filiculoides die Toxizität nach nur 5 Tagen Behandlung signifikant reduziert wurde.

Biokraftstoffproduktion aus Azolla

Ultimat- und Proximatanalysen von Azolla filiculoides

Die Ergebnisse der Proximat- und Ultimatanalysen der A. filiculoides-Probe, einschließlich des Gesamtgehalts an flüchtigen Bestandteilen, Feuchtigkeit, festem Kohlenstoff und Asche (d. h. anorganische Bestandteile der Proben), sind in Zusatzdatei 6: Tabelle S4 zusammengefasst. Die bei 950 °C gesammelten flüchtigen Bestandteile machen 88 % des Gesamtprodukts aus. Das Gesamtprodukt enthielt 11 % Feuchtigkeit, 7,3 % Asche und 4,4 % festen Kohlenstoff. Die Primäranalyse ergab, dass die Schlüsselelemente 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O und 0,2 % S (berechnet durch Differenz) umfassen.

Thermogravimetrische Analysen von Azolla filiculoides

Die TGA-DTG-Analyse der A. filiculoides-Probe wurde in einem Temperaturbereich von 23-900 °C mit einer Aufheizrate von 10 °C/min unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt und ist in Abb. 3 dargestellt. Die TGA- und DTG-Kurven zeigten die drei Phasen der Zersetzung von A. filiculoides während des Pyrolyseprozesses; ähnliche Ergebnisse wurden von Agrawal und Chakraborty berichtet. Die Biomasse durchlief drei Phasen des Gewichtsverlusts, eine zwischen 154 und 160 °C, die zweite bei 180 und 580 °C und die dritte bei etwa 580 und 900 °C. Der erste Bereich stellt einen leichten Gewichtsverlust (7 %) dar, der durch die Dehydratisierung der Biomasseprobe verursacht wird. Der größte Teil des Gewichtsverlusts (51 %) aufgrund der Pyrolyse findet in der zweiten Zone statt, wo die meisten flüchtigen Bestandteile freigesetzt werden; der starke Peak zeigt die Zersetzung von Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden an. In der dritten Zone findet die Zersetzung des kohlenstoffhaltigen Produkts statt, so dass der Gewichtsverlust hauptsächlich auf die Vergasung zurückzuführen ist, bei der aufgrund der hohen Temperaturen nichtflüchtige Kohlenstoffverbindungen verdampfen und CO und CO2 bilden.

Hydrothermale Verflüssigung von Azolla filiculoides

Die hydrothermale Verflüssigung von A. filiculoides wurde mit destilliertem Wasser als Lösungsmittel bei 260, 280 und 300 °C mit Verweilzeiten von 15 min durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen wurden auf der Grundlage unserer früheren Studien und der Literatur ausgewählt, um die Auswirkungen der Temperatur auf die Ausbeute an Bioölprodukten aus A. filiculoides in unterkritischem Wasser zu verstehen. Die Produktverteilung der HTL-behandelten A. filiculoides-Probe ist in Abb. 4 dargestellt. Die Gesamtausbeute an Bioöl betrug 15,83, 21,50 und 16,0 % bei 260, 280 bzw. 300 °C; die höchste Ausbeute wurde bei 280 °C erzielt. Das gesamte Bioöl setzte sich zusammen aus der Etherfraktion (Bioöl1), die durch Extraktion des flüssigen Anteils gewonnen wurde, und der Acetonfraktion (Bioöl2), die durch Extraktion des festen Anteils gewonnen wurde (Abschnitt „Methoden“). Bioöl2 wies eine hohe Viskosität auf und erwies sich als teerartige Flüssigkeit. Die Ausbeute an festen Rückständen nahm kontinuierlich von 66,83 % auf 33,83 % ab, als die Temperatur von 260 °C auf 300 °C anstieg. Die Ausbeute der Gase nahm beim Übergang von 260 auf 280 °C ab. Bei einer Temperatur von mehr als 280 °C stieg die Gasausbeute auf 7,1 %. Bei der HTL-Verbrennung von A. filiculoides-Biomasse ergab sich eine ähnliche Verteilung der beiden Hauptprodukte Biogas und Biokohle wie bei der Pyrolyse mit einem durchschnittlichen Biogasanteil von 6,05 % bzw. 12 % bei der HTL und der Pyrolyse und einem Biokohleanteil von etwa 50 % bei beiden. Bei der HTL wurde ein höherer Anteil an Bioöl erzeugt, nämlich bis zu 21,5 % (14 % bei der Pyrolyse). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn man die Ausbeuten an Bioöl vergleicht, die sowohl bei der Pyrolyse als auch bei der HTL von Mikroalgen erzielt wurden.

Zusätzlich zu den Materialbilanzdaten wurde die Umwandlung auf der Grundlage des gesamten organischen Kohlenstoffs (TOC) untersucht, der nach der hydrothermalen Verflüssigung bei verschiedenen Temperaturen erhalten wurde, und die Ergebnisse sind in Zusatzdatei 7: Tabelle S5 dargestellt. Der Anteil des organischen Kohlenstoffs im Ausgangsmaterial betrug 46,9 %, was 2,8 g organischen Kohlenstoffs in den 6 g der für die hydrothermale Verflüssigung verwendeten Probe entspricht. Die Umwandlung des organischen Kohlenstoffs stieg von 13,93 auf 48,93 % mit der Erhöhung der Temperatur von 260 auf 300 °C. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zersetzung der Biomasse bei einer niedrigeren Temperatur unvollständig war und eine große Menge nicht umgesetzter Biomasse zurückblieb, die die Bioölbildung unterdrücken kann. Die Erhöhung der Temperatur konnte den Abbau des Ausgangsmaterials beschleunigen und die Bioölbildung begünstigen; eine weitere Erhöhung der Temperatur, die in unseren Versuchen über 280 °C lag, führte jedoch dazu, dass das zuvor gebildete Bioöl bzw. die Zwischenprodukte zu Gasen und wasserlöslichen Produkten abgebaut wurden, was zu einem Rückgang der Bioölausbeute führte. Die abnehmende Ausbeute an festem Rückstand (Biokohle) deutete auf eine Erhöhung des Gesamtumsatzes der Biomasse hin, wenn die Temperatur von 260 auf 300 °C erhöht wurde.

Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie von Bioöl

FT-IR-Spektren der A. filiculoides und des aus HTL bei 260, 280 und 300 °C gewonnenen Bioöls1 sind in Abb. 5A und B dargestellt. Die breite Bande bei etwa 3200-3405 cm-1 wird der O-H- oder N-H-Streckschwingung zugeschrieben, die durch Wasser oder O-H- oder N-H-Gruppen im Bioöl verursacht wird (Abb. 5B). Eine breite Absorption wurde bei etwa 3314 cm-1 für das Rohmaterial angezeigt, was auf einen hohen Gehalt an Kohlenhydraten und Proteinen hinweist (Abb. 5A).

Die Bioöle zeigten eine schwächere Absorption bei 3200-3405 cm-1, was darauf hindeutet, dass sowohl Kohlenhydrate als auch Proteine im HTL-Prozess zersetzt wurden (Abb. 5B). Die Banden von 2854 bis 2950 cm-1 waren bei allen Bioölen aufgrund der C-H-Streckschwingungen stärker, was auf das Vorhandensein von C-H-Alkylgruppen hinweist. Die C=O-Streckschwingung bei 1645-1720 cm-1 in den Bioölen deutet auf das Vorhandensein von Ketonen, Aldehyden, Estern oder Säuren hin. Die Biegeschwingungsbanden bei 1580-1650 cm-1 weisen auf das Vorhandensein von N-H-Gruppen von Aminen hin. Die Banden im Bereich von 1430 bis 1480 cm-1 wurden den in den Bioölen vorhandenen α-CH2-Biegeschwingungen zugeschrieben. Das Vorhandensein von C-N-Streckungsbanden bei 1266-1342 cm-1 in den Bioölen ist auf aromatische Amingruppen zurückzuführen. Auch einige andere Absorptionsspitzen bei 780-850 cm-1 sind auf die C-H-Biegeschwingungen von Aromaten zurückzuführen. Die Bande bei 1040 cm-1 erschien nur im Absorptionsprofil des Futters von A. filiculoides und könnte auf C-O in Verbindung mit Hydroxylgruppen zurückzuführen sein, die nach der Verflüssigung dehydriert wurden. Insgesamt zeigen die Spektren der Bioöl1-Proben aus dem HTL bei den verschiedenen Temperaturen die gleichen Peaks, was auf das Vorhandensein der gleichen funktionellen Gruppen hinweist, und waren die verschiedenen Peaks, die in den NMR-Spektren erhalten wurden.

NMR-Analyse des Bioöls

Die NMR-Analyse der Bioöl1-Proben wurde durchgeführt, um die Verhältnisse der chemischen Umgebungen der Protonen zu verstehen. Die NMR-Spektren lieferten ergänzende Informationen über die funktionellen Gruppen zu den FTIR-Spektren und ermöglichten die Quantifizierung und den Vergleich der Integrationsbereiche zwischen den Spektren. Ähnlich wie die FT-IR-Spektren zeigten die 1H-NMR-Spektren einen hohen Anteil aliphatischer funktioneller Gruppen für alle Bioöle, und eine Zusammenfassung der integrierten Peakflächenbereiche, die verschiedenen funktionellen Gruppenklassen zugeordnet wurden, ist in Abb. 6 dargestellt. Der oberste Bereich der Spektren, von 0,5 bis 1,5 ppm, repräsentiert aliphatische Protonen, die an Kohlenstoffatome gebunden sind, die mindestens zwei Bindungen von einem C=C oder Heteroatom (O oder N) entfernt sind. Der nächste integrale Bereich von 1,5 bis 3,0 ppm steht für Protonen an aliphatischen Kohlenstoffatomen, die an eine C=C-Doppelbindung gebunden sein können. Alle Bioöle hatten einen höheren Anteil an Protonen im Spektralbereich von 0,5 bis 3,0 ppm. Sie hatten einen höheren Prozentsatz (63,15-71,76 %) an Protonen im Bereich von 0,5 bis 1,5 als im Bereich von 1,5 bis 3,0 (18,73-28,8 %), was möglicherweise auf die große Anzahl von stickstoffhaltigen und sauerstoffhaltigen Verbindungen zurückzuführen ist, die nachweislich in diesem Bereich mitschwingen, was möglicherweise auf den hohen Proteingehalt des Ausgangsmaterials zurückzuführen ist.

Der nächste Teil des 1H-NMR-Spektrums bei 3,0-4,5 ppm repräsentiert Methoxylprotonen oder eine Methylengruppe, die zwei aromatische Ringe verbindet; in diesem Bereich wurden sehr niedrige Protonenanteile beobachtet. Alle Bioöle wiesen einen geringen Anteil an Methoxy-/Kohlenhydratfunktionalität auf (4,5-6,0 ppm). In diesem Bereich lagen die maximalen Protonenprozentwerte der Bioöle bei 4,33 und 4,32 % für die Verflüssigung bei 260 und 280 °C, der deutlich niedrigere Wert von 0,94 % für die Verflüssigung bei 300 °C. Der Bereich des Spektrums zwischen 6,0 und 8,5 ppm entspricht dem aromatischen Bereich. Der maximale Protonengehalt von etwa 7,2 % in diesem Bereich wurde für das bei 300 °C hergestellte Bioöl ermittelt. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der FT-IR-Spektroskopie wurde in allen Bioölen eine aromatische/heteroaromatische Funktionalität beobachtet (6,0-8,5 ppm). Die Spektralbereiche im unteren Feld (8,5-10 ppm) stammen von den Aldehyden. Die Aldehydfunktionalität (9,5-10,0 ppm) war in allen Bioölen nicht vorhanden, trotz der im FT-IR beobachteten funktionellen C=O-Gruppen (1645-1720 cm-1). Das Auftreten solcher FT-IR-Banden kann auch auf andere carbonylhaltige Gruppen wie protonierte Carbonsäuren, Carbonsäureester, Amide und Ketone zurückzuführen sein.

GC-MS-Analyse des Bioöls

GC-MS wurde eingesetzt, um die Zusammensetzung des flüssigen Produkts besser zu verstehen und die Ergebnisse der FT-IR- und NMR-Analysen zu bestätigen. Die GC-MS zeigte deutlich, dass die Verflüssigungstemperatur die Bestandteile des Bioöls beeinflusst1. Die Identifizierung der Hauptpeaks der Verbindungen wurde mit Hilfe der NIST-Massenspektraldatenbank durchgeführt. Die HTL-Experimente ergaben Bioöle, die aus der Zersetzung von Lignin, Proteinen, Flavonoiden und Lipiden sowie einer Reihe von aus Kohlenhydraten gewonnenen Verbindungen entstanden. Die Bestandteile der Bioöle wurden als mono- und polyzyklische aromatische Verbindungen, Ketone, Aldehyde, Ester, Alkohole, Amide und andere stickstoffhaltige Verbindungen (einschließlich Amide und N-heterozyklische Verbindungen) sowie Kohlenwasserstoffe identifiziert. Es wurde eine halbquantitative Analyse durchgeführt, indem der relative Prozentsatz der Fläche der chromatographischen Peaks berechnet wurde; die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die wichtigsten Verbindungen, die bei der hydrothermalen Verflüssigung von A. filiculoides waren Methylpyrazin, 2-Methyl-2-cyclopenten-1-on, Phenol, 2-Methoxyphenol, 3-Pyridinol, Catechol, l-Prolin, N-Butoxycarbonylbutylester, Bis(2-ethylhexyl)phthalat und beta-Sitosterol. Da die Temperatur der hydrothermalen Verflüssigung zwischen 260 und 300 °C schwankte, wurden unterschiedliche Verbindungen sowie unterschiedliche Anteile an Verbindungen erzeugt. Der Flächenanteil der phenolischen Verbindungen wie Phenol (6,1-18,8 %) und Catechol (10,0-15,7 %) nahm mit der Erhöhung der Temperatur von 260 auf 280 °C zu, sank dann aber auf 11,1 % für Phenol und 11,8 % für Catechol bei 300 °C. Die Phenole im Bioöl aus A. filiculoides wurden wahrscheinlich aus dem Lignin- oder Kohlenhydratanteil der Biomasse gebildet. Stickstoffhaltige Verbindungen werden durch Decarboxylierung, Deaminierung, Dehydratisierung, Depolymerisierung und Zersetzungsreaktionen von Proteinen gebildet. Die höchste prozentuale Fläche von 3-Pyrindiol (13,3 %) wurde bei der niedrigsten Temperatur von 260 °C beobachtet und sank auf 11,9 bzw. 10,1 % bei 280 bzw. 300 °C. Darüber hinaus wurden die höchsten Flächenanteile (13,6, 12,4 und 8,7 %) bei 260, 280 und 300 °C beobachtet. Da die Zusammensetzung des flüssigen Produkts so komplex ist, wäre eine weitere Veredelung, wie z. B. Denitrogenierung und Desoxygenierung, erforderlich, um das Bioöl für Motorkraftstoffe geeignet zu machen.

Die Zusammensetzung der Moleküle im Bioöl aus HTL wurde mit dem Spektrum der Moleküle verglichen, die im durch Pyrolyse erzeugten Bioöl identifiziert wurden. Im Gegensatz zur HTL ist die Pyrolyse die thermochemische Zersetzung von trockenem organischem Material mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10 % Massenanteil in Abwesenheit von Sauerstoff, bei atmosphärischem Druck und höheren Temperaturen (350-550 °C). Beide thermochemischen Verfahren zeigten ein großes Potenzial für die Umwandlung der gesamten Azolla-Biomasse in Bioöle, die eine höhere Energiedichte aufweisen als die ursprüngliche Biomasse. Bioöle aus beiden thermochemischen Reaktionen weisen eine sehr komplexe Zusammensetzung auf, die auf die Depolymerisation und Zersetzung von Biomassemonomeren durch Spaltung, Dehydratisierung, Decarboxylierung und Desaminierung zurückzuführen ist. Bei den aus Proteinen gewonnenen Verbindungen handelte es sich um Phenole, Alkylphenole, Pyrrolidinon, Indol und Nitril, die aus der Zersetzung der in Azolla enthaltenen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin stammen. Zu den aus Lipiden gewonnenen Produkten gehörte eine Reihe von langkettigen gesättigten Alkanen und Fettsäuren mit einer Größe von C12 bis C21: Dodekan, Tridekan, Tetradekan, Pentadekan, Hexadekan, Heptadekan, Oktadekan, Nonadekan, Eicosan und Henicosan. Ein ähnliches Gemisch aus langkettigen, aus Lipiden gewonnenen Alkanen wurde bei der Pyrolyse von Algen gefunden. Der Hauptunterschied bestand darin, dass die Pyrolyse von A. filiculoides eine Anhäufung von Phytol, 3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, einem azyklischen Diterpenalkohol, zeigte, da das Produkt des Abbaus von Chlorophyll das häufigste Pyrolyseprodukt war.

Analyse der Biorückstandsprodukte

Abbildung 7 zeigt die FT-IR-Spektren des Azolla-Futtermittels und der Biorückstände. Die breiten Banden bei 3200-3405 cm-1 sind den Streckschwingungen von wasserstoffgebundenen O-H-Gruppen und N-H-Gruppen zuzuordnen und weisen auf das Vorhandensein von Polysacchariden, Kohlenhydraten und Proteinen im Azolla-Futter hin. Ursprüngliche Azolla-Futtermittel weisen starke Streckschwingungspeaks auf, die den O-H- und N-H-Gruppen entsprechen, aber diese Durchlässigkeit nimmt mit dem Biorest ab. Der Peak bei 1030 cm-1 ist im Biorückstand verschwunden. Der Peak bei 1600-1620 cm-1, der der N-H-Biegeschwingung entspricht, war im Azolla-Futter und im Azolla-Biorest vorhanden. Die Peaks zwischen 2800 und 2930 cm-1 in den Spektren der Rückstände wurden viel schwächer als die im Azolla-Rohfutter. Das Vorhandensein eines einzelnen Peaks bei 1590 cm-1, der der C=C-Streckung zugeschrieben wird, deutet auf die Bildung von aromatischem Bio-Kohlehydrat hin.

Die Röntgenpulverdiffraktogramme (XRD) von A.filiculoides-Einsatzmaterial und -Rückständen bei verschiedenen Temperaturen zeigten keine signifikanten Unterschiede im Röntgenpulver-Diffraktogramm (Zusatzdatei 8: Abbildung S3). Die bei verschiedenen Temperaturen erhaltenen Biomasse-Einsatzstoffe und -Rückstände wiesen eine typische amorphe Beschaffenheit auf, was darauf hindeutet, dass die Struktur des Kohlenstoffs in den Rückständen aus hochkonjugierten aromatischen Blättern besteht, die auf zufällige Weise vernetzt sind. Morphologische Veränderungen waren in den rasterelektronenmikroskopischen (REM) Bildern der Azolla und des Biorückstandes zu erkennen (Zusatzdatei 9: Abbildung S4). Die Bilder des Biorückstands, der durch hydrothermale Verflüssigung der drei Azolla-Biokohlen gewonnen wurde, zeigten, dass der Rückstand von Natur aus schwammig war und keine geordnete poröse Struktur aufwies.

Wasserstoffproduktion aus säurebehandelter Azolla-Biomasse durch Enterobacter cloacae DT-1

Unter Wärme-H2SO4-Vorbehandlung wurde A. filiculoides-Biomasse zu verschiedenen löslichen reduzierten Zuckern hydrolysiert, die hauptsächlich aus Glucose (1,18 g/L), Xylose (1,39 g/L) und Arabinose (0,063 g/L) bestehen. Das säurebehandelte Vorhydrolysat diente als Ausgangsmaterial für die Wasserstoffproduktion durch Enterobacter cloacae (E. cloacae) im Chargenbetrieb bei verringertem Partialdruck pH2. pH2 beeinflusst die Effizienz der Wasserstoffausbeute bei der fermentativen Wasserstoffproduktion durch anaerobe Bakterien erheblich, da die Wasserstoffproduktionswege empfindlich auf die Wasserstoffkonzentration reagieren, was zur Hemmung der Endprodukte führt. Es wurde berichtet, dass ein hoher Wasserstoffpartialdruck zur Produktion von mehr reduzierten Produkten wie Ethanol und Laktat anstelle von Acetat, Butyrat und H2 führt. Der Batch-Fermenter war so angeordnet, dass ein Druck auf den Kopfraum des Fermenters ausgeübt wurde, der es dem Biogas ermöglichte, unmittelbar nach seiner Entstehung aus dem Kopfraum zu entweichen, wodurch der Gesamtpartialdruck und damit der Wasserstoffpartialdruck des Batch-Fermenters verringert wurde.

Die Fermentation mit E. cloacae DT-1 führte zur Produktion von 53 mmol/L Wasserstoff (Tabelle 4). Während der fermentativen Wasserstoffproduktion sank der endgültige pH-Wert der Fermentationsbrühe von 7,5 auf 5,42, was auf die Produktion kurzkettiger organischer Fettsäuren zurückgeführt werden kann. Die Gesamtproduktion an flüchtigen Fettsäuren betrug 1150 mg/L, die sich größtenteils aus Essigsäure (986 mg/L) und Buttersäure (161 mg/L) zusammensetzte, mit einem B/A-Verhältnis von 0,165. Der DT-1-Stamm folgte also dem gemischten Säureweg und verwertete die C5-Zucker (Xylose, Arabinose und Glucose) aus dem säurebehandelten Vorhydrolysat effektiv. Die Effizienz der Wasserstoffausbeute betrug 2,43 Mol H2/Mol reduzierender Zucker. Da die maximale theoretische Wasserstoffausbeute bei der Dunkelfermentation 4 mol H2/mol Glucose beträgt, wurden etwa 60 % der maximal möglichen Wasserstoffausbeute aus dem säurebehandelten Biomasse-Prehydrolysat gewonnen. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht über die Wasserstoffproduktion aus A. filiculoides-Biomasse-Zuckern.

Wasserstoffproduktion aus enzymatisch behandelter Azolla-Biomasse durch E. cloacae DT-1

Die enzymatische Hydrolyse von säurebehandelter A. filiculoides-Biomasse setzte Glucose und Xylose in einer Konzentration von 1,49 bzw. 0,181 g/L frei. Aus den enzymatisch hydrolysierten Zuckern der Biomasse wurden etwa 34,8 mmol/l volumetrischer Wasserstoff (bei verringertem pH2) gewonnen. Der endgültige pH-Wert der Fermentationsbrühe fiel während der Wasserstoffproduktion auf 5, was mit der Produktion von Essigsäure (990 mg/L) und Buttersäure (164 mg/L) einherging. Die gesamte VFA-Konzentration betrug 1156 mg/L und das B/A-Verhältnis lag bei 0,165 (Tabelle 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Weg der Mischsäurefermentation beschritten wurde. Die Effizienz der Wasserstoffausbeute betrug 2,04 mol H2/mol reduzierender Zucker und war damit niedriger als die aus dem säurebehandelten Vorhydrolysat gewonnene. Insgesamt lag die Effizienz der Wasserstoffausbeute des DT-1-Stammes aus Azolla filiculoides-Biomasse bei 2,2 ± 2 mol/mol reduzierendem Zucker. Die Effizienz der Wasserstoffproduktion aus Azolla ähnelt derjenigen, die für terrestrische lignozellulosehaltige Ausgangsstoffe erzielt wurde, die den Bereich von 044-2,76 mol H2/mol Zucker abdecken (Additional file 1: Tabelle S1, Additional file 10: Tabelle S6).

Das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C/N) der Biomasse ist für eine effiziente anaerobe Vergärung wichtig, da Mikroorganismen für eine optimale Wasserstoffproduktion deutlich mehr C als N benötigen (C:N von 25:1). Aus diesem Grund ist die Verwendung von Mikroalgen für die Wasserstoffproduktion begrenzt, da sie reich an Proteinen sind und ein niedriges C/N-Verhältnis (durchschnittlich 4) haben. Die Co-Fermentation mit Makroalgen (wie Laminaria digitata), die reich an Kohlenhydraten mit einem hohen C/N-Verhältnis sind, verbessert die Leistung der Wasserstoffproduktion. A. filiculoides enthält 41 % Gesamtkohlenhydrate und 20 % Proteine, so dass die proximale Analyse der Biomasse ein C/N-Verhältnis von 15 ergab (Additional file 6: Tabelle S4), was einem effizienten Ausgangsmaterial für die Biowasserstoffproduktion nahe kommt.

Ethanolproduktion aus Azolla filiculoides und A. pinnata

Die chemische Analyse der Biomassen von A. filiculoides und A. pinnata ist in Additional file 3: Tabelle S2 dargestellt. A. filiculoides wies eine hohe Konzentration an Biomolekülen auf, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Bioethanol verwendet werden können: Stärke (6,05 %), Cellulose (21,8 %) und Hemicellulose (13,5 %). Der Ligningehalt ist mit 10,3 % höher als bei Wasserlinsen und anderen Wasserpflanzen, aber niedriger als bei den wichtigsten lignozellulosehaltigen Bioenergiepflanzen (Additional file 1: Table S1). Die chemische Analyse von A. pinnata ergab eine geringere Konzentration von Bioethanol produzierenden Molekülen: Stärke (4,7 %), Zellulose (12,8 %) und Hemizellulose (10,1 %) und einen höheren Ligningehalt (bis zu 13,2 %).

Die Stärkekomponente von A. filiculoides und A. pinnata wurde enzymatisch durch α-Amylase und α-Amyloglucosidase hydrolysiert, die Cellulose-/Hemicellulose-Komponenten wurden durch Cellulase und Cellobiase hydrolysiert. Die Mengen an freigesetzter Glukose sind in Tabelle 5 aufgeführt. Erwartungsgemäß ergab die Kombination von vier Enzymen bei der Hydrolyse von A. filiculoides-Biomasse eine höhere Glukosemenge als bei A. pinnata (bis zu 65,9 bzw. 29,5 g/L). Diese Glukoseausbeute war viel höher als nach der Behandlung der Biomasse von A. filiculoides mit einer Suspension von lebendem Aspergillus niger, der auf Kartoffeldextrosebrühe gewachsen war (2,5 g/L Glukose), wie von Pandey et al. gezeigt wurde.

Nach der Fermentation von reduzierten Zuckern mit Saccharomyces cerevisiae spiegelten die Ethanolausbeuten YE/G (Ethanol/Glukose, g/g) die Menge an freigesetzter Glukose in den Proben wider, wobei Ausbeuten von 0,56 g/g für A. filiculoides und 0,28 g/g für A. pinnata beobachtet wurden. Die Ausbeute von 0,56 g/g ist vergleichbar mit derjenigen, die bei der Fermentation von Wasserlinsen-Hydrolysaten und einigen Energiepflanzen erzielt wurde (Additional file 1: Table S1). Interessanterweise zeigte die Ergänzung der Fermentation mit zusätzlichen Nährstoffen keine signifikante Steigerung des Ethanolertrags (nicht gezeigt). Dies lässt sich durch das Vorhandensein der Hauptnährstoffe für das Hefewachstum in der Biomasse beider Azolla-Arten erklären.

Die Ethanolausbeute auf der Basis von A. filiculoides-Biomasse (YE/B) wurde mit 0,09 g/g bestimmt, was der Ausbeute von S. cerevisiae ATCC 24859 ähnelt, die auf der Wasserlinse L. minor gewachsen ist, die im Durchschnitt 10 % Stärke enthält. Eine höhere Ethanolausbeute, nämlich 0,19 g/g, wurde für den Stamm 6000 von Lemna aequinoctialis beobachtet, der eine schnelle Wachstumsrate und die Fähigkeit zur Akkumulation hoher Mengen an Stärke (bis zu 39 %) aufweist. Das Potenzial eines anderen Vertreters der Wasserlinsen, Spirodela polyrrhiza, seinen Stärkegehalt unter Stressbedingungen auf bis zu 45,7 % zu erhöhen, führte zusammen mit der enzymatischen Hydrolyse mit α-Amylase, Pullulanase und α-Amyloglucosidase zu einem YE/B-Wert von 0,28 g/g. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände und die geringere Stärkeanreicherung waren wahrscheinlich der Grund für die geringere Ethanolausbeute aus A. pinnata-Biomasse (YE/B = 0,05 g/g). Die Verwendung verschiedener Hefestämme, die das Spektrum der freigesetzten Zucker besser vergären können und toleranter gegenüber potenziellen Hemmstoffen sind, wird der nächste Schritt zur Optimierung der Ethanolausbeute aus Azolla-Biomasse sein.

Azolla als universeller Rohstoff für die Biokraftstoffproduktion

Eine systematische Analyse von Landpflanzen auf ihr Potenzial als ideale Bioenergiepflanzen führte zu einer Reihe wichtiger Auswahlkriterien, zu denen gehören: (1) chemische Zusammensetzung und hoher Anteil an Biokraftstoff produzierenden Molekülen; (2) hohe Wachstumsraten/Biomasseproduktion; (3) hoher Ernteindex/Umtriebszeit; (4) Fähigkeit, auf marginalen Böden zu wachsen und fehlende Konkurrenz mit landwirtschaftlichen Kulturen um Ackerland; (5) hohe Süßwassernutzungseffizienz und niedrige Wachstumskosten; (6) niedrige Erntekosten; und (7) Produktion von hochwertigen Nebenprodukten. Diese Kriterien haben eine intensive Suche nach der nächsten Generation von Energiepflanzen ausgelöst.

Azolla-Arten haben zusammen mit ihrem evolutionären Cyanobakterien-Symbionten, A. azollae, die Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie alle oben genannten Kriterien erfüllen können. Erstens enthält die Biomasse von Azolla wichtige Arten von Energiemolekülen, darunter Zellulose/Hemizellulose, Stärke und Lipide, die Kombinationen aus lignozellulosehaltigen, stärke- und ölproduzierenden terrestrischen Bioenergiepflanzen und Mikroalgen/Cyanobakterien ähneln. Zweitens sind sie mit einer Verdopplung ihrer Biomasse alle 5-6 Tage und einer hohen Jahresproduktivität eine der am schnellsten wachsenden Pflanzen und stehen bei der Biomasseproduktion nach den Mikroalgen an zweiter Stelle. Ähnlich wie bei Mikroalgen ist ihre Biomasseproduktion nicht saisonal. Drittens kann Azolla außerhalb ihres natürlichen Lebensraums effizient angebaut werden, wobei Abwasser als Hauptnährstoffquelle dient. Die Bioremediation von Abwässern kann zu einer Aufnahme von bis zu 2,6 bzw. 0,434 t/ha-Jahr an Gesamt-N und -P führen. Azolla kann auch in nährstoffarmen Medien effizient wachsen und durch die Symbiose mit A. azollae bis zu 0,4 t N/ha-Jahr Stickstoff aus der Atmosphäre aufnehmen. Viertens: Sie sind leicht zu ernten. Und schließlich werden Azolla-Arten seit Jahrzehnten als Stickstoff-Biodünger und Vieh-/Fischfutter verwendet (aufgrund ihres hohen Protein- und Kohlenhydratgehalts). Da für den Anbau von Azolla keine synthetischen Stickstoffdünger verwendet werden müssen, hat dies einen erheblichen positiven Einfluss auf die Verringerung der Entstehung von Lachgas (N2O), dessen Einfluss auf die Erwärmung der Atmosphäre fast 300 Mal so groß ist wie der von Kohlendioxid.

Thermochemische Technologien

Azolla-Biomasse wurde als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Bioöl, Biokohle und Biogas mit Hilfe von zwei thermochemischen Technologien, der Pyrolyse und der HTL, verwendet (diese Arbeit). Angesichts der hohen Jahresproduktivität von Azolla führt dies zu einer theoretischen Produktion von Bioölen auf Pyrolyse- und HTL-Basis, die auf bis zu 13,2 bzw. 20,2 t/ha-Jahr geschätzt wird. Beide Bioöle enthalten eine Reihe von petrochemischen Stoffen, die direkt als glycerinfreie Bestandteile von Biodiesel verwendet oder mit Hilfe einiger etablierter Technologien zu Biokraftstoffen aufbereitet werden können. Beide thermochemischen Technologien können auch Biofeststoffe wie Biokohle und Asche (bis zu 48 t/ha-Jahr für beide) erzeugen, die zur Verbesserung der Bodenqualität verwendet werden können, indem sie die Nährstoff- und Feuchtigkeitsspeicherkapazität erhöhen, mikrobielle Gemeinschaften unterstützen und die Wurzelaktivität fördern. Die Asche von Azolla enthält alkalische Elemente (Li, Na, K, Mg, Ca) sowie Mikroelemente wie Fe, Mn und Cu, was sie zu einem guten Kandidaten für die Verwendung als Düngemittel macht.

Biodieselproduktion

Bei Anbau auf Abwässern kann der jährliche theoretische Ertrag an Rohfetten aus A. filiculoides auf 1,68 t/ha-Jahr geschätzt werden. Diese Menge kann auf 8 t/ha-Jahr gesteigert werden, wenn die Pflanze unter natürlichen Bedingungen mit einer Produktivität von etwa 100 t dw/ha-Jahr wächst. Diese Ölproduktivität ist deutlich höher als die von Sojabohnen (0,44 t/ha-Jahr), Sonnenblumen (0,78 t/ha-Jahr), Raps (1,17 t/ha-Jahr) und Ölpalmen (6,0 t/ha-Jahr), aber niedriger als der theoretische Ertrag von Mikroalgen (bis zu 73 t/ha-Jahr, für Nannochloropsis sp.). Da Azolla/A. azollae eine Reihe von C16:0-, C18:2- und C18:3-Fettsäuren enthalten, bedeutet ihre Umwandlung in Methylester, dass der resultierende Biodiesel die entscheidenden Anforderungen der Norm EN14214 an Kraftstoffdichte, Cetanzahl und Jodzahl für Biodiesel erfüllt.

Ethanolproduktion

Die theoretische Ethanolproduktion aus A. filiculoides liegt bei 9,3 t/ha-Jahr (11,7 × 103 L/ha/Jahr, basierend auf dem spezifischen Ethanolvolumen = 0,789 g/mL), was niedriger ist als die Ethanolproduktion aus Zuckerrohr (25 × 103 L/ha-Jahr), nahe an der aus Maisstroh (13.31 × 103 L/ha-Jahr), aber höher als die von Miscanthus (2,3 × 103 L/ha-Jahr), Weide (0,3 × 103 L/ha-Jahr) und Pappel (1,3 × 103 L/ha-Jahr) (Additional file 1: Table S1).

Biowasserstoffproduktion

Die hohe Ausbeute der Biomasseproduktion, die chemische Zusammensetzung (C/N-Verhältnis) und der hohe Biowasserstoffertrag von 2.2 mol/mol Substrat machen Azolla zu einem konkurrenzfähigen Rohstoff für die Wasserstoffproduktion im Vergleich zu anderen Bioenergiepflanzen (Additional file 1: Table S1, Additional file 10: Table S6).