Efectos de la temperatura y la humedad relativa en la viabilidad del coronavirus del SRAS

Abstract

Se supone que la principal vía de transmisión de la infección por el CoV del SRAS son las gotas respiratorias. Sin embargo, el virus también es detectable en otros fluidos corporales y excrementos. Se estudió la estabilidad del virus a diferentes temperaturas y humedad relativa sobre superficies lisas. El virus desecado sobre superficies lisas conservó su viabilidad durante más de 5 días a temperaturas de 22-25°C y una humedad relativa del 40-50%, es decir, los típicos ambientes con aire acondicionado. Sin embargo, la viabilidad del virus se perdió rápidamente (>3 log10) a temperaturas más elevadas y una mayor humedad relativa (por ejemplo, 38°C y una humedad relativa de >95%). La mayor estabilidad del coronavirus del SRAS en un entorno de baja temperatura y baja humedad puede facilitar su transmisión en la comunidad de la zona subtropical (como Hong Kong) durante la primavera y en entornos con aire acondicionado. También puede explicar por qué algunos países asiáticos de la zona tropical (como Malasia, Indonesia o Tailandia) con un entorno de alta temperatura y alta humedad relativa no tuvieron grandes brotes comunitarios de SRAS.

1. Introducción

El síndrome respiratorio agudo severo (SRAS), fue una nueva enfermedad emergente asociada a la neumonía grave y se extendió hasta implicar a más de 30 países de los 5 continentes en 2003. Se identificó un nuevo coronavirus como su causa. El SRAS tuvo un impacto dramático en los servicios de salud y en las economías de los países afectados, y la tasa de mortalidad general se estimó en un 9%, pero se elevó al 50% en los mayores de 60 años . Una característica notable de esta enfermedad fue su predilección por la transmisión en el entorno sanitario y a los contactos familiares y sociales cercanos. Se supone que la enfermedad se transmite por gotitas y por contacto directo o indirecto, pero la importancia relativa de estas vías de transmisión no está clara en la actualidad. Un estudio demostró que era posible la generación de aerosoles virales por parte de un paciente con SRAS y, por tanto, la transmisión por gotitas en el aire era una posible vía de contagio. Sin embargo, el papel de los fómites y la contaminación ambiental en la transmisión de la infección sigue sin estar claro. Un brote de la enfermedad que afectó a más de 300 residentes en un bloque de apartamentos de gran altura (Amoy Gardens) en Hong Kong no pudo explicarse por la transmisión por gotitas respiratorias de pacientes infectados . El virus infeccioso es detectable en las heces , y se cree que la aerosolización del virus en las heces contaminadas es el modo de transmisión de este brote .

Nosotros y otros hemos informado de que la infectividad del CoV del SARS (coronavirus del SARS) se perdía después de calentar a 56°C durante 15 minutos, pero que era estable durante al menos 2 días después de secarse en plástico. Fue completamente inactivado por los fijadores comunes utilizados en el laboratorio. Otro estudio demostró que era inactivado por la luz ultravioleta y las condiciones alcalinas () o ácidas () . Se ha demostrado que los coronavirus humanos sobreviven en PBS o en un medio de cultivo con un 5-10% de FCS durante varios días, pero sólo sobreviven unas horas después de la desecación . Hay algunos estudios que informan de una asociación entre el brote de SARS, los factores metrológicos y la contaminación atmosférica . Así pues, la información sobre la supervivencia del coronavirus del SRAS (SCoV) en el medio ambiente en diferentes condiciones de temperatura y humedad es de gran interés para comprender la transmisión del virus. Un estudio reciente en el que se han utilizado coronavirus sustitutivos (el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) y el virus de la hepatitis de ratón (MHC)) ha investigado el efecto de la temperatura y la humedad relativa del aire en la supervivencia de los coronavirus en la superficie . Los efectos de supervivencia de estos factores ambientales sobre el coronavirus del SRAS siguen sin estar claros. En el presente estudio, informamos de la estabilidad del coronavirus del SRAS a diferentes temperaturas y humedad relativa.

2. Material y métodos

2.1. Cepa del virus y línea celular

La cepa del CoV del SARS utilizada en este estudio es la HKU39849. Las células de riñón de mono fetal (FRhK-4) se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM, Gibco, EE.UU.) con un 10% de suero de ternera fetal y penicilina y estreptomicina (Gibco, EE.UU.) a 37 °C en un 5% de CO2 y se utilizaron para el cultivo de virus madre y para la valoración de la infectividad viral .

2.2. Preparación del virus stock

El virus stock se cosechó cuando la infección de aproximadamente el 75% de la monocapa de células de un matraz infectado con el virus manifestó el efecto citopático (CPE). Las células infectadas se sometieron a un ciclo de congelación y descongelación y se centrifugaron a 2.000 rpm durante 20 minutos para eliminar los restos celulares y el sobrenadante del cultivo se alicuotó y se almacenó a -80°C hasta su uso. Determinación de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos (50%) (TCID50)

Las placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 100 μL de FRhK-4 confluentes se infectaron con 100 μL de diluciones seriadas de 10 veces del virus madre en medio esencial mínimo con 1% de FCS (medio de mantenimiento) empezando por 10-1 hasta 108. Las titulaciones se hicieron por cuadruplicado. Las células infectadas se incubaron durante 4 días a 37°C. La aparición de CPE se registró diariamente. La DICT50 se determinó según Reed y el método de Muench .

2.4. Efecto del secado, el calor y la humedad relativa

Diez microlitros de medio de mantenimiento que contenían 107 DICT50 por mL de virus se colocaron en pocillos individuales de una placa de plástico de 24 pocillos y se dejaron secar a temperatura ambiente (22~25°C) y con una humedad relativa del 40-50% (es decir, las condiciones que prevalecen en una habitación típica con aire acondicionado). Se utilizaron cien microlitros de MM para resuspender el virus a las 0 h, 3 h, 7 h, 11 h, 13 h, 24 h y hasta 4 semanas y se valoró la infectividad residual del virus. Cada vez se incluyeron controles en un tubo eppendorf con tapón de rosca cerrado y se trataron de forma similar pero sin secado.

El experimento se repitió a diferentes temperaturas (38°C, 33°C, 28°C) y humedades relativas (>95%, 80~89%) durante 3 h, 7 h, 11 h, 13 h y 24 h. Se utilizó un nebulizador en condiciones controladas para generar un entorno de alta y baja humedad relativa. Todos los experimentos anteriores se realizaron por duplicado y se valoró la infectividad viral residual.

2.5. Ensayo de infectividad

La infectividad del virus residual se valoró por cuadruplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 100 μL de células FRhK-4 confluentes. Se añadieron 100 μL de diluciones seriadas de 10 veces el virus en medio de mantenimiento empezando por 10-1 hasta 108 en células FRhK-4. Las células infectadas se incubaron a 37°C durante 4 días. La aparición de CPE se registró diariamente. La DICT50 se determinó según el método de Reed y Muench .

3. Resultados

Diez microlitros de 107 TCID50 por mL de virus se colocaron en pocillos individuales de una placa de plástico de 24 pocillos (que representa una superficie no porosa) y se secaron. A continuación, el virus seco se incubó a diferentes temperaturas (38°C, 33°C, 28°C) y a diferentes humedades relativas (>95%, 80~89%) durante 3 h, 7 h, 11 h, 13 h y 24 h y se valoró la infectividad viral residual. Se llevó a cabo un experimento similar a temperatura ambiente y con una humedad relativa de alrededor del 40-50% (sala climatizada) durante un máximo de 4 semanas. El virus secado en plástico conservó su viabilidad hasta 5 días a 22~25°C con una humedad relativa del 40~50%, con sólo una pérdida de título (Figura 1). Después, la infectividad del virus se pierde gradualmente cada vez. La pérdida de infectividad del virus en solución fue en general similar a la del virus seco en estas condiciones ambientales. Esto indica que el CoV del SRAS es un virus estable que puede transmitirse potencialmente por contacto indirecto o por fómites, especialmente en entornos con aire acondicionado.

Figura 1

Infectividad residual del virus a 22-25°C con una humedad relativa del 40-50% (título inicial 105/10 μL) y a 33°C o 38°C con una humedad relativa >95%.

La alta humedad relativa (>95%) a temperaturas comparativamente bajas (28°C y 33°C) no afectó significativamente a la infectividad del virus (Figura 2(a)). Una temperatura elevada (38°C) con una humedad relativa del 80-90% provocó una pérdida de título de 0,25~2 a las 24 horas (Figura 2(b)). Sin embargo, si el virus desecado se almacenaba a alta temperatura (38°C) y alta humedad relativa (>95%), se producía una pérdida adicional de ~1,5 del título en cada punto de tiempo hasta las 24 horas (0,38~3,38 ) en comparación con la alta temperatura (38°C) a una humedad relativa inferior del 80-90% (Figuras 3(a)-3(c)).

(a)

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Figura 3

Infectividad del coronavirus del SRAS (título inicial 105/10 μL) a diferentes humedades relativas a (a) 38°C, (b) 33°C, y (c) 28°C.

4. Discusión

Los virus no se replican fuera de la célula viva, pero el virus infeccioso puede persistir en superficies ambientales contaminadas y la duración de la persistencia del virus viable se ve afectada notablemente por la temperatura y la humedad. Se sabe que las superficies contaminadas son vectores importantes en la transmisión de infecciones en el entorno hospitalario y en la comunidad. El papel de los fómites en la transmisión del VRS está claramente demostrado. Se ha estudiado la supervivencia de los virus en una variedad de fómites para los virus de la gripe, los paramixovirus, los poxvirus y los retrovirus. Se ha informado de que el coronavirus humano asociado al resfriado común sólo permanece viable durante 3 horas en superficies ambientales después de secarse, aunque sigue siendo viable durante muchos días en suspensión líquida . Los virus de la parainfluenza y el VRS fueron viables tras secarse en superficies durante 2 y 6 horas, respectivamente . En forma de aerosol, el coronavirus humano 229E suele ser menos estable en condiciones de alta humedad. La estabilidad ambiental del SCoV era desconocida hasta ahora y esta información es claramente importante para comprender los mecanismos de transmisión de este virus en un entorno hospitalario y comunitario.

En el presente estudio, hemos demostrado que el CoV del SARS puede sobrevivir al menos dos semanas después de secarse en condiciones de temperatura y humedad encontradas en un entorno con aire acondicionado. El virus es estable durante 3 semanas a temperatura ambiente en un entorno líquido, pero se mata fácilmente por calor a 56°C durante 15 minutos . Esto indica que el CoV del SARS es un virus estable que puede transmitirse potencialmente por contacto indirecto o fómites. Estos resultados pueden indicar que las superficies contaminadas pueden desempeñar un papel importante en la transmisión de la infección en el hospital y la comunidad.

Nuestros estudios indican que el SCoV es relativamente más estable que los coronavirus humanos 229E u OC43 y algunos otros patógenos respiratorios virales como el virus sincitial respiratorio. Estos resultados sugieren que, si bien la transmisión directa por gotitas es una vía importante de transmisión, el papel de los fómites y la contaminación ambiental en la transmisión del virus puede desempeñar un papel significativo en la transmisión del virus. En particular, los fómites pueden contribuir a la transmisión continuada de la infección en el entorno nosocomial que sigue produciéndose a pesar de la gran atención y las estrictas precauciones tomadas para prevenir la propagación por gotas. Además de las precauciones contra las gotas, es necesario reforzar las precauciones de contacto y el lavado de manos.

La contaminación fecal del coronavirus SCoV puede ser, por tanto, una vía eficaz de transmisión de la enfermedad. El brote de Amoy Garden en Hong Kong, que afectó a más de 300 residentes en un bloque de apartamentos, se cree que se transmitió por aguas residuales contaminadas. La estabilidad del virus en las superficies ambientales y su presencia en las heces indica la posibilidad de que la contaminación fecal de la producción de alimentos frescos pueda suponer una amenaza para la transmisión del virus; especialmente en países con sistemas deficientes de saneamiento y eliminación de aguas residuales, y que es necesario realizar estudios para abordar esta posibilidad.

En este estudio, demostramos que una temperatura elevada con una humedad relativa alta tiene un efecto sinérgico en la inactivación de la viabilidad del CoV del SARS, mientras que las temperaturas más bajas y la baja humedad favorecen la supervivencia prolongada del virus en las superficies contaminadas. Así pues, las condiciones ambientales de países como Malasia, Indonesia y Tailandia no favorecen la supervivencia prolongada del virus. En países como Singapur y Hong Kong, donde hay un uso intensivo del aire acondicionado, la transmisión se produjo en gran medida en entornos bien climatizados, como hospitales u hoteles. Además, otro estudio ha demostrado que, durante la epidemia, el riesgo de aumento de la incidencia diaria del SRAS fue 18,18 veces mayor en los días con una temperatura del aire más baja que en los días con una temperatura más alta en Hong Kong y otras regiones. En conjunto, estas observaciones pueden explicar por qué algunos países asiáticos de la zona tropical (con alta temperatura y alta humedad relativa), como Malasia, Indonesia y Tailandia, no tuvieron brotes nosocomiales de SRAS (cuadros 1 y 2(a)-2(c)). También puede explicar por qué Singapur, que también se encuentra en una zona tropical (cuadro 2(d)), tuvo la mayoría de sus brotes de SRAS en hospitales (entorno con aire acondicionado). Curiosamente, durante el brote de SRAS en Guangzhou, los médicos mantuvieron las ventanas de las habitaciones de los pacientes abiertas y bien ventiladas, lo que puede haber reducido la supervivencia del virus y la transmisión nosocomial. El CoV del SRAS puede retener su infectividad hasta 2 semanas en un entorno de baja temperatura y baja humedad, lo que podría facilitar la transmisión del virus en la comunidad como en Hong Kong, que se encuentra en una zona subtropical (Tabla 2(e)). También hay que tener en cuenta otros factores ambientales, como la velocidad del viento, la luz solar diaria y la presión atmosférica, que han demostrado estar asociados a la epidemia de SRAS. La dinámica de la epidemia de SRAS implica múltiples factores, como las propiedades físicas del virus, el entorno exterior e interior, la higiene, el espacio y las predisposiciones genéticas. Comprender la estabilidad de los virus en diferentes condiciones de temperatura y humedad es importante para entender la transmisión de nuevos agentes infecciosos, incluido el de la reciente gripe apandémica H1N12009.