Justo cuando piensa que ha encontrado el fijador perfecto para su tejido, hay algo más que debe tener en cuenta – ¡su fijador puede haber enmascarado todos los sitios de antígeno a los que su encantador nuevo anticuerpo se iba a unir!
¿Ha enmascarado su antígeno?
Como mencioné en uno de mis artículos anteriores, la técnica de fijación que eligió suele crear enlaces cruzados dentro de las proteínas; ésta es una de las formas en que se estabiliza el tejido. Esto puede alterar la bioquímica de la proteína de manera que el antígeno de interés quede enmascarado y ya no sea reconocido por su anticuerpo primario.
No se preocupe – ¡la ayuda está al alcance de la mano!
El enmascaramiento del antígeno puede ser causado no sólo por la reticulación de los aminoácidos dentro del epítopo, sino también por la reticulación de péptidos no relacionados en o cerca de un epítopo, la alteración de la conformación de un epítopo o la alteración de la carga electrostática del antígeno. Dado que el reconocimiento antígeno-anticuerpo se basa en la estructura de la proteína, es importante intentar restaurar la estructura tridimensional natural. No se preocupe, hay una serie de técnicas disponibles para superar esto.
¡Retire su máscara!
Algunos anticuerpos no requieren ningún tipo de desenmascaramiento, pero si el suyo lo requiere, no se asuste, es sólo un breve añadido a su protocolo habitual. El término recuperación de antígeno se refiere a cualquier técnica en la que se invierte el enmascaramiento de un epítopo y se restablece la unión epítopo-anticuerpo. El tipo de recuperación de antígeno depende de muchas variables que incluyen el antígeno objetivo, el anticuerpo utilizado, el tipo de tejido y el método de fijación utilizado para preservar su tejido. Por ejemplo, si está utilizando un anticuerpo policlonal, que reconoce múltiples epítopos, es menos probable que requiera la recuperación del antígeno, pero también es probable que tenga un poco más de fondo. Si ha utilizado una técnica de fijación como el etanol, no se recomienda la recuperación de antígeno, ya que la fijación puede no ser lo suficientemente fuerte como para manejar las condiciones de recuperación.
Calor o enzimas – usted elige
Hay múltiples técnicas para restaurar la inmunorreactividad de un epítopo y éstas generalmente se dividen en dos categorías principales; (a) recuperación de antígeno inducida por enzimas y (b) recuperación de antígeno inducida por calor. Además, dentro de cada categoría hay diferentes formas de realizar la recuperación.
Métodos inducidos por enzimas
En los métodos inducidos por enzimas, se pueden utilizar enzimas como la proteinasa K, la tripsina y la pepsina para restaurar la unión de un anticuerpo a su epítopo. Se cree que el mecanismo de acción es la escisión de péptidos que pueden estar enmascarando el epítopo. Los principales métodos inducidos por enzimas, que requieren una incubación de 10 a 20 minutos a 37 °C, son:
- Proteinasa K (20 g/ml en tampón TE, pH 8)
- Tripsina (0,5% en dH20)
- Pepsina (0,1% en HCl 10 mM)
- Pronasa (0,5 o 0.1% en dH20)
- Proteasa (0,5% en dH20)
Dependiendo del método que se elija, cada uno debe ser optimizado para diferentes tipos de tejidos y anticuerpos, pero cada uno de estos métodos encaja antes del bloqueo y después de los pasos de desparafinado. Las desventajas de estos métodos son la baja tasa de éxito para restaurar la inmunorreactividad y la posibilidad de destruir tanto la morfología del tejido como el antígeno de interés.
Si considera que el método inducido por enzimas es demasiado duro, o que simplemente no le funciona, puede probar el método inducido por calor. Se cree que este método invierte algunos enlaces cruzados y permite restaurar la estructura secundaria o terciaria del epítopo. Es, en esencia, una renaturalización de la estructura de las proteínas fijadas a través de una serie de cambios conformacionales.
Métodos inducidos por calor
Esto puede incluir la posible hidrólisis (ruptura) de los enlaces cruzados inducidos por la formalina con todo el proceso impulsado por la energía térmica de la fuente de calor. Al igual que los métodos inducidos por enzimas, los métodos inducidos por calor requieren una optimización. Estos métodos, que requieren de 10 a 40 minutos en un vaporizador, microondas (incrementos de cinco minutos) o baño de agua a 95-100°C, seguidos de 20 minutos de enfriamiento a temperatura ambiente son:
- Tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6)
- Tampón de citrato-EDTA (10 mM de citrato de sodio, 2 mM de EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9)
- Glicina-EDTA (50 mM Glicina-HCl, 0.01% EDTA, pH 3.5)
En general, los métodos inducidos por calor son más utilizados, probablemente porque tienen más éxito. Si está empezando a recuperar antígenos, un buen lugar para empezar sería el método probado de recuperación con tampón de citrato. Por supuesto, si no funciona, tiene mucho que probar después.
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