Juuri kun luulet löytäneesi täydellisen fiksatiivin kudoksellesi, on otettava huomioon jotakin muuta – fiksatiivisi on saattanut juuri peittää kaikki antigeenipaikat, joihin ihana uusi vasta-aineesi aikoi sitoutua!
Oletko juuri peittänyt antigeenisi?
Kuten mainitsin eräässä aiemmassa artikkelissani, valitsemasi fiksointitekniikka luo yleensä proteiineihin ristisidoksia; tämä on yksi keino, jolla kudos vakautetaan. Tämä voi muuttaa proteiinin biokemiaa siten, että kiinnostava antigeeni peittyy eikä primäärivasta-aineesi enää tunnista sitä.
Ei hätää – apu on käsillä!
Antigeenin peittyminen voi johtua paitsi epitoopin sisällä olevien aminohappojen ristisilloittumisesta myös epitoopin kohdalla tai sen läheisyydessä sijaitsevien toisiinsa liittymättömien peptidien ristisilloittumisesta, epitoopin konformaation muuttumisesta tai antigeenin sähköstaattisen varauksen muuttumisesta. Koska antigeenin ja vasta-aineen tunnistaminen perustuu proteiinin rakenteeseen, on tärkeää pyrkiä palauttamaan luonnollinen kolmiulotteinen rakenne. Älä huoli- on olemassa useita tekniikoita, joilla tämä voidaan ohittaa.
Poista maski!
Jotkut vasta-aineet eivät vaadi minkäänlaista maskin poistoa, mutta jos sinun vasta-aineesi vaatii, älä hätäänny- se on vain lyhyt lisäys tavalliseen protokollaasi. Termi antigeenin talteenotto viittaa mihin tahansa tekniikkaan, jossa epitoopin peittäminen kumotaan ja epitoopin ja vasta-aineen sitoutuminen palautetaan. Antigeenin talteenoton tyyppi riippuu monista muuttujista, kuten kohdeantigeenistä, käytetystä vasta-aineesta, kudostyypistä ja kudoksen säilyttämiseen käytetystä kiinnitysmenetelmästä. Jos käytät esimerkiksi polyklonaalista vasta-ainetta, joka tunnistaa useita epitooppeja, on epätodennäköisempää, että se vaatii antigeenin talteenottoa, mutta sillä on myös todennäköisesti hieman ylimääräistä taustaa. Jos olet käyttänyt fiksaatiotekniikkaa, kuten etanolia, antigeenin talteenottoa ei suositella, koska fiksaatio ei ehkä ole tarpeeksi vahva kestämään talteenotto-olosuhteita.
Lämpöä tai entsyymejä- sinä valitset
Epitopin immunoreaktiivisuuden palauttamiseksi on useita tekniikoita, ja ne jakautuvat yleensä kahteen pääluokkaan; a) entsyymin aikaansaama antigeenin talteenotto (enzyme-induced antigeen retrieval) ja b) lämpöaiheinen antigeenin talteenotto. Kummankin kategorian sisällä on myös useita erilaisia tapoja palauttaa antigeeni.
entsyymi-indusoidut menetelmät
Entsyymi-indusoiduissa menetelmissä voidaan käyttää entsyymejä, kuten proteinaasi K:ta, trypsiiniä ja pepsiiniä, palauttamaan vasta-aineen sitoutuminen sen epitooppiin. Vaikutusmekanismina pidetään sellaisten peptidien pilkkomista, jotka saattavat peittää epitoopin. Tärkeimmät entsyymimenetelmät, jotka vaativat 10-20 minuutin inkubaation 37?C:ssa, ovat:
- Proteinaasi K (20 g/ml TE-puskurissa, pH 8)
- trypsiini (0,5 % dH20:ssä)
- pepsiini (0,1 % 10 mM HCl:ssä)
- pronaasi (0,5 tai 0,5 % 10 mM HCl:ssä)
- pronaasi (0,5 tai 0.1 % dH20:ssa)
- Proteaasi (0,5 % dH20:ssa)
Riippuen siitä, kumman menetelmän valitset, kukin on optimoitava eri kudostyypeille ja vasta-aineille, mutta kukin näistä menetelmistä mahtuu kortteliin ennen estoa ja vahanpoistovaiheiden jälkeen. Näiden menetelmien haittapuolina ovat immunoreaktiivisuuden palauttamisen heikko onnistumisprosentti ja mahdollisuus tuhota sekä kudosmorfologia että kiinnostuksen kohteena oleva antigeeni.
Jos entsyymi-indusoitu tapa on mielestäsi hieman liian ankara tai se ei yksinkertaisesti toimi sinulle, voit kokeilla lämpöindusoitua menetelmää. Tämän menetelmän uskotaan kumoavan joitakin ristisidoksia ja mahdollistavan epitoopin sekundaarisen tai tertiäärisen rakenteen palauttamisen. Kyseessä on pohjimmiltaan kiinteiden proteiinien rakenteen uudelleenkyllästäminen konformaatiomuutosten sarjan kautta.
Lämpöindusoidut menetelmät
Tämä voi sisältää formaliinin aiheuttamien ristisidosten mahdollisen hydrolyysin (katkaisun), ja koko prosessia ohjaa lämmönlähteestä peräisin oleva lämpöenergia. Kuten entsyymi-indusoidut menetelmät, myös lämpöindusoidut menetelmät vaativat optimointia. Nämä menetelmät, jotka vaativat 10-40 minuuttia höyrystimessä, mikroaaltouunissa (viiden minuutin jaksoissa) tai vesihauteessa 95-100 °C:n lämpötilassa ja sen jälkeen 20 minuutin jäähdytyksen huoneenlämmössä, ovat:
- Sitraattipuskuri (10 mM natriumsitraattia, 0,05 % Tween 20, pH 6)
- Sitraatti-Edta-puskuri (10 mM natriumsitraattia, 2 mM EDTA:ta, 0.05 % Tween 20, pH 6.2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 9)
- Glysiini-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.01 % EDTA, pH 3,5)
Yleisesti lämpöindusoidut menetelmät ovat laajemmin käytössä, luultavasti siksi, että ne ovat onnistuneempia. Jos olet vasta aloittamassa antigeenin talteenottoa, hyvä paikka aloittaa olisi kokeiltu ja testattu sitraattipuskuriretrieval-menetelmä. Tietenkin, jos se ei toimi, niin sinulla on paljon kokeiltavaa sen jälkeen.
Onko tästä ollut apua? Jaa sitten verkostollesi.